Вы находитесь на странице: 1из 112

БИОХИМИЯ

МЕМБРАН
А. А. БОЛДЫРЕВ

Введение
в биохимию
мембран
БИОХИМИЯ
МЕМБРАН
П о д редакцией
А .А . Б о л д ы р ева

Книга 1
А. А. БОЛДЫРЕВ

Введение
в биохимию
мембран

М ОСКВА
«ВЫ С Ш АЯ ШКОЛА» 1986
Б Б К 28.05
Б 63
У Д К 577.1

Рецензенты:
каф едра биофизики 2-го Московского государственного медицинского ин­
ститута имени Н. И . П ирогова (зав. кафедрой проф. Ю. А. В ладим иров);
д-р хим. иаук, проф. В. И. Ш вец (ин-т тонкой химической технологии
имени М. В. Л омоносова)

Рекомендовано к печати Министерством высшего


и среднего специального образования СССР

Биохимия мембран: Учеб. пособие для биолог, и мед. спец.


Б 63 вузов/П од ред. А. А. Болды рева. Кн. 1. А. А. Болдырев. В ве­
дение в биохимию мембран. — М.: Высш. шк., 1986.— 112
с.: ил.
Н а с т о я щ е е и з д а н и е отк р ы вает п р о д о л ж а ю щ у ю с я сер и ю книг, п о св я щ ен н ы х и з ­
л о ж е н и ю со в р ем еи и о г о состоя н и я б и охи м и и м ем б р а н . Э т о п ер в о е в о т еч ест в ен н о й
л и т е р а т у р е си ст ем а т и зи р о в а н н о е и зл о ж е н и е п р обл ем б и о м ем б р а н о л о г и и , в к л ю ч а ю ­
щ е е осн ов н ы е св ед ен и я о стр оен и и б и о м е м б р а н ж и в о т н ы х , р а ст и т ел ьн ы х и б а к т е ­
р и ал ь н ы х к леток , ф ун к ц и он и р ов ан и и м ем б р а н н ы х ф ер м ен т о в и с п о с о б а х и х р е г у ­
л я ц и и . О с о б о е вни м ан и е у д е л е н о а н а л и зу принцип ов к он тр ол я а ктив ности м е м б р а н ­
ны х о л и гом ер н ы х бел к ов , о б ес п еч и в а ем о г о со стор оны и х л и п н д и о го о к р у ж ен и я .

2007020000—255 ББК 28.05


Б ------------------------ 99—86
0 0 1 (0 1 )—86 57.04

Учебное издание
Александр Александрович Болдырев
Введение в биохимию мембран

З а в . р ед а к ц и ей Л. Г. Г а в р и л о в . Р е д а к т о р А. С. О р л о в а . М л. р е д а к т о р
И. .VI. П а в л о в а . Х у д о ж н и к В. И . Х о м я к о в . Х у д о ж е ст в ен н ы й р е д а к т о р
Т. А . К о л е н к о в а . Т ехн и ческ и й р ед а к т о р Л . А. Григорчрк. К орректор
С. К. З а в ь я л о в а .

И Б № 6022

И з д . № Е -.5 0 1 . С д а н о в н а б о р 17.02.86. П о д п . в п еч а т ь 25.03.86. Т-09522.


Ф ор м ат 60X 90716. Б ум . тип. № 1. Г ар н и тур а л и т е р а т у р н а я . П е ч а т ь в ы сок ая .
О б ъ е м 7 у ел . печ. л . 7,25 уел . к р .-от т. 7,46 у ч .- и з д . л. Т и р а ж 8000 э к з.
З а к . № 133. Ц е н а 25 коп.

И зд а т ел ь с т в о «В ы сш ая ш кола», 101430, М оск ва, Г С П -4, Н е гл н н н а я у л .,


д . 29/14.

