Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
sebagai second messengers. Namun, mempelajari peran ROS dalam redoks fisiologis sinyal
terhambat oleh kesulitan teknis dalam mengendalikan generasi mereka di dalam sel. Di sini, kita
memanfaatkan dua komponen inert, fotosensitizer dan cahaya, hingga memanipulasi dengan
sempurna generasi ROS intraseluler dan memeriksa peran spesifik mereka dalam mengaktifkan
dendritic cells (DCs). Photoswitchable generation intraseluler ROS yang mudah dibawa dengan
cepat diinduksi mobilisasi sitosolik Ca2+, aktivasi diferensial mitogen-activated protein kinases,
dan translokasi nuklir dari NF-κB. Selain itu, lonjakan ROS intraseluler transien bisa terjadi
mengaktifkan DC belum matang ke dewasa dan dengan potensi meningkatkan migrasi in vitro dan
in vivo. Akhirnya, kami mengamati bahwa intraseluler ROS-stimulated DCs meningkatkan respons
sel T spesifik antigen secara in vitro dan in vivo, yang menyebabkan pertumbuhan tumor tertunda
dan kelangsungan hidup yang berkepanjangan pada tikus pembawa tumor saat diimunisasi dengan
antigen tumor spesifik. Karena itu, lonjakan ROS intraseluler sementara sendiri, jika dimanipulasi
dengan benar, dapat menyebabkan DC yang belum matang untuk berdiferensiasi menjadi keadaan
motil dan bentuk matang yang cukup memadai Mengawali respons sel T adaptif secara in vivo.
Reactive oxygen species (ROS), yang mencakup radikal oksigen reaktif bebas (misalnya, O2 • dan
OH-) dan oksidan nonradikal (misalnya H2O2), diproduksi selama respirasi mitokondria dan
respons seluler terhadap berbagai stimulasi seperti faktor pertumbuhan dan infeksi pathogen.
Meski kelebihan ROS menyebabkan stres oksidatif yang terjadi kerusakan makromolekul dan
berbagai penyakit termasuk kanker dan penuaan, peningkatan bukti menunjukkan bahwa ROS
juga berfungsi sebagai molekul sinyal penting dalam proliferasi sel, diferensiasi, dan kelangsungan
hidup.Secara khusus, ROS secara langsung terlibat dalam aktivasi berbagai jalur sinyal seluler,
seperti MAP kinase dan signaling cascades tirosin kinase melalui oksidasi residu sistein redoks-
sensitif protein target. Faktor transkripsi, termasuk AP-1 dan NF-κB, juga subjek pada regulasi
redoks dan menyebabkan banyak perubahan biologis, mulai dari merespons faktor pertumbuhan
untuk respon inflamasi. Jadi sekarang diterima secara luas bahwa ROS berfungsi sebagai second
messengers yang penting dari jalur pensinyalan intraselular.
Persinyalan ROS dihasilkan pada permukaan sel atau di dalam kompartemen intraselular oleh
beberapa oksidase NADPH di respon terhadap berbagai rangsangan dan kemudian masuk ke
dalam sitoplasma. Bukti terbaru menunjukkan bahwa ROS dapat disertakan secara khusus ke
dalam sel melalui plasma tertentu saluran aquaporin. Sebagai tambahan, generasi ROS
mitokondria telah hadir telah diatur dan diikutsertakan secara ketat pada sinyal sel fisiologis
dikaitkan dengan berbagai tekanan. Dalam sitoplasma, ROS intraselular berpotensi dimodifikasi
residu sistein lebih dari 500 protein, seperti yang diungkapkan oleh pendekatan proteomik skala
besar, sehingga mempengaruhi variasi proses biologis. Studi terbaru yang menyelidiki peran
biologi ROS intraselular, bagaimanapun, biasanya digunakan pendekatan teknis negatif
Kelemahan teknis penggunaan antioksidan kimia untuk mengais ROS termasuk tindakan
nonspesifik karena mereka memiliki beberapa target potensial diluar ROS.
