Pós-Graduação

Faculdades Oswaldo Cruz

Microbiologia em

Cosméticos

Profa. Elda M. Cecílio Marcondes

1
 Sumário
1. Microbiologia básica ........................................................................................... 3

2. Laboratório Microbiológico ................................................................................ 6

3. Biossegurança no laboratório microbiológico .................................................... 9

4. Sanitizantes ....................................................................................................... 10

5. Avaliação da Qualidade Sanitária da Água na Indústria Cosmética ................. 14

6. Biofilme microbiano ......................................................................................... 20

7. Teste de Limite Microbiano .............................................................................. 21

8. Teste de eficácia de sistema conservante (“Challenge test”) ............................ 27

9. Exercícios .......................................................................................................... 37

10. PROCESSOS DE ESTERILIZAÇÃO ............................................................ 39

11. AULA PRÁTICA – ........................................................................................ 42

12. Referências Bibliografias ................................................................................ 46

2
 1. Microbiologia básica

Microbiologia é o estudo de estruturas tão pequenas que não podem ser visualizadas a
olho nu, tais como bactérias, vírus, fungos, protozoários e algas.

1.1 Bactérias
1.1.1 Morfologia

As células bacterianas (procariontes) são caracterizadas morfologicamente pelo seu

tamanho, forma, arranjo e estrutura. Geralmente apresentam diâmetro entre 0,2 a 2 m e
comprimento de 2 a 8m.

Em 1884 Hans Christian Gram descobriu a técnica de coloração capaz de separar

as bactérias em 2 grandes grupos: Gram + e Gram - . Atualmente este é o primeiro
passo para identificação das bactérias, uma vez que as células bacterianas são incolores
e de difícil visualização.

Esporos

São estruturas formadas sob condições de estresse bacteriano, com a função de

proteção, quando a célula se encontra em ambiente desfavorável, com falta de
nutrientes, baixa atividade de água e temperatura inadequada.

1.1.2 Crescimento bacteriano

O crescimento bacteriano depende de algumas condições ótimas de temperatura, pH,

atividade de água, respiração.

As bactérias podem ser classificadas em Psicrófilas (crescem a baixas temperaturas),

Mesófilas (temperaturas moderadas) e Termófilas (altas temperaturas).

O pH favorável ao crescimento das bactérias é próximo a neutralidade, entre 6,5 e

7,5 e para os Bolores e leveduras é entre 5 e 6, levemente mais ácido.

Atividade de água é a água livre necessária para a obtenção de nutrientes em

solução. As bactérias requerem de 80-90% de água.

Com relação a respiração os micro-organismos podem ser classificados em aeróbios,

isto é aqueles que utilizam a molécula de oxigênio; anaeróbios, aqueles incapazes de
utilizar o oxigênio, sendo mesmo destruído por ele; aeróbios facultativos que utilizam

3
oxigênio, mas podem em condições adversas realizar fermentação ou respiração
anaeróbia e os microaerófilos que necessitam de oxigênio em baixas concentrações.

Exemplos:

Anaeróbios - Clostridium sp

Aeróbios - Pseudomonas aeruginosa

Aeróbios facultativos - Escherichia coli

Microaerófilos- Helycobacter pylori

1.1.3 Estratégias de sobrevivência

São características morfológicas e processos fisiológicos através dos quais os

microrganismos reagem a mudanças ambientais desfavoráveis. Cápsulas
exopolissacarídeas, corantes, proteínas de estresse, uso de sideróforos e membranas
protéicas relacionadas são algumas dessas estratégias.

Os Encapsulados EPS (exopolissacarídeas) são formadas quando o micro-organismo

é submetido a condições de limpeza e sanitização inadequada de tanques, bombas,
equipamentos de envase e tubulações ou a falta de ferro.

Estas cápsulas auxiliam na adesão dos micro-organismos a superfície, melhorando

resistência a dessecação e atuando como uma reserva de nutrientes.

Os corantes têm como principal função proteger os micro-organismo da ação letal

de radicais livres e da radiação UV, produzindo um corante muito semelhante a
melanina humana. São formados sob pH desfavorável, na presença de ácidos graxos
livres e quando existem subprodutos tóxicos e limitação de nutrientes.

Sideróforos são pequenos queladores com alta afinidade pelo ferro, responsáveis por
atuar como agentes extracelulares solubilizadores de ferro, tornando-o disponível para a
célula. Alguns exemplos de micro-organismos que produzem estes sideroforos são
Escherichia coli, Klebsiella , Salmonella e Shighella.

Proteínas de choque são proteínas produzidas sob condições de estresse, de forma

rápida e transitória, que possibilitam a sobrevivência em condições que poderiam levar
a lesões irreversíveis e morte, como temperaturas extremas, pressão, pH, baixa atividade
de água e presença de agentes oxidantes.

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 Fenômeno Fênix trata-se de uma falha no protocolo de controle de qualidade, que
propicia condições adequadas para a recuperação de microrganismos viáveis que não
foram detectados nas verificações de rotina.

Existem três fases: fase de danos onde ocorre alteração do metabolismo celular
caracterizado por diminuição da contagem em placas. Fase de reparo onde se verifica
um aumento de contagem do valor inicial e fase de crescimento onde se evidencia maior
aumento do número de microrganismos detectados.

1.2 Fungos
São eucariontes, organismos cujas células têm um núcleo distinto contendo o
material genético (DNA) envolvido por uma membrana denominada membrana nuclear.
Podem ser uni ou pluricelular, aeróbios ou anaeróbios facultativos e o pH ótimo para o
crescimento é 5. Requerem baixa atividade de água e apresentam tamanho de 10-100m
de diâmetro.

São divididos em bolores e leveduras. Os bolores são pluricelulares, filamentosos

(hifas), que formam um Micélio (conjunto de hifas). Estas hifas podem ser vegetativas
ou aérea, sendo as vegetativas responsáveis pela obtenção de nutrientes e as aéreas pela
reprodução.

A identificação de bolores baseia-se em uma avaliação macroscópica (verso e

reverso) realizadas em colônias gigantes, onde se observa a presença de gotículas, cor,
aspecto pulverulento. Utiliza-se um atlas para comparação. Na avaliação microscópica
observam-se as hifas, hialinas ou não e os conidiosporos, dentre outras estruturas.

Leveduras são organismos unicelulares, esféricas ou ovais com 3-5m de diâmetro,

que crescem alta concentração de açúcar, não filamentosas, crescimento anaeróbio
facultativo ou aeróbio.

1.3 Microbiologia em cosméticos

Cosméticos são utilizados por razões estéticas e não devem acarretar riscos para a
saúde do consumidor. Em 1973 o CTFA (Cosmetic & Toiletries Fragrance Association)

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elaborou recomendações quanto ao número tolerável de microrganismos dependendo da
classificação do produto. Em 1997, iniciaram-se estudos de parâmetros microbiológicos
no Brasil, sendo finalmente instituída a resolução 481 em setembro de 1999. Esta
resolução determina a qualidade sanitária de produtos de higiene pessoal e cosméticos.

2. Laboratório Microbiológico

O laboratório de controle de qualidade microbiológico para atender as exigências

do mercado precisa atender a norma ISO 17025/2006. Esta norma apresenta os
requisitos necessários para que se opere num sistema de qualidade onde os ensaios
analíticos realizados são classificados como tecnicamente válidos.

A seguir abordaremos alguns tópicos relacionados diretamente com os ensaios

analíticos.

2.1 Pessoal
Com relação ao pessoal, deve-se elaborar organograma estabelecendo as devidas
responsabilidades, levando em consideração a qualificação técnica de cada colaborador.
Todas as documentações de aprovação, rejeição, relatórios devem ser assinadas e estas
assinaturas devem constar em formulário ou em livro de registros. Outro ponto
fundamental abordado são os treinamentos interno e externo realizados com a finalidade
de que os ensaios sejam executados adequadamente.

2.2 Instalações Físicas – Acomodações e Condições Ambientais

O laboratório deve assegurar que as acomodações e as condições ambientais estejam
adequadas de tal forma que os resultados analíticos obtidos sejam confiáveis. Elaborar
um programa de limpeza e sanitização para a área física empregando produtos
adequados. Realizar controles ambientais da área efetiva de ensaios. Todos os dados
obtidos devem ser registrados em formulários próprios.

A área de preparação e lavagem de materiais deve ser segregada da área de ensaios. As

bancadas devem ser de materiais não porosos e de fácil sanitização, de preferência, aço
inoxidável.

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Os lixos, quando presentes devem conter pedal, ser mantidos fechados e removidos
diariamente. Os cantos devem ser arredondados com a finalidade de evitar acúmulo de
poeira e o chão deve ser de material de fácil limpeza, sem emendas e de preferência não
deve conter ralos, caso contrário que seja sifonado.

Nas paredes, normalmente emprega-se pintura a base de poliuretano ou epóxi, e em

caso de presença de janelas as mesmas deverão ser vedadas. Os encanamentos
pertencentes às autoclaves devem ser de cobre para evitar a destruição das tubulações.

2.3 Segurança e Higiene

Medidas de segurança e higiene devem ser adotadas para que o trabalho desenvolvido
na rotina do laboratório de controle de qualidade microbiológico seja executado nas
melhores condições. Portanto, algumas normas gerais devem ser seguidas:

 proibir a entrada de pessoas que não estejam devidamente paramentadas;

 proibir o uso de adornos, maquiagem em geral;

 não comer, não fumar, não beber;

 trocar materiais de uso pessoal quando houver suspeita de comprometimento do

produto, manipulador ou área;

 desinfecção das bancadas antes e após o término do trabalho;

 todos os materiais deverão ser mantidos limpos, identificados e corretamente

armazenados.

2.4 Registro
Com relação às documentações, todos os procedimentos implantados deverão ser
registrados em formulários próprios. Os resultados dos ensaios analíticos devem ser
registrados e guardados por no mínimo 5 anos.

O livro de registros ou os formulários deverão conter todas as análises realizadas para as

amostras (matéria-prima, produto intermediário, granel, produto acabado, água, material
de acondicionamento, qualidade do ar, equipamentos, etc).