М оск овск ая т и п огр аф и я № 8 С о ю зп о л и г р а ф п р о м а при Г о с у д а р ст в ен н о м


к о м и т ет е С С С Р по д е л а м и зд а т е л ь с т в , п ол и гр аф и и и к н и ж н о й т о р го в л и ,
101898, М оск ва, Ц е н т р , Х охл ов ск и й п е р ., 7.

И здательство «Высшая школа», 1986


От автора

С овершенствование высшей ш колы диктует необходимость


концентрировать внимание на развитии тех направлений науки,
которые в состоянии обеспечить ее превращ ение в реальную
производительную силу. В соответствии с этим преж де всего
вы зы ваю т интерес новые нап равлен ия естественных наук, состав­
ляю щ ие горячие точки современной биологии. В числе этих новых
биологических дисциплин, отмеченных вниманием научной об ­
щественности,— м о лекулярн ая биология, иммунология, биотех­
нология, а в последнее время и мембранология. Отличительной
особенностью этих направлений яв л яется то, что они ф орм и ру­
ются в составе классических биологических дисциплин — био­
физики, физиологии и биохимии, но, р азр а с т а я с ь и обретая соб­
ственную зад ач у исследования, становятся самостоятельными
областям и знания.
Одновременно они становятся и самостоятельными учебными
дисциплинами. Т ак возникла и у твердилась в учебных п лан ах
университетов новая дисциплина — б иохим ия мембран.
Ф у н дам ен тал ьн ая подготовка студентов-биологов в области
мембранологии п редставляется необходимой к а к для более глу­
бокого проникновения в область биохимии и молекулярной био­
логии клетки, так и для овладеван ия методами биотехнологии и
медицинской биохимии-— тех областей, в которых биохимик м о­
ж ет обеспечить практическую отдачу наиболее быстро и э ф ф ек­
тивно. П роизводство биологически активных веществ биологи­
ческим способом, их использование для стимуляции или моди­
фикации метаболизма, понимание м олекулярных основ патологи­
ческих изменений в тканях и в ы работка рекомендаций для про­
ф илактики и лечения, выяснение закономерностей осуществления
и регуляции клеточного цикла — все эти теоретические или су­
губо практические задачи требуют подготовки специалистов-био-
химиков, сведущих в области мембранологии.
Эта н овая область биохимии изучает строение, тонкую о р га­
низацию клеточных мембран и вскры вает механизмы функцио­
нирования включенных в биологические мембраны компонентов.
В ее компетенцию входит т а к ж е исследование искусственно соз­
данны х мембран, имитирующих некоторые свойства природных
5
мембран и позволяю щих использовать достижения мембранной
биохимии в биотехнологии и медицинской практике. Изучение
мембран клетки имеет относительно небольшую историю — этой
науке не исполнилось и столетия.
Следуя «нормальной» логике исследования, открытие м ем ­
бранной организации клетки д о лж н о было непосредственно осу­
щ ествиться после установления клеточного строения тканей. О д ­
нако если этот последний ф ак т вытекал у ж е из работ М. Ш лей-
дена и Т. Ш ва н а (середина XIX в.), то концепция клеточной мем­
браны н ач ал а оформляться много позже. П ервы е представления
о строении мембраны были сформ улированы Д . Д ан и эл ли и
П. Д оусоном в 1931— 1933 гг. Р а з р ы в в логике исследований был
вызван техническими ограничениями. Недостаточно совершенная
техника микроскопирования не д а в а л а экспериментальных осно­
ваний для формирования представлений о биологических мем­
бранах.
Н а примере современного разви тия науки о м ем бранах от­
четливо видно, что успехи науки тесно связан ы с техническими
возможностями экспериментатора: важ ность выяснения биоло­
