FACULTAD DE CIENCIAS

Departamento Académico de Biología, Microbiología y Biotecnología

ALUMNO: ..................................................................................................................................... CICLO: III

SEMANA: 7 PROFESOR: Mg. Biólogo. José David Medina Moreno FECHA: 09 /06/2017
EAP: INGENIERIA AGRONOMA ASIGNATURA: BIOQUIMICA
Practica N° 05
01UNIDAD
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA ALFA AMILASA VEGETAL

I. INTRODUCCION
Las enzimas son biocatalizadores de naturaleza proteica cuya función es acelerar las
reacciones químicas llevándolas más rápidamente a su posición de equilibrio. Pertenecen
al grupo de las proteínas globulares cuyos pesos moleculares oscilan entre 10 4 y 106
daltons; pueden consistir de una sola o de varias cadenas polipeptídicas, y contener también
partes no proteicas.

En una reacción bioquímica catalizada por enzimas, a medida que progresa la reacción se
incrementa la concentración de los productos a expensas de la desaparición de los
correspondientes sustratos, en tanto que pertenece fija la concentración de la enzima. De esto
podemos deducir que si se desea medir la actividad de una enzima puede hacerse controlando
el sustrato no transformado (sustrato residual) o controlando los productos liberados. También
puede medirse la modificación de los factores, en el caso de enzimas que requieren estas
sustancias.

La actividad catalítica se expresa en términos de unidades de actividad, y para ello la

Comisión de Enzimas para la Unión Internacional de Bioquímica sugirió que "Una unidad
(u) de cualquier enzima se define como la cantidad que catalizará la transformación de un
micromol de sustrato por minuto bajo condiciones definidas de pH y temperatura".
En la práctica se estudiará la actividad de una amilasa de origen vegetal, midiendo el
sustrato residual. Asimismo, se medirá su actividad específica, que viene a constituir un
criterio de pureza, y se define como "el número de unidades de enzima por mg de proteína.
II.OBJETIVOS
2.1. Determinar la actividad enzimática de una amilasa, extraída de trigo germinado,
dosando almidón residual.
2.2. Determinar la actividad específica de la amilasa vegetal

III. LA ENZIMA AMILAZA VEGETAL

Qué es?

La α-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradación
del almidón, que es un polisacárido de reserva vegetal.

Función

Presente en el proceso de la digestión de carbohidratos que comienza en la boca y continúa en el

intestino delgado. Se produce principalmente en las glándulas salivales y el páncreas exocrino.

Medios óptimos para la producción de amilasa

Las amilasas necesitan normalmente una temperatura de 30-39 ºC, una concentración de 0,5 %
peso/volumen [108] y un pH neutro de 6,5 a 7,5. No obstante, encontramos diferencias dependiendo
del origen de la enzima. Por ejemplo la amilasa derivada de A. oryzae necesita un pH de 5 a 7
mientras que la extraída de la cebada su pH varía de 4,7 a 5,8. Por otro lado, es importante saber
que las amilasas necesitan en general iones de calcio para tener una actividad enzimática correcta.

IV. ALMIDON

El almidón es un polímero semicristalino de glucosa de gran abundancia en la naturaleza. La

cantidad de almidón contenido en el grano de cereal varia, pero generalmente oscila entre el 60 y 75
% del peso del grano. El almidón presente en los granos es el más importante de los carbohidratos
para fines industriales resultando preciso degradarlo enzimáticamente con una gelatinización previa
por acción de calor o sometiéndolo a un intenso trabajo mecánico.

El almidón está formado por dos tipos de moléculas: la amilosa y la amilopectina, ambos
polisacáridos de glucosa. La amilosa se conforma por cadenas lineales de glucosas unidas por
enlaces α- C1-C4, mientras que la amilopectina tiene, además de estos últimos enlaces, uniones C1
con C6, formando cadenas ramificadas. La α-amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la amilasa
como en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacáridos) como productos.
III. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS

3.1 EQUIPOS

3.1.1 Estufa

3.1.2 Espectrofotómetro

3.2 MATERIALES Y REACTIVO PROPORCIONA DO POR EL ALUMNO

3.2.1 Semillas germinadas de trigo
3.2.2 Semillas germinadas de cebada

PROPORCIONADO POR EL LABORATORIO

3.2.3 Solución de almidón 0.1%
3.2.4 Ácido clorhídrico 0.5N
3.2.5 Lugol
3.2.6 Reactivo de Biuret
3.2.7 Tubos de ensayo
3.2.8 Embudos
3.2.9 Mortero
3.2.10 Pipetas de 1, 5 y 10 ml