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Todos os registros deverão ser anotados a caneta e em caso de qualquer rasura, a mesma
deverá ser riscada, rubricada, datada e seguida da correção da informação.

Exemplo de informações a serem registradas:

 Identificação da amostra;
 Número do lote;
 Data de fabricação;
 Número da análise da amostra;
 Identificação do equipamento de produção;
 Resultados das análises de ambiente e do equipamento de produção.

Os registros de todas as informações são de suma importância para que haja condições
de realizar o processo de RASTREABILIDADE.

2.5 Equipamento
Os equipamentos são fatores preponderantes na segurança dos ensaios realizados. A
calibração deve ser realizada por empresas credenciadas à Rede Brasileira de Calibração
(RBC).

É interessante manter pastas individuais contendo o histórico, ou seja, ordem de

manutenção, inspeção, calibração, procedimento de operação, relatórios e certificação.

Todo o controle efetuado deverá ser arquivado, por exemplo, as leituras diárias como a
temperatura das estufas incubadoras ou ciclos de autoclavações.

Equipamentos que não estejam de acordo para o uso, deverão ser isolados ou
identificados claramente como fora de serviço para evitar sua utilização.

2.6 Meios de Cultura e Reagentes

Outro fator que pode interferir nos resultados analíticos são os meios de cultura que
englobam diluentes, ágar seletivo e não seletivo, entre outros. Todas as informações
referentes a estes materiais devem ser registradas, tais como pH, esterilidade, “growth
promotion” (capacidade de promover crescimento) e prazos de validade, quando for o
caso.

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Os controles realizados têm por objetivo evitar resultados falso-negativos ou falso-
positivos, que possam invalidar os resultados analíticos dos ensaios.

Todas as operações desenvolvidas no laboratório microbiológico deverão ser descritas

em Procedimento Operacional Padrão (POP), por exemplo, preparação de meios de
cultura, amostragem, diluição das amostras, manuseio de equipamentos,
encaminhamento da amostra para análise, etc.

A implantação dos procedimentos apresenta como importância a organização e a

padronização de todos os setores comprometidos com a qualidade dos serviços
prestados pela empresa.

3. Biossegurança no laboratório microbiológico

O principal objetivo da biossegurança é garantir a segurança das pessoas envolvidas,

diretamente e indiretamente com o laboratório microbiológico, de forma a evitar que
ocorram infecções, principalmente nos novos membros do laboratório e acidentes
dentro do laboratório, tais como contato de culturas microbianas com a pele lesada,
contaminação das vias digestivas, pela ingestão de alimentos e bebidas durante o
trabalho ou desinfecção insuficiente das mãos antes de alimentarem-se, infecções nas
vias respiratórias e mucosa nasal pela aspiração de partículas contaminadas e infecções
nos olhos e ouvidos pela desinfecção insuficiente das mãos.

Através do levantamento de riscos é possível a implantação de um programa de

biossegurança e estabelecimento de regras de segurança através de treinamento.

Para se evitar os acidentes e infecções envolvendo risco biológico devemos seguir os

procedimentos de segurança, tais como:

 Usar avental de mangas compridas com punho;

 O avental deve ser mantido separado dos demais objetos pessoais;

 O uso do avental é restrito ao laboratório;

 Uso de óculos de segurança;

 Assepsia adequada das mãos;

 Não fumar, não beber, não comer, não usar maquiagem;

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  Não preparar nenhum alimento ou bebida dentro do laboratório;

 Manter os materiais de consulta (livros, cadernos, anotações), quando não

estiverem sendo utilizados, fora da área do laboratório;

 Uso de máscaras, toucas e propés;

 Desinfecção da bancada antes e depois do uso;

 Evitar conversas desnecessárias;

 Não guardar alimentos e bebidas no refrigerador do laboratório.

4. Sanitizantes

Desinfetantes ou saneantes domissanitários com ação antimimicrobiana são produtos

destinados ao uso em objetos, sobre superfícies inanimadas, no lar, nas indústrias, nos
hospitais e estabelecimentos relacionados com o atendimento a saúde, em locais e
estabelecimentos públicos e privados. Seguem a Portaria n° 15 de 23/08/1988.

4.1 Classes de sanitizantes

Aldeídos: formaldeído, glioxal, glutaraldeído e -formaldeído.

Fenólicos: 4 terc-amilfenol, 2 benzil 4 clorofenol, 4 terc-butifenol, cresóis, 2 fenilfenol,

2 hidroxidifenileter e 2 hidróxi 2,4,4 triclorodifenileter

Quaternários de Amônio: cloreto de alquil dimetil benzil amônio, cloreto de alquil

dimetil etilbenzil amônio, cloreto de alquil dimetil etiltoluil amônio, cloreto de lauril
piridínio, cloreto e brometo de cetil trimetil amônio, cloreto de alquil trimetil amônio,
dicloreto de polioxietileno ( dimetilimino) etileno (dimetilímino) etileno e dicloreto de
polioxietileno (dimetilimino) metileno (dimetilimino) etileno.

Compostos Inorgânicos Liberadores de Cloro Ativo: hipoclorito de sódio, de lítio e

de cálcio.

Compostos Orgânicos Liberadores deCloro Ativo: ácidodicloroisocianúrico e os sais

sódico e potássio, ácido tricloroisocianúrico, N N dicloroazodicarbonamidina, N N
dicloro 4 carboxi benzenosulfonamida, N N dicloro 4 metil benzenosulfonamida, N-

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cloro benzenosulfonamida, N-cloro benzenosulfonamida sódica, N-cloro 4 metil
benzenosulfonamida sódica, N-cloro succinimida e 1,3 dicloro 5,5 dimetilhidantoína

Iodo e Derivados: iodo, iodo-povidona (PVPI) e iodóforos.

Álcoois e Glicóis: álcool etílico, álcool feniletílico, trietilenoglicol e propilenoglicol.

Biguanidas: clorhexidina

Outros: ácido benzóico, ácido undecilênico, benzoato de sódio, dodecil di(aminoetil)

glicina, dodecil aminoetil glicina, 4 hidroxibenzoato de metila, 4 hidroxibenzoato de
propila, terpenos e terpinenos.

4.2 Álcool
O etanol mata efetivamente bactérias e fungos, mas não endosporos e vírus não
envelopados. Age desnaturação as proteínas, mas também rompe a membrana e dissolve
lipídeos. Sua principal vantagem é a evaporação rápida. A concentração recomendada é
de 70%, mas concentrações entre 60 a 95% também matam efetivamente, já que a
desnaturação requer a presença de água, como podemos perceber na tabela a seguir.

Tabela 1. Ação biocida de várias concentrações de Etanol em solução aquosa frente a

Steptococcus pyogenes (Tortora, 2001)

[] etanol % 10s 20s 30s 40s 50s

100 - - - - -

95 + + + + +

90 + + + + +

80 + + + + +

70 + + + + +

60 + + + + +

50 - - + + +

40 - - - - -

11
4.3 Fatores que influenciam a eficácia dos sanitizantes:
 Concentração

 Tempo

 pH

 Tipo (qualitativo) e carga (quantitativo) dos microrganismos

4.4 Monitorização dos procedimentos de desinfecção de

superfícies:
O objetivo da monitorizarão dos procedimentos de desinfecção de superfícies é avaliar a
eficácia do produto em seu local de aplicação de forma a estabelecer um procedimento
com base em histórico de resultados.

 Rodac: São placas contendo meio de cultura apropriado de forma convexa

acrescido de agentes inativantes que contata a superfície a ser amostrada. Tem
como objetivo a avaliação de superfícies planas quanto à contaminação
microbiana.

 Swab: Método de esfregaço, que consiste em uma haste com ponta de algodão
hidrofílico (zaragatoa). Tem como objetivo a avaliação de superfícies não
planas, quanto ao controle microbiológico como, por exemplo, maçanetas e
lugares de difícil acesso em equipamentos.

4.4.1 Sugestões de agentes de limpeza, segundo o CTFA:

 Silicato,

 Ácidos inorgânicos – ácido fosfórico,

 Detergentes aniônicos, etc.

4.4.2 Sugestões de sanitizantes químicos, segundo o CTFA:

 Solução de formol,

 Amônios quaternários,

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  Hipoclorito de sódio.

4.4.3 Sugestões de limites:

 Superfície de contato: pisos, paredes, maçanetas: 5 UFC/placa.

 Fluxo laminar e superfície de equipamentos: 2 UFC/ placa

OBS: Se o limite exceder e/ou se 50% das superfícies testadas apresentarem

crescimento deverá ser feita uma limpeza adicional seguido de novas análises.

4.5 Controle de Ambiente

Feito através de exposição de placas de Petri contendo meio de cultura (ágar) estéril
com os inativantes específicos. Tem como objetivo avaliar o ar ambiente quanto ao
número de contaminantes.

Com relação ao tempo de exposição em geral adota-se 30 minutos e o resultado é

expresso em UFC/tempo de exposição. Os equipamentos usuais para realização deste
controle são RCS plus, “Slit to agar” e Andersen.

4.5.1 Sugestões de limites:

Em geral adota-se entre 20 a 50UFC/ 30 minutos de exposição. Para determinação dos

limites deve-se considerar o tipo de produto, as condições das instalações e se as Boas
Normas de Fabricação estão sendo seguidas.

4.6 Controle de manipuladores

Para treinamento dos manipuladores sugere-se o Toque de Mãos, onde os mesmos
devem tocar a superfície do meio de cultura especifico em placas de Petri. O objetivo é
avaliar a contaminação microbiana das mãos ou luvas dos manipuladores quanto a
assepsia. Como sugestões de anti-sépticos, o álcool etanol ou isopropílico a 70% (v/v), a
tintura de iodo (2% de iodo molecular e 2% de iodeto de sódio em álcool) e o PVPI
(polivinilpirrolidona - iodo).