гической функции мем бран ученые осознавали у ж е давно, но
лиш ь в последние десятилетия м ем бранн ая биохимия в ы рв ал ась
на ведущее место среди других направлений биологии по глубине
понимания тонких механизмов регуляции деятельности клетки.
Современный интерес к м ембранному уровню исследований прямо
определяется совершенствованием приборных возможностей био­
химиков и биофизиков, получивших в свое распоряж ен и е тонкие
сп ектральны е приборы, методы Э П Р - и ЯМ Р-спектроскопии,
чувствительные методы калориметрического ан ал и за. Б л а г о д а р я
развитию физико-химических методов исследования наб лю д аю т­
ся впечатляющ ие успехи в исследовании свойств клеточных мем­
бран, тонких взаимодействий мембранны х компонентов, а т а к ж е
механизмов, поддерж иваю щ их мембраны в динамическом р а в ­
новесии со средой.
Биологическое значение мембран многообразно. Первое, н аи ­
более явное их свойство — способность отграничивать внутри­
клеточное содержимое от внешней среды, обеспечивая преграду
на пути веществ, стремящ ихся проникнуть Б клетку или поки­
нуть ее. М ембраны , разд ел яю щ и е клетку на отдельные компарт-
менты, т. е. обеспечивающие ее ком партментализацию , д ел аю т
возмож ны м и независимое существование, и функционирование
отдельных клеточных органелл с различны ми «задачам и». Так,
лизосомы хран ят протеолитические ферменты и обеспечивают
возможность их функционирования независимо от состояния д р у ­
гих компартментов клетки. Ядро содерж ит наследственный м а те­
р и а л — нуклеиновые кислоты; в митохондриях происходят окис­
ление субстратов и в ы работка энергии, а т а к ж е некоторые в а ж ­
ные реакции синтеза, которые не могут протекать в растворимой
части клетки — цитоплазме. М ем браны ретикулума п редставляю т
собой разветвленную сеть коммуникаций, соединяющих отдель­
6
ные компартменты. Наконец, к а к стало понятно недавно, мем­
браны обеспечивают погруженным в них белкам специальные ус­
ловия функционирования, создаваем ы е б ла го д а р я особенностям
образую щ его мембрану бислоя. Таким образом, м ем бранн ая ор­
ганизация клетки воплощ ает исключительно важ н ы й принцип
организации, присущий живой материи.
В мембраны вклю чаются белки, выполняющие специфические
и в аж н ы е функции: иммунные, рецепторные и т. д. Состояние,
реактивность и свойства этих белков в значительной степени з а ­
висят от состояния и свойств мембранной структуры, с о зд ав ае­
мой м олекулами входящих в м ембрану фосфолипидов. Изменение
микровязкости, упорядоченности, упаковки, а та к ж е состава фос­
фолипидов влияет на состояние и взаимодействие друг с другом
мембранны х белков. Так, мембраны контролируют участие в ме­
таб о л и зм е клетки гидрофобных белков, связанны х с мембранной
структурой.
Н а уровне сегодняшних обширных знаний о биологических
м ем б р а н а х можно подумать, что «основные» качества этих к л е­
точных структур у ж е установлены, и дальнейший прогресс науки
в этой области будет связан лиш ь с уточнением и кон кретиза­
цией у ж е известного фактического м атер и ал а. Действительно,
каж д ы й новый ф акт в самый первый период его осознания не­
редко выглядит мало отличаю щ имся от своих предшественников,
и мы говорим, что «новое — это хорошо забы тое старое». О днако
искусство экспериментатора состоит не только в умении сп лан и ­
ровать эксперимент и получить безупречное наблюдение, неиз­
вестное ранее. М ож ет быть, более в аж н ы м яв л яется способность
Оценить его значение. И важ н ее увидеть новое в старом, чем