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

4.1 EXTRACCION DE LA AMILASA
4.1.1. Poner a germinar 3 días, 50 semillas
4.1.2. Triturar las semillas cuando las raicillas tenga 0.5 cm de largo, adicionando 10 ml de buffer +
cloruro de calcio.
4.1.3. Filtrar en gasa
4.2 DEMOSTRACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
4.2.1 Armar el siguiente sistema:

Almidón inicial Almidón residual

TUBOS (ml) I II III IV
Sustrato 1.0 1.0 1.0 1.0
 Dejar en incubación a 30 ° C durante 5 minutos
Extracto crudo de enzima --- 0.1 0.2 0.3
Mezclar e incubar a 30 ° C durante15 minutos exactos
Ácido clorhídrico 0.5 N 1.0 1.0 1.0 1.0
Dejar en reposo por 5 minutos a temperatura ambiente
Agua destilada 9.9 9.8 9.7 9.6
Lugol 0.5 0.5 0.5 0.5

4.2.2 Mezclar, medir las absorbancias después de 5 minutos a 620 nm

4.2.3 Anotar las absorbancias de los 4 tubos de prueba.

4.3 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA

4.3.1 Determinar el contenido proteico del extracto crudo de la enzima con el reactivo de Biuret de acuerdo
al siguiente esquema:

TUBOS (ml) I II III IV

Preparado enzimático --- 0.2 0.1 0.05
Agua destilada 1.0 0.8 0.9 0.95
Reactivo de Biuret 4.0 4.0 4.0 4.0
4.3.2 Mezclar e incubar a 37 °C durante 30 minutos
4.3.3 Realizar las lecturas de absorbancia a 540 nm calibrando a cero con el tubo N° 1

V. DATOS EXPERIMENTALES
5.1. Determinación de la actividad enzimática

N° TUBO ABSORBANCIA (….. nm)

I
II
III
IV

5.2. Determinación de la actividad específica

N° TUBO ABSORBANCIA (….. nm)

I
II
III
IV

VI. CALCULOS, RESULTADOS Y DISCUSION

6.1. Determinar la concentración del almidón (mg/ml), multiplicando absorbancia por factor de
calibración. Obtener el promedio de los tubos II, III, y IV.
6.2. Calcular las unidades de enzima (U) de la siguiente forma:

6.3. Determinar mg de proteína/ml = Absorbancia X Factor

6.4. Obtener el promedio de los tubos II, III, IV, y determinar la Actividad Específica (AE) de la siguiente
manera:

6.5. Realizar un flujograma de la obtención de la amilasa.

DISCUCIONES

Al adicionarle lugol a los 4 tubos de ensayo se espera poder determinarla presencia de

polisacáridos, si se observa que los tubos se ponen color azul hay presencia de almidón, pero si
se pone de color amarillo intenso quiere decir que es todo lo contrario. El alfa-amilasa se
encuentra ampliamente distribuida en el reino vegetal, particularmente en la semillas con
reservas de hidratos de carbono como el trigo, la cebada, de donde ha sido posible aislarla en
forma pura. La amilasa es una de las enzimas mas estudiadas debido a su rol de degradación
del almidón, ya que permite una germinación de las semillas, el cual es
degradado por los enlaces 1-4 del interior(endo amilasa) en diferentes dextrinas, que
debido a su disminución en tamaño puede ser hidrolizada por la B-amilasa, sin embargo la α-
amilasa es una enzima que se encuentra regulada tanto por hormonas, odiferentes
factores, ta les como la temperatura y el pH, además posee unpeso molecular de 50 Kda aproximadamente.