4.6.1 Sugestões de limites

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  Luvas: 5 UFC/placa

 Uniformes: 10UFC/placa

OBS: Se os limites forem excedidos os manipuladores serão por um período pré-

determinado, acompanhados e treinados.

5. Avaliação da Qualidade Sanitária da Água na Indústria

Cosmética

A água é a substância mais largamente utilizada na produção de cosméticos. Como

matéria-prima é o componente presente em maior proporção na grande maioria dos
produtos.Esta envolvida também, no processo produtivo como agente de limpeza, seja
da área produtiva, de equipamentos, de material de acondicionamento e também, na
própria higiene dos operadores. Conseqüentemente, este insumo é considerado uma
significante fonte de contaminação, uma vez que apresenta grau 4 de risco, ou seja,
maior grau de susceptibilidade de contaminação.

5.1 Regulamentação
A água potável é regulamentada pela Portaria nº 518 de 25/03/2004 que “estabelece os
procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilância da qualidade da
água para consumo humano e seu padrão de potabilidade, e dá outras providências.
Revogou a Portaria n° 1469 de 29/12/2000”.

De acordo com esta portaria a água deve apresentar as seguintes características de

Qualidade:

a) Físicas, organolépticas e químicas: cor aparente, odor, sabor, turbidez, compostos

inorgânicos e orgânicos que afetam a saúde, compostos orgânicos que afetam a
qualidade organoléptica.

b) Microbiológica: ausência de coliformes totais e fecais em 100 mL; recomendação

máxima de bactérias heterotróficas: < 500 UFC/mL

A Portaria 1006 de 15/12/1988 propõe regulamento técnico para fixação de identidade e

qualidade para água mineral e água potável de mesa.

Os componentes usuais considerados contaminantes da água são:

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  componentes inorgânicos dissolvidos;
 materiais orgânicos solúveis;
 materiais em estado de dispersão (macromoléculas);
 partículas sólidas;
 Micro-organismos

Tabela 2. Resumo dos parâmetros microbiológicos exigidos pela portaria nº 518

para água potável.

PARÂMETRO VMP (1)

Água para consumo humano (2)

Escherichia coli ou Ausência em 100ml

coliformes

termotolerantes (3) Água na saída do tratamento

Coliformes totais Ausência em 100ml

Água tratada no sistema de distribuição (reservatórios e rede)

Escherichia coli ou Ausência em 100ml

coliformes
Coliformes totais Sistemas que analisam 40 ou mais amostras por
termotolerantes (3) mês:

Ausência em 100ml em 95% das amostras

examinadas no mês;

Sistemas que analisam menos de 40 amostras por

NOTAS: (1) Valor Máximo Permitido. / (2) água para consumo mês: humano em toda e qualquer situação,
incluindo fontes individuais como poços, minas, nascentes, dentre outras. / (3) a detecção de Escherichia
coli deve ser preferencialmente adotada. Apenas uma amostra poderá apresentar
mensalmente resultado positivo em 100ml

5.2 Água purificada

A água purificada é definida da seguinte forma: “É o insumo resultante da utilização de
processos combinados de tratamento, os sinais incluem como unidades finais à
destilação, colunas de troca iônica ou aparelhagem de osmose reversa. Deve cumprir
com as especificações rígidas de pureza química. É isenta de aditivos”.

A United State Pharmacopeia 29 (USP 29) especifica e padroniza métodos para

determinação dos índices de teor de carbono orgânico total (TOC), condutividade e
quantidade de unidades formadoras de colônias (UFC /mL).

Alguns dados especificados são máximo de 100 UFC/ml de bactérias heterotróficas,

500ppb de TOC e máximo de 1.3 μs/cm de condutividade.

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A Associação Brasileira de Cosmetologia recomenda a seguinte especificação
microbiológica para água purificada < 100 UFC/mL de bactérias e fungos, ausência de
coliformes totais e fecais em 100 mL e ausência de Pseudomonas aeruginosa em 100
mL.

Os ensaios de Pureza descritos na USP XXIII eram pH, Cloretos, Sulfatos, Amônio,
Cálcio, Dióxido de carbono, Metais pesados, Substâncias oxidáveis e Resíduo de
evaporação (não solúveis). A partir da USP XXIV foi estipulado apenas a análise do
Carbono Orgânico Total (TOC) que deve apresentar no máximo 0,5mg/L, e
condutividade de 1,3s/cm a 25º C.

Tabela 3. Recomendações e limites adotados para a qualidade microbiana da água,

descritos na Farmacopéia Americana 29 ed., CTFA (The Cosmetic, Toiletries and
Fragrance Association), CTPA (The Cosmetic, Toiletries and Perfumary Association) e
ABC (Associação Brasileira de Cosmetologia).

Farmacopéia CTFA CTPA ABC

americana

< 100 UFC/mL < 500 UFC/mL área <100 UFC/ mL <100 UFC/ mL
dos olhos e bebês Ausência de coliformes
< 1000 UFC/mL totais e fecais e
demais produtos Pseudomonas aeruginosa
em 100mL

5.3 Micro-organismos
5.3.1 Grupo coliformes

O grupo Coliformes Totais é representado por micro-organismos na forma de bastonetes

gram-negativos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, não formadores de esporos,
oxidase-negativo, capazes de crescer na presença de sais biliares ou outros agentes
tensoativos, fermentam a lactose com produção de aldeído, ácido e gás a 35º C

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(Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Escherichia coli). Os Coliformes Fecais ou
Coliformes Termotolerante são bactérias do grupo coliformes que apresentam as
características do grupo, porém à temperatura de incubação a 44,5º C (Escherichia coli).

O teste para a detecção de coliformes empregando-se substratos cromogênicos (reação

enzimática) é hoje o mais usual, já que é rápido (24 horas) e específico (detecta 1 UFC
em 100mL). Baseia-se nas enzimas orto-nitro fenil -  - D - galactopiranosídeo (ONPG)
e 4 - metilumbeliferil -  - D - glucoronídeo (MUG). Esses substratos são
comercializados como COLILERT® e LMX plus®, por exemplo, e detectam a presença
ou ausência dos microrganismos específicos.

Tem como principais vantagens:

 Detecção desde 1 UFC/100 mL;

 Recupera bactérias estressadas pelo tratamento;
 Resultados claros e fáceis de serem lidos;
 Elimina pesagem e preparo dos meios de cultura;
 Presença e ausência na amostra, obtenção incubação e leitura podem ser feitas
num mesmo recipiente;
 Resultados confirmados e completos em 24 horas.

5.3.2 Pseudomonas aeruginosa

Outro micro-organismo que contamina a água facilmente é a Pseudomonas aeruginosa.

São bastonetes gram-negativos, aeróbios obrigatórios, móveis, citocromo-oxidase
positiva. Muitas espécies são psicrófilas dotadas de atividade lipólitica e proteolítica,
seu metabolismo é respiratório e não fermentativo. Produzem pigmentos fluorescentes e
piocionina, entretanto podem-se encontradas culturas apiocianogênicas.

5.4 Tratamentos para Obtenção de Água Purificada

5.4.1 Destilação

Consiste na coleta do vapor condensado produzido pela ebulição da água (mudança de

fase). Tem como principais problemas operacionais à contaminação microbiana no
armazenamento, processo de incrustações e consumo de água e energia elevadas.

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 5.4.2 Deionização

Os deionizadores trocam cátion e ânions por H+ e OH-, respectivamente. Podem ser de

leito misto, onde as resinas catiônica e aniônica estão misturadas entre si, ou de leito
separado, onde as resinas catiônica e aniônica estão cada uma em um cartucho.

Seus principais problemas operacionais são comprometimento da eficiência por

bloqueio da troca iônica (regeneração) e contaminação microbiana.

5.4.3 Osmose Reversa

A água é submetida a um processo que usa uma pressão superior à pressão osmótica, a
água atravessa uma membrana semi-permeável, passando de uma solução alta
concentração para uma solução de baixa concentração (membrana de poliamida/acetato
de celulose). Tem como problemas operacionais a contaminação microbiana e bloqueio
por depósito de materiais que deve levar a troca da membrana.

5.5 Recursos utilizados em água purificada para eliminação ou

redução de micro-organismos

5.5.1 Radiação Ultravioleta

A radiação ultravioleta tem a capacidade de atravessar as paredes das células, do

citoplasma e das membranas nucleares, sendo absorvido instantaneamente pelo DNA
celular (material reprodutivo). A energia UV causa permanente inativação do
microorganismo e incapacidade de reprodução. A eficiência de desinfecção é de 99,9%.

Tem como principais vantagens à não formação de resíduos ou de subprodutos, não

formação de substâncias corrosivas e os elementos próprios da água não são
modificados. Também não há o acumulo de vírus, bactérias ou parasitas, é de aplicação
fácil e produz uma desinfecção eficaz.

É aplicada em efluentes secundários para desinfecção de bactérias e vírus dos efluentes.

Em leitos trocadores de resinas para descontaminação bacteriológica dos leitos das
resinas. Também tem ação sobre os compostos orgânicos, dependendo da faixa de onda
reduz o Carbono Orgânico Total (TOC), transformado carbonos orgânicos em CO2.

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Remove ozônio em altas dosagens efetivamente. A luz ultravioleta elimina 50% de
bactéria nitrificantes.

5.5.2 Ozônio

O ozônio é o mais poderoso oxidante utilizável (1,5 vezes mais forte do que o cloro). É
3.125 vezes mais rápido do que o cloro na inativação de bactérias. Não produz toxinas
na água e é gerado no local de utilização. Quando não consumido, decompõe-se
naturalmente em oxigênio. O transporte, manuseio e estoque não são necessários.

Suas principais aplicações são em água potável, água de resfriamento e/ou processo,
efluentes industriais, com alto teor de orgânicos (Ind. Química, Alimentícia,
Farmacêutica, Celulose e Papel, Têxtil, etc.). Na redução de cor, odor, NOX, em água
Mineral (enxágüe de desinfecção de reatores, tanques e garrafas) e no tratamento de
lixiviação.