старое — в новом.
Эволюция представлений о структуре, функционировании и
биологической роли мембран отнюдь не заверш илась. Сейчас
н аступила реш аю щ а я стадия исследований: накопленных фактов
т а к много, что в них стало трудно ориентироваться. Они требуют
систематизации, поскольку у ж е невозможно охватить единым
взглядом основные принципы функционирования клеточных м ем ­
бран. По этой причине за «девятым валом» научных публикаций
стали появляться учебники и учебные пособия по биохимии м ем ­
бран. Написанны е интересно, увлекательно и живо, они вполне
пригодны для создания первого впечатления о новой науке мем­
бранологии, о ее успехах и перспективах. О днако основной недо­
статок этих книг — трудность создания обобщенного пред ставл е­
ния о мембране, функционирующей ка к м олекулярн ая машина.
П о этой причине мы полагаем , что написание серии книг под об­
щим названием «Биохимия мембран» будет полнее отвечать з а ­
даче создать такое представление, поскольку к а ж д а я книга бу­
дет написана специалистом-профессионалом, работаю щ им в од­
ном из направлений современной мембранологии. П ер вая книга
этой серии д о л ж н а ввести читателя в круг проблем, на которые
эта наука сегодня нацелена. Что ж е это за проблемы?
7
Главной, по-видимому, является необходимость представлять
мембрану как целое, со всеми присущими ей свойствами и тон ­
кими механизм ами взаимодействия частей друг с другом — бел ­
ков м еж д у собой или с о круж аю щ и м и их липидами, различны х
мембран друг с другом или изменения свойств отдельных уч аст­
ков мембраны в ответ на изменение внешних условий. Это основ­
н а я цель исследования мембран. В аж ной является т а к ж е зад ач а
понять роль мембран в регуляции клеточного метаболизм а — не
того, к а к он и зображ ается на метаболических схемах, а того,
который реально протекает в трехмерном пространстве клетки,
где скорость к аж д о й реакции непостоянна во времени, но ск о­
рости всех реакций согласованы друг с другом. Наконец, необ­
ходимо установить те м олекулярные повреждения, приводящие
к болезни клеток органов и тканей, которые связаны с наруш е­
нием мембранны х функций, выяснить их природу и найти пути
устранения.
М ем бранны е процессы протекают в пространстве и времени.
И х векторность нужно учитывать при наблю дениях и соотно­
сить с состоянием и свойствами изучаемого объекта. Д е м о н с тр а ­
тивным примером такого векторного процесса является м ем бр ан ­
ный транспорт субстратов и ионов, осущ ествляемый целым « н а­
бором» взаимодействую щих между собой механизмов. Б л а г о д а р я
мембранному транспорту в клетку попадаю т нужные для м е та­
болизма субстраты и выбрасы ваю тся конечные продукты, н а к а п ­
ливаю тся одни ионы и выкачиваю тся другие. Б л а г о д а р я этой р а ­
боте ионный состав цитоплазмы отличается от ионного состава
внешней среды, Н али ч ие ионных градиентов кл етка использует
к а к источник энергии или как инструмент регуляции р азн о о б ­
разны х процессов жизнедеятельности. В основе р яд а проявлений
жизни леж и т использование асимметричного распределения од­
новалентных катионов между клеткой и окруж аю щ ей средой:
процессы водно-солевого обмена, проявление электрической а к ­
тивности клеток мозга, регуляция интенсивности реакций о б р а ­
зования белковых молекул в клетке, са м а регуляция клеточного
цикла. Понимание механизмов транспорта ионов через биологи­
ческие мембраны — один из карди н альн ы х успехов современной
биохимии мембран.
Краткая
характеристика
биологических
мембран 1