Knockout tunggal gen dari enzim penghasil ROS juga ada keterbatasan karena ROS intraselular
dapat dihasilkan oleh banyak enzim yang merespons rangsangan spesifik. Penambahan eksogen
oksidan, seperti H2O2, ke sistem biologis dapat digunakan untuk memantau aktivasi ROS-
spesifik. Sejak waktu dan lokasi kimia ROS diatur dengan ketat dalam sistem kehidupan,
bagaimanapun, sulit untuk meniru sistem biologi melalui penambahan sederhana agen ROS atau
agen generating ROS. Mengingat kuantitas ROS bisa menentukan spesifisitas dan fungsi, regulasi
ketat ROS dalam waktu dan lokasi sangat penting untuk partisipasi mereka dalam persinyalan sel
fisiologis. Sebelumnya, beberapa teknik menarik ada telah dikembangkan untuk menghasilkan
ROS intraseluler sesuai permintaan dan dengan cara yang terkontrol menggunakan cahaya dan
photosensitizer, peptida organel spesifik dengan fotosensitif, atau generator hidrogen peroksida
yang difotokopi. Mereka menunjukkan bahwa photogeneration dikontrol dengan tepat dari ROS
menginduksi aktivasi diferensial MAP kinase, ekspresi gen seluler, dan migrasi. Di sini, kami
menerapkan teknologi ini untuk menyelidiki peran spesifik ROS intraselular diregulasi fungsional
dendritic cells (DC), pengawal penting mengatur sistem imun bawaan dan adaptif.
ROS telah terlibat dalam berbagai aktivitas fisiologis DC: perkembangan mereka dari progenitor
hematopoietik sel, diferensiasi dari monosit, maturasi dan presentasi antigen setelah rangsangan
eksogen, dan migrasi seluler. Namun, sebagian besar studi ini, seperti yang disebutkan di atas,
gunakan pendekatan teknis tidak langsung dengan menggunakan ROS scavengers atau sistem gen
tunggal untuk memodulasi peran yang spesifik ROS dalam fungsi DC. Untuk menyelidiki apakah
ROS intraseluler saja dapat memodulasi aktivitas DC, kami memeriksa respon seluler dan
kemampuan DC untuk menginduksi respons sel T antigen spesifik setelah mengatur
photogeneration ROS intraselular.
METODE
Tikus dan Sel. C57BL/10NAGCSnAi-(KO) Tikus Rag2 (H-2b) (Taconic Farms), tikus transgenik
OT-II TCR (H-2b) (Jackson Laboratorium), dan tikus C57BL/6 (H-2b) (Orient Bio) ditempatkan
dan dipelihara di fasilitas bebas patogen spesifik di Seoul National Universitas (SNU) Fakultas
Kedokteran. Percobaan hewan adalah dilakukan setelah disetujui oleh SNU IACUC (izin ID:
SNU-090805-5). Tikus yang mengandung tumor dikorbankan secara manusiawi saat tumor
mencapai 2 cm Garis sel MC38/CEA/Luc yang mengekspresikan CEA manusia dan luciferase
kunang-kunang dibudidayakan dan dipelihara di rumah Dubecco Modifikasi Eagle Medium
(DMEM; Welgene) ditambah dengan 10% serum bovine janin yang tidak aktif dan (FBS) dan
antibiotik. DC dihasilkan dari sumsum tulang 6 - 12-minggu Rag2 knockout tikus dan dikultur
seperti yang dijelaskan sebelumnya. Singkatnya, sel sumsum tulang dibilas dari femur dan tibia
dengan Iscove bebas serum. dimodifikasi medium Eagle (IMDM; Gibco Invitrogen). Sel tunggal
Suspensi kemudian disaring melalui saringan sel nilon (70-μm Mesh nilon; Biosciences BD);
dicuci dua kali dengan IMDM lengkap dilengkapi dengan mouse rekombinan GM-CSF (1,5
ng/mL), mouse IL-4 (1,5 ng/mL; PeproTech), penisilin (100 unit/ml), streptomisin (100 μg/mL),
gentamisin (50 μg/mL), glutamin L-glutamin (2 mM), dan β-mercaptoethanol (50 nM; Gibco
Invitrogen); dan diunggulkan pada konsentrasi sel 1 × 106 per sumur di piring 24-sumur di volume
akhir 2 mL media IMDM lengkap. Setengah dari medium itu diganti setiap hari dengan volume
yang sama lengkap IMDM medium selama 6 hari. Kultur DC in vitro ini berasal dari tulang Sel
sumsum dianalisis dengan flow cytometry, yang menunjukkan ciri khas hasil 90-93% dari CD11c+
DCs.