5.5.3 Filtração Esterilizante

A filtração esterilizante é um processo físico muito empregada no final da linha de um

sistema de purificação de água. A porosidade do filtro é de 0,22 micras e a finalidade é
a retenção de microrganismos.

5.5.4 Cloração

O cloro é um dos agentes mais comumente empregados, é de fácil disponibilidade e

apresenta um custo relativamente baixo, como apresenta alto poder de corrosão, há
necessidade de controlar cuidadosamente o tempo de contato.

5.6 Procedimento de Sanitização

Devem ser realizados procedimentos de sanitização também nas colunas de troca iônica,
mangueiras e nos reservatórios, de forma a evitar a formação de biofilmes.

5.7 Amostragem
O procedimento da amostragem refletirá diretamente nos resultados. A pessoa
responsável deverá estar devidamente paramentada, o intervalo de tempo entre a coleta
e a análise não deverá exceder a 8 horas, o frasco para coleta deve ser apropriado e

19
estéril e a amostragem não deverá ser inferior a 300 mL. É importante apresentar um
histórico da água em análise (se foi armazenada, qual o período, se houve adição de
conservantes).

No caso de água de rede de abastecimento local, deve-se adicionar 0,1mL de solução de

tiossulfato de sódio a 10% para cada 100mL de água, de forma a inativar o cloro
presente e evitar falsos-negativos.

5.8 Considerações Gerais

Os recursos com a finalidade de destruir os micro-organismos indesejados na água de
produção devem ser utilizados com critério. Alta carga contaminante compromete a
eficiência destes recursos (filtração esterilizante, lâmpada germicida e outros). Quando
esses recursos não são utilizados com rigor podem ocorrer mecanismos de
sobrevivência, gerados pelas doses subletais.

6. Biofilme microbiano
São comunidades microscópicas de bactérias e ou fungos (leveduras) e suas secreções
que possuem a capacidade de formar uma camada fina ou espessa sobre superfícies que
se apresentam úmidas.

Esta comunidade pode ser composta única espécie ou várias espécies, tais como
Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Burkholderia pickettii,
Brevundimonas vesicularis, Sphingobacterium paucimobilis e Stenotrophomonas
maltophilia.

Os materiais mais susceptíveis a formação de biofilme são metais, concretos, plásticos,

madeiras e tecidos, entre outros, sendo os primeiros mais resistentes e os últimos mais
susceptíveis.

O biofilme se forma devido à baixa disponibilidade de nutrientes, como forma de

proteção em meio ambiente hostil, ou seja, uma estratégia de sobrevivência. A ação de
biocidas, além de condições de temperatura e pH do ambiente também pode influenciar,
assim como a possibilidade de troca de material genético e a velocidade de passagem da
água.

20
O desenvolvimento do biofilme é possível devido à capacidade de certos
microrganismos de formarem o EPS (Exopolissacarídeos), que permite a adesão dos
microrganismos à superfície, melhorando a resistência a dessecação, servindo como
reserva de nutrientes e proteção a biocidas.

Um dos principais problemas de formação de biofilme na Indústria Farmacêutica é no

Sistema de água, tanto nas áreas de fabricação como no sistema de distribuição
(tubulação).

Para evitar esse problema deve-se empregar de preferência o aço inoxidável 316 com
superfície lisas, tanques passíveis de drenagem e fácil acesso para limpeza e sanitização,
além de proteger tanque com filtros de retenção e determinar capacidade do tanque
(água parada no máximo 1 dia) ou recirculando. Os tanques de armazenamento devem
ser mantidos longe de poeira, luz, etc.

O biofilme apresenta uma maior resistência que as células planctônicas (10 –1000 vezes
a mais) supostamente devido a mutações e modificações enzimáticas.

7. Teste de Limite Microbiano

7.1 Objetivo
Determinar o número de micro-organismos viáveis e comprovar a ausência de
microorganismos patogênicos específicos, tais como Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, Coliformes Totais e Fecais.

7.2 Importância
Segurança do consumidor. O cosmético não deverá ser veículo transmissor de doenças.
Podemos destacar os seguintes efeitos patogênicos dos contaminantes:

Pseudomonas aeruginosa infecção ocular grave com enorme possibilidade de produzir

cegueira por destruição da córnea.

Propionium bacterium acne responsável pela acne e pele predisposta a tal distúrbio.

Tricophytum os fungos deste gênero são responsáveis por infecções do couro

cabeludo, freqüentemente com produção de escamas, eritemas,
prurido intenso, caspa e alopécia

21
Candida albicans responsável por pequenas úlceras genitais e vaginites

Pityrosporum ovale hospedeiro frequente do couro cabeludo, considerando um dos

responsáveis pela caspa.

Brevibacterium ammoniagens maior responsável pela degradação do suor apócrino e

consequente produção de mau odor.

Staphylococcus aureus supuração e inflamação sobre pele irritada

O microrganismo também não deve alterar a estabilidade do produto, gerando mudanças

de cor, odor, pH, presença de gás e ineficácia da substância ativa.

7.3 Padrões Microbianos

7.3.1 Resolução ANVS n° 481 de 23 de setembro de 1999

Tabela 2. Limites máximos permitidos em UFC/g ou mL, segundo Resolução ANVS n°

481 de 23 de setembro de 1999.

Área de Aplicação e Limites de Aceitabilidade

Faixa Etária
Produtos para uso infantila) contagem de micro-organismos mesófilos totais e aeróbios,
Produtos para área dos não mais de 102 UFC/g ou mL (limite máximo: 5x102 UFC/g
olhos ou mL).
Produtos que entram em b) ausência de Pseudomonas aeruginosa em 1g/mL
TIPO – I contato com mucosas c) ausência de Staphylococcus aureus em 1g/mL
d) ausência de Coliformes totais e fecais em 1g/ mL
e) ausência de Clostridios Sulfito redutores em 1g
exclusivamente para talcos
TIPO – II a) contagem de micro-organismos mesófilos totais aeróbios,
não mais de 103 UFC/g ou mL (limite máximo 5x103 UFC/g
Demais produtos ou mL)
cosméticos susceptíveis a b) ausência de Pseudomonas aeruginosa em 1g/mL
contaminação c) ausência de Staphylococcus aureus em 1g/mL
d) ausência de Coliformes totais e fecais em 1g/mL
e) ausência de Clostridios Sulfito redutores em 1g
exclusivamente para talcos

7.3.2 CTFA – The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association

Tabela 3. Limites máximos permitidos em UFC/g ou mL, segundo proposta do CTFA(

The Cosmetic, Toiletrie, and Fragrance Association ).
Área de aplicação e Limite de aceitabilidade
faixa etária
Especificação quantitativa:
Produtos para uso Contagem de micro-organismos mesófilos totais aeróbios,
Categoria I infantil não mais que 102 UFC/g ou mL

22
 Produtos para área Limite máximo: 5x102 UFC/g ou mL
dos olhos Especificação qualitativa:
Nenhum micro-organismo deve ser prejudicial ao consumidor
e ao produto
Especificação quantitativa:
Contagem de micro-organismos mesófilos totais aeróbios,
Categoria II não mais que 103 UFC/g ou mL
Demais produtos Limite máximo: 5x103 UFC/g ou mL
cosméticos Especificação qualitativa:
Nenhum micro-organismo deve ser prejudicial ao consumidor
e ao produto

7.3.3 COLIPA – The European Cosmetic Toiletry and Perfumery

Association

Tabela 4. Limites máximos permitidos em UFC/g ou mL, segundo proposta da

COLIPA( The European Cosmetic Toiletry and Perfumery Association ).
Área de aplicação e faixa etária Limite de aceitabilidade
Especificação quantitativa:
Contagem de micro-organismos mesófilos totais
Produtos para uso infantil aeróbios,
não mais que 102 UFC/g ou mL
Categoria I Limite máximo: 5x102 UFC/g ou mL
Produtos para área dos olhos
Especificação qualitativa :
ausência de Pseudomonas aeruginosa em 0,1g/mL;
ausência de Staphylococcus aureus em 0,1g/1mL;
ausência de Candida albicans em 0,1g/mL.
Especificação quantitativa:
contagem de micro-organismos mesófilos totais
aeróbios,
não mais que 103 UFC/g ou mL
Categoria II Demais produtos cosméticos Limite máximo: 5x103 UFC/g ou mL

Especificação qualitativa:
ausência de Pseudomonas aeruginosa em 0,1g/mL;
ausência de Staphylococcus aureus em 0,1g/mL;
ausência de Candida albicans em 0,1g/mL.

7.4 Fontes de Contaminação

 Instalação
 Ar ambiente
 Equipamentos
 Pessoal
 Matérias primas (derivadas de fontes biológicas)
 Material de acondicionamento

23
  Água
 Consumidor (deve-se efetuar o teste de eficácia de conservantes)

7.5 Fatores que influenciam na carga microbiana

7.5.1 Componentes da fórmula

Nutrientes tais como aminoácidos, vitaminas, etc. favorecem a carga microbiana e

substâncias que contribuem com o sistema conservante: etanol, gliceril monolaurato,
ácido salicílico, etc.

7.5.2 Atividade de Água

Água livre disponível para a utilização pelos micro-organismos. Atividade de água

mínima para o crescimento microbiano 0,65 – 0,85.

7.5.3 pH

Próximo a neutralidade favorece a multiplicação de micro-organismos (bactérias).

Ácido (5-6) favorece os fungos (bolores e leveduras). Muito alcalino ou muito ácido
dificulta o desenvolvimento de carga microbiana.

7.5.4 Potencial de oxido-redução

Presença de agentes oxidantes e redutores. Quanto  redutores  oxigênio.

Geralmente os microrganismos contaminantes são aeróbios.

7.5.5 Processo de fabricação

Etapas de aquecimento acima de 700 C (pode ocasionar destruição dos micro-

organismos). Processo úmido de granulação. A etapa de secagem a baixa temperatura
pode ocasionar a multiplicação de micro-organismos.