Клеточное строение тканей позволяет отграничивать живое от


неживого, контролировать взаимодействие клеток со средой и-
друг с другом, обеспечивать разделение внутреннего объема
клетки на отдельны е отсеки — компартменты. Все эти функции
выполняются биологическими мембранами. Перечень основных
структур клетки и их функций представлен в табл. 1.
Эф фективное выполнение биологическими мем бранам и р а з ­
нообразных зад ач , возникаю щих в ходе метаболизма, возможно
благодаря ун икальн ы м свойствам образую щ их мембраны ко м ­
понентов. М ем браны составлены в основном из белков и липи­
дов. У г л е в о д ы — лиш ь небольшая, хотя и очень в а ж н а я часть
мембранны х структур.

Классификация и характеристика
мембранных липидов
В составе мембраны обнаруж иваю тся липиды трех классов:
фосфолипиды, гликолипиды и стероиды (рис. II). Ф осф олипиды
подразделяю тся на глицерофосфолипиды (производные фосфа-
тидной кислоты — фосфатидилхолин, ф осф атидилэтанолам ин,
фосфатидилсерин, фосф атидилинозит) и сфингофосфолипиды
(производные церам ида, сфингомиелины).
И з рис. :1 видно, что наиболее часто встречаю щ иеся ф осф о­
липиды построены по единому плану, их молекулы стерически
хорошо «соответствуют» друг другу. В то ж е время существует
огромное число фосфолипидов, обеспечиваемое разнообразием
ж ирны х кислот, которые входят в состав их молекул. Так,
существует несколько десятков природных видов фосфатидилхо-
лина, причем д а ж е диолеилфосф атидилхолин сильно отличается
по своим свойствам от д ипальмитоилфосфатидилхолина.
Г л и к о л и п и д ы мембран представлены цереброзидами, сульфа-
тидами и ганглиозидами. Ц ереброзиды — углеводные производ­
ные ц ерам ида (их н азы ва ю т т а к ж е гликозилцерамидами или
гликосф инголипидам и). И х углеводная часть п редставлена моно-
или олигосахарами. В эритроцитах человека больш ая часть гли-
9
| г3.—I}-«О—С} Ч> г -'Г)•—П—Ч1—С)—С)—
'л-оЛ I.-ЛI Л-л -Л!л.. ! ! ^. (.-=•.! Ч-.
•К \ <V )' * I? ГI)—'п—
. 1—2—О—П—О—-О—О—П^Ч>о^
г \оI—п—п—п—п—п—п—п—
у-' V•:1 ' Г ^ К"'Г"л V ' 1

^ Л —Ог—Л|V*О—О-— I* г.:*Гг)—О—пх'' *п( ' Г—


I’
\ п_ о / /•.. | . / 1;•... ( . | . I. \ . | _ | . | . \
' /) и Г Iу-'Г - : I “ч - I м.-- Iэ пг
•; =К р —О—О—-О
I V— —л — о —«о*—о —•о——г.— п- —о -
—о—ГГ

.■■■' I' 1 'п—о-—


о '—о—о-— I' I о—‘Г—г ■1' ■■■:
г *•;! г'—-г—о--

: ''Л / \ ' с| 1 о-’ 'Г г) / Ч ' \Йг'1 VI ; 'I VI?


\ Р ~ П\ > 0 —-о - 0 - < л \ 0; д ^ Г - . ). у ! !.=:. !г ! ! •••
/ о—о /Ч. • I ^

" > 4 /^ .
*•••’*Ч I г

, \П —П Г>—П п—Г)—п—п о о—п


:х —А—I'. А_о/ I.... | . \ . \ ...•;! .
■’я гО 'Г 'Т А П 'Т Г Г
-я—О 2—п—П—о —‘-о—о—г <Г > ОУ-Р^
..я ^ I -. А. -.. . I
\ о 1
:х—о—я

1 ' 1' I )—о--О


\ / ------о —о—п—о—Г т 1—о—Г1У—П—
■*■;Л-
] ■.
г>о/ >■-. I. ! л-.! ! л..!. л. !г .!. |:
о — о—с —п)—п
—Л л' :. || —п—о-—
л— Л--
л —’-п— л —•лО— Л
п — .Л
л ~ пЛ—:л—
Л Лл~-
т."Г. ! ! :•...!...•;!:•...!. .!.