CONCLUSIONES

Concluida la práctica nos damos con la sorpresa que a una mayor absorbancia depende de
mayor cantidad de enzima añadida al tubo de ensayo junto concierta cantidad de lugol
(4ml) ya que el lugol nos indica la presencia de almidon, con ayuda del
espectrofotómetro esto se pudo comprobar. La amilasa es una de las enzimas mas estudiadas
debido a su rol de degradación del almidón
La actividad de la amilasa vegetal contenida en la cebada se puede medir también en el
espectrofotómetro donde nos podemos fijar que a mayor preparado enzimatico junto
con los 4 ml de reactivo de Biuret la absorbancia es menor

VII. CONCLUSIONES
7.1. Anotar sus conclusiones de la práctica

VIII. CUESTIONARIO
8.1. En la síntesis de arginina a partir de ácido glutámico se observaron las siguientes
reacciones:
1 2 3 4
Glu - N ac. Glu - Orn - Cit - Arg

Siendo 1, 2, 3, 4 enzimas.
Indica ¿ C uáles son los sustratos y productos correspondientes para estas enzimas
mediante un cuadro
8.2. ¿Por qué se sometieron las raicillas del cereal a un proceso físico y químico en el
proceso de extracción?
8.3. Si se te da una solución que supuestamente contiene una enzima, ¿ Cómo
determinarías en la solución la presencia de una enzima que cataliza la hidrólisis del
almidón?
8.4. Represente mediante un flujograma el proceso de extracción de una amilasa de una
fuente diferente a la utilizada en práctica
8.5. ¿Cómo se puede incrementar la actividad específica de una enzima?

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRAF ICAS

9.1. Horna, E. 1988. Enzimas. Módulo 03 de Bioquímica. Universidad Nacional del

Santa. Chimbote -Perú.
 9.2. Villavicencio, M. 1993. Bioquímica. Tomo I. Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología. Lima -Perú.

CUESTIONARIO
1.- En la síntesis de arginina a partir de acido glutámico seobservaron las
siguientes reacciones Glu ------ N ac. Glu ------ Orn ------ Cit ------ Arg Siendo 1, 2, 3,4 enzimas
Indica cuales son los sustratos y productos correspondientes paraestas enzimas mediante un
cuadro.

2.-Por que se sometieron las raicillas del cereal a un proceso físicoy químico en el proceso de
extracción?

El proceso de extracción se basa en la obtención de amilasa, por lo que es necesario que las
raicillas de los cereales sufran un proceso físico donde se van a fragmentar en pedazos más
pequeños con la ayuda de un mortero pero aun a sísiguen conservando su naturaleza, luego se da el
proceso químico donde se va a filtrar la parte liquida que seria la amilasa de las semillas con la
ayuda de una gasa ,luego a este extracto se le van agregando una seria de reactivos lo cual
permitirán transformarla en un preparado enzimático para posteriormente utilizarla en diferentes
pruebas.

3.- Si se te da una solución que supuestamente contiene unaenzima, ¿Cómo

determinarías en la solución la presencia de unaenzima que cataliza la hidrolisis de almidón?

Para determinar la presencia de una enzima en una solución y a la vez observar que cataliza la
hidrolisis de almidón solo se podría lograr através de una vía ,la cual consiste en agregar reactivos
que permitan evidenciar tal presencia como es el caso del lugol , además porque mientras el
color de la mezcla sea mas intenso significa que la actividad enzimática que ejerce la amilasa
sobre el almidón será un poco mas baja ,además también la podemos notar ya que en
la solución se va a observar la formación de anillos en la parte superior de dicho liquido o
sustancia

.4.- Represente mediante un flujo grama el proceso de extracción de una amilasa de una
fuente diferente a la utilizada en práctica.

5.- Como se puede incrementar la actividad específica de una enzima? La actividad específica
de las enzimas se calcula dividiendo la actividad enzimática (por ejemplo; U/mL) entre
la concentración de proteínas (mg/mL).

El resultado final indica la cantidad de enzima por milígramos de proteínas presente. Se

supone que si purificas la enzima normalmente la actividad específica de la misma debe
aumentar, ya que la proporción de enzima del total de las proteínas presentes debe
también irse incrementando. A veces es tono ocurre. En ese caso debe revisar el
procedimiento otra vez ya que algo puede estar saliendo mal. Por ejemplo que se
desnaturalice la enzima en el proceso de purificación por empleo de algún solvente o pH o
fuerza iónica inadecuada. También debe tener en cuenta si la proteína en milimétrica,
ya que la pérdida de una sub unidad puede reducir significativamente su actividad.