7.6 Amostragem
Matérias-primas

n ou n + 1, onde n = número de embalagens que compõe o lote

Produto acabado

Recomenda-se, no mínimo, 3 unidades (início, meio e final do envase)

24
 7.6.1 Preparação da Amostra

Limpeza externa do frasco com solução desinfetante apropriada, seguida da diluição da

Amostra. Para amostra líquida, a diluição é feita com diluentes biocompatíveis (solução
salina, solução peptonada a 0,1%(p/v), caldo caseína - soja)

As amostras sólidas devem ser previamente trituradas e homogeneizadas em gral e

pistilo esterilizado ou mecanicamente (agitador tipo Vórtex). Os cremes e pomadas
devem ser homogeinizados com tensoativos estéreis para auxiliar a dispersão (exemplo:
Polissorbato 20,80). Os aerossóis devem ser pesados na embalagem e após acionar
determinado número de jatos no diluente, pesados novamente.

7.7 Determinação do número de microrganismos viáveis

7.7.1 Métodos quantitativos

Superfície: Inocula-se 0,1 – 0,5 ml da amostra diluída em placas com o meio de cultura
já solidificado.

 Meio de cultura solidificado

 Volume adicionado: 0,1-0,5 ml

 Espalhamento com alça de Drigalski

Semeadura em profundidade ou “Pour Plate”: Transfere-se 1 ml da amostra na placa e

adiciona-se o meio de cultura fundido e resfriado a  450 C . Após homogeneização
(movimento em 8) e solidificação proceder a incubação por período e temperatura
definidos (30 – 350 C, de 48 a 72 horas, para bactérias e a 20 – 250 C, para fungos).
(Histórico: descrita na USP, 1942).

Filtração: Solubilizar a amostra, quando necessário, e filtrar através de membrana com

porosidade a,45 0,02m e 47 mm de diâmetro. Transferir a membrana para placa de
petri contendo meio de cultura solidificado e incubar adequadamente. (Histórico:
descrita na USP, em 1970).

7.7.2 Método Estimativo

Método dos Tubos Múltiplos ou Número Mais Provável - Técnica Estimativa de

determinação Microbiana. Baseado em um grande número de ensaios obteve-se a tabela

25
do NMP (diversas combinações em função de diferentes testes de inoculações) e série
de 3 a 5 tubos. Portanto o NMP não representa uma medida exata do número de
microrganismos presentes na amostra, mas sim um valor estimativo, cuja fidelidade
aumenta com o aumento do número de ensaios. Histórico: descrita pela primeira vez na
USP em 1970.

7.8 Comprovação da Inativação do Sistema Conservante na

Técnica de Contagem de Viáveis
Objetivo: Determinar a diluição do produto a ser empregada no teste de limite
microbiano cuja ação bacteriostática não iniba o crescimento microbiano.

Microrganismos utilizados

 Staphylococcus aureus ATCC 6538

 Escherichia coli ATCC 10536
 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
 Candida albicans ATCC 10231
 Aspergillus niger ATCC 16404

7.9 Pesquisa de micro-organismo patogênico específicos

 Enriquecimento não seletivo: Tryptic Soy Broth (TSB)  S. aureus, P
aeruginosa e Caldo lactosado  E. coli, Salmonella sp
 Enriquecimento seletivo: Inoculação a partir do enriquecimento não seletivo
para meios líquidos com substâncias inibidoras de crescimento de outros
microrganismos.
 Isolamento em meio seletivo. Isolamento em meio sólido através de técnica de
esgotamento. Verificar característica da colônia macro e microscopicamente
(Gram).
 Identificação presuntiva: Observação de algumas reações bioquímicas a partir de
colônias suspeitas.
 Identificações bioquímicas mais complexas e testes sorológicos.

26
 8. Teste de eficácia de sistema conservante (“Challenge test”)

A qualidade do produto está diretamente relacionado a qualidade microbiológica. A

contaminação pode provocar mudanças de cor, odor e viscosidade do produto, além de
trazer conseqüências aos consumidores como danos à saúde.

Proteger os produtos cosméticos das contaminações por bactérias e fungos desde a fase
de seu desenvolvimento até o uso pelo consumidor, chegando ao final do prazo de
validade, é uma tarefa que requer bastante empenho e conhecimento sobre a
composição química do produto, sobre os microorganismos e sobre a química e
mecanismos de ação dos conservantes.

As conseqüências de uma contaminação microbiana nos produtos cosméticos recaem

sobre o consumidor, que poderá sofrer danos à saúde por ter uma população de
microorganismos acima do normal ou até patogênica em sua pele.

As contaminações podem:

 Provocar alterações nas características organolépticas como cor, odor e

viscosidade, formação de bolhas ligadas a liberação de componentes gasosos.

 Ocorrer o aparecimento de toxinas ligadas ao metabolismo e proliferação de

microorganismos que podem levar a reações alérgicas.

 Infecções quando há escoriações no indivíduo que utiliza os produtos

contaminados.

Muitos cosméticos contaminados ocasionam reclamações ou perda de consumidores,

muitas vezes obrigando o recolhimento do lote do mercado, isto leva a perdas
financeiras e desgaste de imagem da marca ou da empresa. A garantia de qualidade cada
vez mais ganha importância para o consumidor.

Conservantes são substâncias adicionadas aos produtos de Higiene Pessoal, Cosméticos

e Perfumes a fim de preservá-los de danos e/ou deteriorações causadas por
microorganismos durante sua fabricação e estocagem, bem como proteger o consumidor
de contaminação inadvertida durante o uso do produto.

São substâncias intrinsecamente tóxicas, portanto a concentração utilizada é pequena

(efeito bacteriostático). Biocida (destruição) e Bioestático (mantém o mesmo nível de
microrganismos ou diminuí, porém não destrói).

27
Os conservantes interferem no crescimento, multiplicação e metabolismo microbianos,
por um ou mais mecanismos. Pode haver combinação entre grupamentos químicos dos
conservantes com as proteínas microbianas, ação competitiva com determinados
processos enzimáticos, destruição ou inativação funcional de material genético e reação
com a membrana celular.

Selecionar e usar corretamente um sistema conservante ideal significa definir a melhor

combinação de ativos conservantes e sua concentração. Os passos que se devem seguir
para selecionar um conservante se inicia com a identificação das possíveis
contaminações que podem ocorrer com a formulação. Em seguida, deve-se optar por
conservantes que tenham amplo espectro de ação microbiológico.

Este conservante deve ser eficaz e estável em todas as faixas de pH encontradas em

produtos cosméticos. As formulações de cosméticos apresentam um amplo intervalo de
pH e os microorganismos são capazes de crescer em pH variável de 2 a 11. Idealmente
um conservante deverá ser efetivo neste intervalo. Na prática, muitos conservantes são
dependentes de pH, a maioria deles são mais efetivos em pH ácido do que alcalino.
Alguns conservantes com amplo limite de pH normalmente tem o inconveniente de ser
composto químico de elevada reatividade e reagem com outros componentes da
formulação. Um exemplo é o formaldeído. Muitos ácidos são utilizados como
conservantes e sua efetividade depende da quantidade de ácido não dissociado, o qual
depende da constante de dissociação do pH do sistema. O ácido benzóico é um
excelente conservante na sua forma não dissociada, mas é muito dependente do pH do
meio, em pH 6 aproximadamente, necessita de sessenta vezes mais que em pH 3.

Alguns conservantes são dependentes do pH em virtude de sua instabilidade química. O

Bronopol, por exemplo, perde a atividade pela degradação em pH 7. Para a escolha de
um conservante econômico e efetivo, é necessário saber a relação entre pH e sua
atividade.

A distribuição entre água e óleo deverá ser apropriada para dar um sistema de emulsão.
Ter adequado coeficiente de partição óleo em água, de modo a permitir concentração
efetiva em ambas as fases. Tem sido reconhecido como atividade primária
antimicrobiana resistente na fase aquosa de um sistema conservante bifásico, e é por
essa razão dependente da equilibrada concentração de conservante nessa fase.

28
Conservantes são separados entre a fase aquosa e a fase oleosa de acordo com o
coeficiente de partição e a relativa razão de óleo e de água presente no sistema. Se o
coeficiente de partição óleo / água for alto torna-se extremamente difícil manter um
nível de conservação adequado na fase aquosa sem uma excessiva concentração de
conservante total.

A fase oleosa pode ser considerada para representar um material imiscível em água, mas
é importante lembrar que o coeficiente de partição óleo / água pode ser dependente do
tipo de óleo presente. È reconhecido que a partição da água em óleos vegetais é mais
eficiente do que em óleos minerais. Adicionalmente, o pH do sistema pode
substancialmente afetar a partição, tanto como o tamanho da gota, e conseqüentemente a
área de superfície interfacial da fase oleosa, durante a agitação.

No caso de emulsões a formulação estável pode ser mantida pela adição de um agente
emulsionante, usualmente um tensoativos não iônico. Usualmente são incluídos
múltiplos agentes conservantes ou sistemas de emulsionantes mistos. Experiências
mostram que a atividade antimicrobiana pode ser potencializada com a adição de baixas
concentrações de tensoativos não iônicos. Fato que pode ser atribuído ao tensoativo
aumentar a permeação do agente conservante na célula da bactéria, esse fenômeno é
dependente do sistema micelar.

A adição do conservante durante o processo de fabricação está diretamente associado a

eficácia do conservante. O ideal para a melhor eficácia do conservante é adicioná-lo ao
final do processo de manufatura após a fase de resfriamento, pois, geralmente, pode
ocorrer degradação. É preciso tratar o conservante com os mesmos cuidados dedicados
aos perfumes para evitar perdas por evaporação ou reações ao longo das curvas de
variação de pH, temperatura e potencial oxi-redutor que podem ocorrer durante ao
processo. Tal como com algumas reações químicas, a atividade dos agentes
conservantes, usualmente, aumentam com um aumento na temperatura, embora os
efeitos sejam muitas vezes complicados pela dependência da temperatura do organismo
alvo. Embora haja uma limitação da temperatura, a qual é estendida em temperaturas
refrigeradas, sua ação é limitada e os efeitos da temperatura podem ser verificados
através de equações matemáticas, onde se verifica o tempo de morte a cada 10 ºC.