■I■ I ‘г' IV•■г I ■г IV-■■г* 1


л —о—Л:—о—п—о—л*—о—л*—г*
Г о 1 / Г ^ I О-- !
■) 'о • • г Г д ]Г г-л л г л г л
♦.С/|
Н а и м ен е е
упорядоченная
об ласть
б ислоя

Об лас 1 ь ,
упор яд о чи ва­
емая
холестерином

Облас1 ь
п о л я рн ы х
голов
•. н-

Рис. 1. Химические формулы наиболее часто встречающихся мембранных ли­


пидов:
1 — ф о с ф а т и д и л эт а н о л а м и н , Ф э; 2 — ф о с ф а т и д и л с е р и н , Фс; 3 — ф о сф а т и д и л и н о зи т , Фи;
4 — ф о с ф а т и д и л х о л и н , Ф х; 5 — к а р д и о л и п и н , Кл; 6 — с ф и и го м и ел и н , См; 7 — ц ер еб р о -
зн д . Цр; 8 — х о л е ст ер и н , Х л; 9 — уп а к о в к а м о л ек у л ы х о л е с т е р и н а м е ж д у д в у м я м о л е­
к ул ам и ф о сф о л и п и д о в
Т аблица 1. Структурные компоненты клетки и их основные функции

К о м п о н ен т ы клеточной
стр ук тур ы Б и о л о ги ч еск а я р о л ь

П лазматическая мем­ Обеспечивает диффузионный барьер, активный


брана транспорт ионов н метаболитов, электрическую
возбудимость и проч.
Эндоплазматический
ретикулум:
гладкий Обеспечивает детоксикацию ядовиты х ве­
ществ, синтез фосфолипидов и стероидов
шероховатый Покрыт рибосомами, осуществляющими постав­
ку белка, который транспортируется эидоплазм а-
тнческой сетью в различные отделы клетки
А ппарат Гольджи О сущ ествляет секрецию и хранение «упако­
ванных» белков и биологически активных ве­
ществ
Лнзосомы С одерж ат более 50 ферментов, обеспечивающих
реакции распада белков, углеводов, ж иров и
нуклеиновых кислот; участвую т и фагоцитозе
и эндоцитозе
Фагосомы О бразую тся путем замы кания плазматической
мембраны; включают частицы, захваченные из
окружаю щ ей среды
Микросомы П редставляю т собой фрагменты мембран р а з­
личного происхождения, образующиеся в процес­
се гомогенизации клеточного материала и диф ­
ференциального центрифугирования. Морфологию
мембран можно установить по маркерным фер­
ментам
Митохондрии П редставляю т собой мембранные органеллы,
осуществляющие превращения жнриых кислот и
их фрагментов, продуктов обмена углеводов и
аминокислот; специализированы на образовании
АТФ
Перокснсомы С одерж ат ферменты окисления
Я дерная оболочка О круж ает ядерный материал, состоит из внеш ­
ней н внутренней мембран, имеет поры, через ко­
торые Р Н К мож ет проникать из ядра в цито­
плазму
М икрофиламенты Составляю т основу цитоскелета, прилегающего
(микротрубочки и мик­ к мембране с цитоплазматической стороны; соз­
рофибриллы) даю т опорную конструкцию клетки, препятствуют
резким нзменеиням ее объема; противодействуют
образованию небислойных структур в фосфоли-
пидном матриксе