29
Observa-se que os diferentes agentes conservantes respondem diferentemente a variadas
temperaturas, sendo importante observar as recomendações de refrigeração de alguns
produtos após abertos.

Os conservantes devem inativar rapidamente os contaminantes prevenindo a adaptação

microbiana, estar de acordo com a legislação vigente (portaria 79, de 28/08/2000). A
Resolução RDC nº 162, de 11 de setembro de 2001 revoga o anexo II da Resolução nº
79, de 28 de agosto de 2000, estabelecendo a lista de substâncias de ação conservantes
para produtos de higiene pessoal, cosméticos e perfumes. Considera-se que a legislação
sanitária se aplica a produtos nacionais, provenientes dos Estados Partes do Mercosul e
de outros países. Esta resolução entrou em vigor em 12 de setembro de 2001.

O conservante também não deve alterar as propriedades físicas do produto, como odor,
cor, sabor e textura, não ser tóxico e irritativo e principalmente ter custo acessível,
compatível ao produto.

A probabilidade de se encontrar um conservante que tenha todos estes requisitos é

muito baixa. Consequentemente, os microbiologistas ficam no compromisso de
encontrar outro conservante que tenha uma química ideal. Esta química é normalmente
encontrada com o uso de dois ou mais compostos.

Sinergismo é uma propriedade raramente procurada na combinação de conservantes, e

não deve ser confundida com a ampliação do espectro antimicrobiano.

Um benefício ocasional do uso de agentes conservantes em combinação é um aumento

na atividade, que é considerado como um verdadeiro sinergismo. A utilização de
concentrações mais baixas pode resultar em redução dos efeitos tóxicos e prevenção do
desenvolvimento de resistência microbiana em relação aos componentes individuais,

A extensão do sinergismo sobre agentes conservantes é dependente da sua relativa

razão; essa deverá controlar não apenas a concentração inicial dentro da formulação,
mas a influência desse fator deve ser avaliada na sua forma ativa. Assim, ao selecionar
combinações sinérgicas de conservantes, deve-se ter devida atenção as propriedades
físico-químicas individuais de cada um no sistema formulado. A extensão do sinergismo
pode ser testada numa simples solução ou e formulações mais complexas. Os testes
laboratoriais podem ser eliminados quando for verificado o antagonismo.

30
Visto o acima descrito para selecionar o sistema conservante devemos ter conhecimento
da formulação e seus componentes, conhecimento das propriedades dos antimicrobianos
como estrutura química, aspectos legais e combinações, assim como saber qual é a
interação do conservante com o material de acondicionamento.

Em adição aos resultados obtidos com o design dos recipientes (embalagens) e seus
tipos de tampa que protegem da contaminação é muito importante lembrar que a
composição da embalagem pode afetar a integridade do produto.

Como exemplo, embalagens feitas de polietileno podem absorver parabenos, que

conservam o produto, deixando o produto vulnerável ao crescimento de
microorganismos, isso pode acarretar mudanças na estabilidade do produto e até mesmo
causar doenças nos consumidores.

Outro caso de interação, nesse caso positiva, são as embalagens de metal que acabam
por matar os micro-organismos presentes, essa é uma vantagem do metal sobre o vidro.

Estudos vêm desenvolvendo uma nova embalagem, utilizando o Biopol, um produto

biodegradável proveniente da bactéria Alcaligenes eutrophus, que tem a capacidade de
proteger contra a contaminação de outras bactérias, e também é degradado por bactérias.

Não se deve esquecer que os cuidados com a contaminação devem-se estender aos
rótulos e adesivos utilizados, uma boa forma de proteger o consumidor do produto
contaminado é orientá-lo através do rótulo para que o produto seja descartado após certo
período de tempo.

E a atitude mais importante a ser tomada, o processo de embalagem deve ocorrer em

ambiente limpo para que não ocorra contaminação no momento de embalar o produto.

O sistema conservante no cosmético tem como objetivo evitar a proliferação

microbiana, devendo assegurar a estabilidade do produto e evitar que o uso inadequado
destes produtos acarrete doenças no consumidor.

O teste de eficácia de conservantes é realizado em três fases, preferencialmente: produto

de bancada; lote piloto e lote industrial e deve ser realizado já que quantidade
insuficiente de conservante pode resultar em crescimento microbiano (alteração de
estabilidade) impossibilitando o uso e quantidade excessiva pode causar reações
indesejáveis no consumidor. Muitas vezes a concentração utilizada pode não ser
necessária, acarretando aumento no custo.

31
8.1. Teste desafio ou “challenge test”
Os métodos oficiais para a avaliação da eficácia de conservantes, consistem na
inoculação da amostra com cargas microbianas conhecidas e contagem periódica em
tempos pré-especificados durante 28 dias, do número de sobreviventes, denominado
“Teste do desafio” ou “Challenge Test”.

Essencialmente o “Challenge Test” tem o objetivo de avaliar a resistência de um

cosmético à contaminação microbiana.

Os procedimentos para a realização do teste diferem um pouco em função da norma

adotada (USP, CTFA, etc.) ou mesmo de empresa para empresa, mas a base de todos é a
mesma. Os métodos oficiais para a avaliação da eficácia dos conservantes são descritos
nos compêndios para medicamentos, tais como métodos da Farmacopéia dos Estados
Unidos (USP), da Farmacopéia Britânica (BP) e compêndios para cosméticos, tais como
American Society for Testing and Material (ASTM), Cosmetic, Toiletry and Fragance
Association (CTFA) e COLIPA (comunidade européia).

Apesar da semelhança entre os procedimentos descritos nos compêndios, e a tentativa

de harmonização dos métodos, os mesmos diferem quanto aos seguintes itens:

 Culturas: são os micro-organismos recomendados ou utilizados em um

determinado teste.

 Inóculo: refere-se ao uso de culturas puras (micro-organismos testados

separadamente) ou culturas mistas (pool de microorganismos inoculados na
mesma amostra)

 Contaminação inicial: nível de contaminação recomendado para o início do

teste.

 Número de inoculações: relacionado com a quantidade de vezes em que o

cosmético sofre inoculação.

 Intervalo de contagem: período após o qual o nível de contaminação é medido

no cosmético.

32
  Critério ou interpretação dos resultados: condição para que o cosmético seja
considerado aprovado.

 Tempo de duração do teste.

De forma geral é realizado o desafio da amostra ou seja, uma contaminação proposital

com micro-organismos específicos e avaliação da carga sobrevivente em intervalos de
tempo definidos.

As condições estabelecidas são:

 Quantidade da amostra: não menos que 20 g ou mL

 Carga do inóculo: 105 a 106 UFC/ g ou mL

 Volume do inóculo: não mais que 1% do volume da amostra

 Intervalo de tempo (Conforme Compêndio): após a inoculação – T0 , T24, T48,

T7 , T14 , T21 e T28

Os microrganismos utilizados para produtos cosméticos são:

 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

 Escherichia coli ATCC 10536

 Staphylococcus aureus ATCC 6538

 Candida albicans ATCC 10231

 Aspergillus niger ATCC 16404

Estes micro-organismos devem ser padronizados do meio de manutenção e do preparo

do inoculo, sendo que as cepas podem ser repicadas não mais de 5 vezes. O período de
permanência no ambiente deve ser superior a 1 hora. Os meios de cultura utilizados são
ágar caseína-soja ou ágar nutriente para bactérias e ágar sabouraud desxtrose para
fungos.

O inóculo é obtido através de culturas recentes (Bactérias 30 -35°C por 24 horas;

Levedura 20 -25 °C por 48 horas; Bolor 20 -25 °C por 5 a 7 dias).

33
Tabela 5. Critério de aceitabilidade – CTFA.
BACTÉRIAS FUNGOS BACTÉRIAS
ESPORULADAS
Produtos para área redução de pelo menos Fungos: redução de pelo ação bacteriostática
dos olhos e bebês 99,9% da contagem menos 90% da contagem durante todo o
inicial no intervalo de inicial no intervalo de período de teste
tempo igual a 7 dias com tempo igual a 7 dias com
decaimento contínuo até decaimento contínuo até
a finalização do teste a finalização do teste
Outros Produtos redução de pelo menos redução de pelo menos
99,9% da contagem 90% da contagem inicial
inicial no intervalo de no intervalo de tempo
tempo igual a 7 dias sem igual a 7 dias sem
aumento da carga aumento da carga
microbiana até a microbiana até a
finalização do teste finalização do teste

8.3 Regressão Linear: metodologia e avaliação

O método de regressão linear é um método alternativo para avaliação do sistema
conservante, proposto por Orth no final da década de 70, que se baseia no fundamento
teórico-matemático de que uma determinada população de microorganismo, quando
exposta ao agente microbiano perde sua viabilidade de modo regular e a fração de
sobreviventes decresce exponencialmente com o tempo. O parâmetro utilizado para
avaliação é o valor D, que é o tempo de redução decimal, definido como período de
tempo necessário para redução de 90% da população de micro-organismos, quando esta
é exposta a um determinado agente letal. O valor D é calculado através da curva
expressa pela função obtida entre o logaritmo do número de micro-organismos
sobreviventes e o tempo de inoculação.

Os micro-organismos desafiantes no teste são os mesmos preconizados pela

farmacopéia americana. Os meios de cultura são os convencionalmente utilizados para
contagem de bactérias e fungos, adicionados de substâncias que neutralizam os
componentes da fórmula com atividade antimicrobiana. A contagem de sobreviventes é
efetuada após 2, 4 e 24 horas. Considera-se como critério de aceitação da eficácia do
sistema conservante, o valor D menor ou igual a 4 horas para bactérias patogênicas e
menor ou igual 28 horas para bactérias não patogênicas e fungos.

8.2.1 Vantagens

34
O protocolo do teste por regressão linear é similar ao do teste oficial, porém o primeiro
apresenta as seguintes vantagens:

Apresenta um resultado em um curto período de tempo, eles podem ser obtidos em 24

horas, enquanto que pela metodologia oficial são necessários 28 dias.