колипидов представлена глю козилцерамидом, галактозилглю ко-


зилцерамидом, дигалакто зи л глю к озил ц ерам ид ом и его Ы-аце-
тилгал актозам и новы м производным. Гликолипиды, в которых
углеводн ая часть вклю чает разветвленны е цепи, встречаю тся
реже.
Ц ереброзиды являю тся нейтральными соединениями. И х
сульфоэфиры, образованны е при участии О Н-группы угл евод ­
ного компонента, назы ваем ы е сульфоцереброзидами или сульфа-
тидами, имеют ярко вы раж енны й кислый х арактер.
12
Гликолипиды, концевые остатки углеводного скелета кото­
р ы х представлены Ы-ацетилнейраминовой кислотой, н азы ваю т
ганглиозидами.
Стероиды мембран, построенные на основе стеранового ске­
л е та , представлены в основном холестерином (у ж и вотны х), си-
тостерином и стигмастерином (ш ироко распространен у высших
р ас тен и й ), эргостерииом (у грибов) и тетрахименином (найден
у тетрахим ены ).
К роме указан ны х липидов существуют и менее широко р а с ­
пространенные соединения своеобразной структуры. Таковы
п лазм алогены , в молекулах которых к 1-му углеводному атому
глицерина присоединена не ацильная, а альдегидная группа; ди-
фосф атидилглицериды, основной представитель которых кардио-
лип и н яв л яется непременным компонентом митохондриальны х
мембран; диольные фосфолипиды, молекулы которых вместо гли­
церина содерж ат этиленгликоль или пропандиол. С одерж ание
диольных фосфолипидов резко возрастает при увеличении функ­
циональной активности клетки (в созреваю щ их семенах, регене­
рирую щих кл етках печени и т. д .). У р я д а бактерий и грибов об­
н ар у ж е н ы орнитинолипиды — производные 3-окси-жирной кисло­
ты и орнитина (иногда л и зи н а).
И фосфо-, и гликолипиды вклю чаю т в состав молекулы ж и р ­
нокислотные рад и калы . Холестерин и его аналоги т а к ж е способ­
ны об р азо вы вать эфиры с разн ообразн ы м и жирным и кислотами,
используя д л я этого Сз-гидроксильную группу циклопентанпер-
гидрофенантренового кольца. Ввиду большого разн оо б рази я
ж и р н ы х кислот, входящ их в состав мембранны х липидов
(табл. 2 ), образую щ иеся при этом соединения исключительно
разн оо б р азн ы .
При всем разн ообрази и жирны х кислот преобладаю щ ими
яв л яю тс я обычно две или три из них. В высших растениях при­
сутствую т в основном пальмит иновая, о леи н о ва я и л и н о л е в а я
кислот ы (стеариновая почти не о б н а р у ж и ва ет ся ), а кислоты с
четным числом атомов угл еро д а от 20 до 24 встречаю тся крайне
р ед к о (з а исключением эпидермиса листьев). В то ж е время не­
которые растения со д ер ж ат весьма необычные ж ирные кислоты:
слож ноцветны е (например, м а р га р и т к и )— ацетиленовые жирные
кислоты, бобы клещ евины — оксикислоты и т. д.
В организме ж ивотны х кроме пальмитиновой и олеиновой
ки слот со д ерж атся большие количества стеариновой кислоты,
а т а к ж е и более вы сокомолекулярные кислоты с числом атомов
угл ер о д а 20 и более. К ак правило, они имеют четное количество
ато м о в углерода; ж ирны е кислоты с нечетным числом атомов
в стречаю тся только в составе цереброзидов и ганглиозидов. Н е ­
н асы щ енны е ж ирные кислоты со д ер ж ат двойные связи почти
всегда в цис-конформации. У бактерий полиненасьпценные ж и р ­
ные кислоты, как правило, отсутствуют, но встречаю тся р а з в е т­
вленные, окси- и циклопропансодерж ащ ие кислоты. Д л я их м ем ­
б р а н т а к ж е характерно более высокое содерж ание свободных
13
ж и рн ы х кислот, которые в м ем бр ан ах растений и животны х со­
д е р ж а т с я в исчезающе малы х количествах.
Таблица 2. Распространенные жирные кислоты в составе
мембранных лнпидов

М о л ек у л я р ­ Т ем п ер а т у р а
С о ед и н ен и е Т р и в и ал ь н ое н а зв а н и е н ая м а сса , п л а в л ен и я , -С
Д2