Pode-se estimar o tempo requerido para destruição completa de qualquer população

microbiana em um produto.

Os critérios de aceitação são baseados em medição quantitativa da razão de morte de um

micro-organismo específico em um dado produto.

método pode ser ainda utilizado no estudo de efeitos aditivos e sinergéticos de

combinações de conservantes.

Apesar das vantagens, a escolha definitiva do sistema conservante depende do método

oficial, uma vez que este apresenta limitações. Segundo a literatura, em produtos com
conservantes em concentração próxima a mínima inibitória pode ocorrer o fenômeno
Phoenix, que consiste no decaimento do número de microrganismos seguido de
multiplicação com a inversão da curva de morte, após decorrer um tempo maior. Este
fenômeno, provavelmente, é decorrente da seleção de microrganismos resistentes e
também da redução da concentração livre de conservantes, resultado das interações do
sistema conservante com os componentes da fórmula e ou do material de
acondicionamento.

O método de regressão linear é bastante útil no desenvolvimento de uma formulação,

porque permite uma avaliação rápida (a obtenção do resultado em 24 horas) e
quantitativa, podendo auxiliar na triagem de sistemas conservantes e seleção do mais
adequado.

8.2.2 Procedimento

 volume do inóculo: 0,1 mL

 amostra: 50 g ou mL

 inóculo: 107 UFC/ g ou mL

35
  Intervalos de tempo - Bactérias: 2, 4, 24 e 48 horas/ Leveduras: 4, 8, 24 e 48
horas/ Bolores: 4,8, 24, 48 horas e 7 dias

8.3 Critério de Interpretação

 Bactérias patogênicas: D  4 horas

 Bactérias não patogênicas e Fungos: D 28 horas

 Bactérias formadoras de esporos: ação bacteriostática

36
 9. Exercícios

9.1 Qual a contagem microbiana por mL no produto final? Produto 1:10 - 1:10 - 1:10
Resultado da última diluição: 34UFC/mL

9.2 Uma suspensão oral foi submetida as seguintes diluições decimais seriadas 1:10 -
1:10. Resultado da última diluição ausência de crescimento em 1mL. Determinar o
número de unidades formadoras de colônias por mL.

9.3 Uma loção cosmética foi avaliada efetuando-se as diluições: 1:2 - 1:5 - 1:10 - 1:2.
Resultado da última diluição 243UFC/mL. Determinar o número de UFC/mL da loção.

9.4 Uma tomada de ensaio de 5g de produto para uso tópico foi transferida para 95mL
de meio de cultura. Desta diluição efetuou-se 3 diluições decimais seriadas e sucessivas.
Transferiu-se aliquota de 0,5mL (em duplicata) para placa de Petri e após
homogenização desta empregando-se meio de cultura adequado, incubou-se por 48horas
a 30-35ºC. O resultado obtido foi de 124 e 128UFC/0,5mL. Qual a contagem por g de
produto?

9.5 Uma suspensão microbiana (suspensão mãe) foi submetida ao seguinte esquema de
diluição: 1 gota em 9 mL e em seguida 6 diluições decimais seriadas. Da última diluição
1 mL foram plaqueados em triplicata e os resultados obtidos foram: 56 / 49 / 57. Qual é
a carga microbiana na suspensão mãe?

9.6 O Farmacêutico responsável por uma empresa desenvolveu metodologia para

avaliar a qualidade sanitária de um produto cosmético e os seguintes resultados foram
obtidos. Dados sistema conservante: metilparabeno e propilparabeno. Padrão
microbiano recomendado: <100 UFC/mL e ausência de microrganismos patogênicos
específicos.
Diluições MC + O MC + inativ.+ O
INATIVANTES 10-1 10-2 10-3 Controle I Controle II
0,1% (p/v)Tween + 0,5% (p/v) 72 102 103 103 100
Lecitina de soja
1%(p/v) Tween 80 + 0,8(p/v) 47 50 65 104 65
lecitina de soja
Diluição 64 62 101 101 -------
Com relação ao quadro acima, responda as seguintes questões:
a. Qual a metodologia eleita? Explique sua escolha.
b. Qual o problema das outras metodologias?
c. Qual a importância dos controles I e II?

37
9.7 Um produto cosmético submetido ao teste de desafio apresentou o seguinte
comportamento: Carga de sobreviventes de Aspergillus niger ATCC 16404 (UFC/g ou
mL) no teste de eficácia de conservantes em produtos cosmético.

Tempo/diluição T0 T6 T24 T48 T7 T14 T21 T28

10-1 Inc inc Inc 142/139 128/127 120/110 119/110 350/321
-2
10 Inc Inc 34/30 12/11 12/19 30/42 - -
10-3 Inc 32/31 2/3 - - - - -
-4
10 Inc 2/1 - - - - - -
10-5 35/42 - - - - - - -
T0 = contagem imediatamente após a inoculação; T24 e T48 = contagem em 24 e 48 horas após a
inoculação; T7, T14, T21 e T28 = contagem em 7, 14, 21 e 28 dias após inoculação; Inc = incontável

Pergunta-se: atende a especificação do CTFA?

9.8 Um produto cosmético deverá ser submetido ao teste de desafio, empregando-se o

uma suspensão de Staphylococcus aureus ATTC 6538 com concentração 5,0x109
UFC/gota. Descrever o procedimento para a inoculação do produto calculando a carga
necessária para atender as condições do teste. Produto: xampu para cabelos normais,
volume 50 mL.

9.9 Um produto cosmético em desenvolvimento deverá ser submetido ao Teste de

Eficácia do Sistema conservante. O microrganismo desafiante, Pseudomonas
aeruginosa, possui a seguinte carga: 3,5x1010 UFC/gota. Sabendo-se que o volume da
amostra a ser desafiada é de 80 mL, qual o procedimento adequado para desafiar o
produto?

38
 10. PROCESSOS DE ESTERILIZAÇÃO
Quando existem microrganismo presentes em amostras ou equipamentos e
materiais de laboratório, podemos reduzir a carga de microrganismos presente,
empregando a pasteurização ou sanitizantes químicos, destruírem a carga microbiana ou
removê-la.
O calor é um método físico de destruir os microrganismos. Podemos empregá-lo
de duas formas: calor úmido (vapor de água) ou calor seco.
O calor úmido desnatura as proteínas do microrganismo por coagulação, sendo
empregado um equipamento denominado autoclave. Para este método ser eficaz
devemos submeter o produto ou material ao calor úmido a uma temperatura de 121 ºC
por 15 minutos em geral. Esta temperatura só é atingida ao aplicarmos uma atmosfera
de pressão. Este método é empregado para meios de cultura, diluentes, alguns
equipamentos, roupas, dentro do laboratório microbiológico, restringindo-se a líquidos
não voláteis e materiais termoestáveis. A autoclavação destrói tanto as células viáveis
quanto os endósporos.
O que determina o tempo mínimo de exposição ao calor úmido são
características como volume do material e densidade do mesmo, que influenciam
diretamente na penetração do calor até o centro dos materiais. O tipo e carga dos
microrganismos, ou seja, o bioburdem, também é um fator relevante na determinação do
tempo de exposição. A autoclavação com a finalidade de esterilização leva em torno de
15 minutos, porém quando se deseja descontaminar material já utilizado, devemos
submeter o mesmo a temperatura de 121º por no mínimo 45 minutos.
O método tem como vantagens não deixar resíduos, ter penetração uniforme e
utilizar temperaturas menores que as do calor seco, e como desvantagens, não poder ser
empregado para materiais higroscópicos e exige a compra de um equipamento
especializado, a autoclave.
O calor seco, empregado para esterilização deve atingir 170 ºC por 2 horas
ininterruptas em geral. A morte celular ocorre pela oxidação dos constituintes
intracelulares por condução. Este método é empregado para vidrarias vazias e
instrumentos no laboratório microbiológico. Também pode ser utilizado para esterilizar
pós inorgânicos, tais como talco e argilas e os óleos minerais.
Este método tem como principal vantagem não deixar resíduos nos produtos e
equipamentos e não necessitar de equipamentos especiais. Suas desvantagens incluem a
possibilidade de causar alterações químicas e físicas, alem da penetração lenta e
desigual o que leva longos tempos para a realização dos ciclos de esterilização.
Um outro método físico para destruição dos microrganismos é a radiação. A
radiação pode ser ionizante (radiação gama) ou não ionizante (radiação UV).
A radiação ionizante, que utiliza como fonte o Co60, destrói o DNA dos
microrganismos, sendo utilizada principalmente para medicamentos, correlatos e
cosméticos, além de materiais primas como talco, caulim, dióxido de titânio, amido e
oxido de ferro, assim como escovas e pinceis. Todos os produtos podem ser
esterilizados já na embalagem final, já que tem alto poder de penetração e tem como
principal vantagem, o fato de não deixar resíduos. As desvantagens incluem a
possibilidade de causar alterações físicas e químicas nos produtos, alteração de
polímeros e proteínas e a utilização de um equipamento de altíssimo custo e segurança.

39
 Com relação a sensibilidade, temos que os fungos são os mais sensíveis a esta
forma de esterilização, seguidos das bactérias Gram negativas, Gram positivas, esporos,
vírus e por fim os príons.
O Co60 emite ondas curtas, que apresentam alto grau de penetração, só não
penetrando chumbo e paredes de concreto com 5 metros de largura. Age sobre os
microrganismos de duas formas principais, através dos radicais livres (efeito direto) e
através da formação de oxigênio singlet, obtido da quebra da molécula da água (efeito
indireto). A dose de radiação é calculada como a energia cedida ao material por unidade
de massa, e é expressa em Gray (Gy), que é igual a 1 Joule por kilograma de massa.
A radiação não ionizante, por outro lado, não apresenta alto poder de penetração,
apresentando uma ação apenas superficial. Este tipo de radiação causa apenas danos ao
DNA celular, e é utilizado na forma de lâmpada germicida, na desinfecção superficial
de fluxos laminares ou na purificação de água. A radiação ultravioleta tem como
vantagens a sua fácil instalação e preço acessível, porém desvantagens como a
penetração limitada e a ação subletal sobre os microrganismos fazem como este método
seja utilizado apenas como auxiliar na manutenção da baixa carga microbiana e não
como um método isolado para esterilização.
Em termos de resistência, temos que os bolores e leveduras são cem vezes mais
resistentes que as células vegetativas bacterianas, enquanto que os esporos de bactérias
são sete vezes mais resistentes que as células vegetativas.
Para a utilização correta da lâmpada germicida, devemos levar em conta as horas
de uso estipuladas pelos fabricantes, anotando o tempo em que efetivamente a lâmpada
permaneceu acessa, já que a mesma pode ainda estar acendendo porem não mais
emitindo a radiação germicida.
A filtração é um processo mecânico para remoção dos microrganismos da
amostra. Utiliza-se uma membrana de acetato de celulose com porosidade de 0,22 m.
Este processo é utilizado para produtos termolábeis, isto é, aqueles produtos que não
suportam altas temperaturas. Tem também grande aplicação no tratamento da água
purificada. Sua principal vantagem é que não deixa resíduos nos produtos, porém tem
como desvantagem o custo elevado e a necessidade de aquisição de suportes o cartuchos
especiais.
Para garantia do processo de esterilização por filtração devemos fazer alguns
controles na unidade filtrante, tais como o processo destrutivo, que utiliza uma
suspensão de bactérias Brevudimonas diminuta ATCC 19146, 107 UFC/cm2 e pressão
de 30 psi.
Valor de Redução Logarítmica = log nº m.o. desafio  7
log nº m.o. filtrado

Além deste controle, também é realizado o teste de integridade da membrana,

que é um teste quantitativo, onde se mede o fluxo difusivo. Neste teste, também
conhecido como ponto de bolha, verificamos a retenção da pressão exercida, o que
reflete diretamente o tamanho do poro. Não há manipulação do lado limpo do filtro.
Este é um processo não destrutivo, feito lote a lote. Não devemos esquecer que a
filtração é a última etapa do processo, antes do envase, portanto o filtro não deverá
alterar as propriedades do produto.
Por fim temos os métodos químicos esterilizantes, que são capazes de
destruir os micro-organimos por reações químicas especificas. O óxido de etileno (ETO)
é um dos principais agentes utilizados para este fim.

40
 O ETO age alquilando as proteínas e enzimas complexas do microrganismo,
impedindo sua sobrevivência. Tal agente é utilizado para esterilizar objetos que não
suportam calor, tais como correlatos e produtos para a saúde. Entres tais objetos estão
esponja, pincéis, placas de petri descartáveis, pipetas descartáveis, etc. As matérias
primas e fitoterápicos são proibidos de serem esterilizados por ETO no Brasil.
Os ciclos de esterilização levam em média de 7 a 9 horas, e utilizam
concentração de ETO de 500 a 750 mg/L e umidade relativa de 30 a 60 %, e
temperatura de 52 a 54 ºC. Esses são os fatores a serem controlados para garantir a
validade do processo e a penetração do gás nos produtos.
A principal vantagem deste método é a disponibilidade comercial dos
equipamentos e as baixas temperaturas utilizadas. Já as desvantagens incluem a
possibilidade de causarem alterações físicas e químicas, geração de resíduos tóxicos o
que leva a necessidade de aeração dos produtos esterilizados e a necessidade de
esquemas de segurança, já que o gás é explosivo e inflamável.
A monitorização dos processos de esterilização incluem a utilização dos
indicadores físicos, químicos e biológicos.
Os indicadores físicos podem ser os termopares conectados a registradores de
temperaturas externos, além da utilização de sistemas termolag, que indicam a
temperatura e o tempo de permanência naquela temperatura, o que gera maior
segurança. Existem também os termômetros de máxima, que são termômetros que
marcam apenas a máxima temperatura atingida durante o ciclo de esterilização.
Os indicadores químicos são tintas termocrômicas que mudam de cor quando
atingem determinada temperatura. Os indicadores biológicos são esporos de micro-
organismos que devem ser utilizados de acordo com o método escolhido.

Tabela 1: Esporos de microrganismos utilizados como bioindicador de acordo com o

método de esterilização.
MICRO-ORGANISMO MÉTODO DE ESTERILIZAÇÃO
Bacillus subtilis calor seco
Bacillus subtilis ETO
Bacillus stearothermophilus calor úmido
Bacillus pumilus radiação
Brevudimonas diminuta filtração

41
11. AULA PRÁTICA – TESTE LIMITE MICROBIANO

Objetivo: determinar o número de micro-organismo viáveis em produtos

cosméticos e comprovar a ausência de microrganismos patogênicos.

Preparação do material (cada grupo)

 2 erlenmeyer com 90mL de caldo caseína soja (TSB) contendo os
inativantes adequados.
 1 tubo de ensaio com 5mL do mesmo meio de cultura.
 260mL de Agar Caseína Soja – TSA.
 100mL de Agar Sabouraud Dextrose -SDA
 16 placas de Petri descartáveis estéreis.
 9 pipetas de 1 ou 2 mL – embrulhadas em papel craft e estéreis.
 1 pipeta de 10mL embrulhada em papel craft e estéril.
 1 espátula ou bagueta embrulhada em papel craft e estéril.
 Suspensão de Escherichia coli ATCC 10536 contendo 100UFC.
 Alça de Henle
 1 placa com meio Mac Conkey
 1 placa com meio Cetrimida
 1 placa com meio Vogel Johnson

1º Parte - INATIVAÇÃO DO SISTEMA CONSERVANTE

Objetivo: determinar qual a diluição e os inativantes químicos necessários para a

eliminação da atividade bacteriostática do sistema conservante.

Procedimento

Transferir 10g/mL do produto para o primeiro erlenmeyer com 90mL (10 -

1
) de TSB + inativante. Deste erlenmeyer transferir 10mL para o segundo
erlenmeyer (10-2) com TSB + inativante. Plaquear 1mL em duplicata de cada

42
diluição, utilizando técnica de semeadura em profundidade ou “Pour Plate”.
Colocar 100UFC da suspensão microbiana padronizada, de forma que as duas
alíquotas não se misturem. Colocar 15-20mL de TSA e homogeneizar em oito.
Esperar solidificar e incubar de forma invertida, a 30-35ºC por 48h.

Controle I – plaquear 100UFC suspensão microbiana padronizada em

duplicata +15-20mL de meio de cultura.

Controle II – plaquear 1mL do diluente + inativante (sem amostra)

em duplicata com 100UFC da suspensão bacteriana padronizada + 15-
20mL de meio de cultura.

2º Parte - CONTAGEM DE MICRORGANISMOS AERÓBIOS

MESÓFILOS VIÁVEIS (PARTE QUANTITATIVA)

Objetivo: determinar o número de microrganismo viáveis em produtos

cosméticos e medicamentos.

Procedimento

Partindo-se dos erlenmeyers anteriormente preparados (diluição 10-1 e 10-

2
) plaquear 1mL em quadruplicata de cada diluição, utilizando a técnica “Pour
Plate”. Colocar 15-20mL de TSA em duas placas de cada diluição e 15-20mL de
SDA nas outras duas placas. Homogeneizar em oito, esperar solidificar e incubar
invertido, a 30-35ºC por 48h as placas contendo TSA e 20-25ºC por 5 -7 dias as
placas contendo SDA.

3º Parte - PESQUISA DE PATOGÊNICOS (PARTE

QUALITATIVA)

Objetivo: comprovar a ausência de micro-organismos patogênicos.

43
Procedimento
Flambar a alça de Henle na chama do Bico de Bunsen. Dividir as placas de
meios de culturas específicos em duas metades. Esfriar a alça na parede dos
erlenmeyers anteriormente preparados (diluição 10-1 e 10-2 um de cada vez), retirar
alíquota da amostra e semear em superfície empregando a técnica de esgotamento
em estrias. Utilizar as placas com os meios de cultura específicos para pesquisa de
patogênicos: Vogel Johnson (S. aureus), Cetrimida (P. aeruginosa) e Mac Conkey
(E. coli).

Certificado analítico microbiológico

Produto: Lote:

Data de fabricação: Data de validade:

Sistema conservante declarado:

Inativantes empregados:

Material de acondicionamento:

Análises Especificação Resultado

Contagem de
bactérias e fungos

44
Pesquisa de S. aureus

Pesquisa de E. coli
(coliformes fecais)

Pesquisa de
coliformes totais

Pesquisa de P.
aeruginosa

CONTROLE DE SUPERFÍCIES, CONTROLE DE AMBIENTE

E TREINAMENTO DE MANIPULADORES

Importância: verificar a eficácia da sanitização de superfícies inanimadas e

conscientizar os manipuladores quanto ao uso dos EPIs.

Objetivo: determinar a carga de sobreviventes em diferentes superfícies,

regulares e irregulares, utilizando vários sanitizantes, treinar manipuladores e
fazer controle de partículas viáveis do ambiente.

Materiais:
o 2 placas Rodac ou placa de contato
o álcool 70% (v/v)
o solução de glutaraldeído 0,1% (v/v) em álcool 70% (v/v)
o álcool iodado
o algodão
o 4 placas de petri com TSA
o 2 placas de petri com SDA

45
 Procedimento
Escolher uma área na bancada, delimitando-a mentalmente. Aplicar a placa
Rodac, sutilmente e identificá-la com denominação área suja. Proceder a
sanitização com o sanitizante eleito, embebido em algodão, limpando sempre em
um único sentido. Esperar 5 minutos, para que o excesso de sanitizante evapore e
aplicar um novo Rodac, identificando-o como área limpa. Incubar por 24 - 48
horas a 30-35C.
Expor duas placas de petri contendo SDA durante o procedimento, 5-7 dias
horas a 20-25C.

Em quatro placas de Petri contendo TSA colocar cabelo, toque de dedos, tosse e
papel. Incubar por 24 horas a 30-35C.

12. Referências Bibliografia

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