С 12:0 1 Л ауриловая 200,3 44,2


Сн:0 М иристиновая 228,4 53,9
С 16:0 Пальмитиновая 256,4 63,1
Сп:0 М аргариновая 270,4 61,3
С18:0 Стеариновая 284,5 69,6
С2о:0 А рахнновая 312,5 76,5
622 :0 Бегеновая 340,6 81,5
С24:0 Лигиоцериновая 368,6 86,0
616:1 (7) Пальмитооленновая 254,4 —0,5
618:1 (9с) Олеиновая 282,5 13,5
С18:1 (9<) Эланднновая 282*5 44,5
С ,8:. (7) Вакценовая 282,5 44,0
С24:1 (9) Нервоновая 366,6 42,5
С 18:2 (9, 12) а-Л инолевая 280,5 —5,0
С 18:8 (9, 12, 15) а-Л иноленовая 278,4 — 10,0
С 20:4 (5, 8, 11, 14) А рахидоновая 304,5 —49,6
С22:5 (7, 10, 13, 16, 19) К лупанодоновая 330,5 —45,0
С22:6 (4, 7, 10, 13, 16, 19) Д окозагексаеновая 328,5 —44,1

1 В к л а сси ф и к а ц и и ж и р н ы х к и сл от в с л е д з а ч ислом у г л ев о д н ы х а т о м о в ч е р е з д в о е ­
т о ч и е у к а зы в а ет ся к ол и ч еств о д в ой н ы х с в я зе й , в с к о б к а х — н ом ер п ер в о го и з у гл е р о д о в
при д в о й н о й св я зи , сч и тая о т С О О Н -гр уппы ; и н о г д а у к а зы в а ет ся т а к ж е тип дв о й н о й
св я зи — ц ис (с ) или транс (I).
2 П о М е ж д у н а р о д н о й си с т е м е С И м о л ек у л я р н а я м асса и зм ер я ет ся в а том н ы х е д и ­
н и ц а х м а ссы , а. е . м . В б и о л о г и и о б щ е п р и н я т о и зм ер ен и е м ол ек у л я р н о й м а ссы в д а л ь -
т о н а х , Д , или к и л о д а л ь т о н а х , к Д .

Синтез 116— 18-углеродных ж и рн ы х кислот осущ ествляется в


цитоплазме, причем д л я об разован ия углеродного скелета с чет­
ным количеством атомов используется ацетил-КоА, а нечетных —
пропионил-КоА. П о этой причине в ткан я х эмбрионов животны х,
где содерж ится много пропионата, синтез ж и рн ы х кислот с не­
четным числом атомов углерода более вы раж ен, чем в ткан я х
взрослы х организмов. Разветвл ен ны е жирные изокислоты о б р а ­
зую тся с использованием изобутирил- (д л я четного ряд а) или
изовалерил- (для нечетного ряд а) коэнзима А. В образовании
антеизо- (нечетных) ж и рн ы х кислот вовлекается изолейцин.
Удлинение жирнокислотных цепей осущ ествляется ферм ент­
ными системами эндоплазматического ретикулума при участии
Н А Д Ф Н и малонил-КоА. Процесс удлинения мож ет протекать
та к ж е и в матриксе митохондрий. О бразован и е двойных связей
происходит под влиянием десатцраз. П е р ва я д есатурац ия осу­
щ ествляется в цитозоле, в результате чего стеароил-К оА п р ев р а­
щ ается в олеил-КоА, способствующий образованию линолевой,
линоленовой, арахидоновой и других полиненасыщенных ж и р ­
ных кислот. У ж ивотны х превращ ения олеил-КоА в линолеил-КоА
14
не происходит, вследствие чего линолевая, линоленовая и а р а -
хи дон о вая кислоты являю тся д ля них незам еним ы м и.
М ононенасыщенные ж ирны е кислоты являю тся т а к ж е субст­
р ата м и д л я образован ия циклопропановых кислот, в ходе кото­
рого по месту двойной связи к их м олекулам присоединяется д о ­
полнительный углерод из 5-аденозилметионина. Перегруппиров­
к а промежуточного продукта, получаю щ егося в этой реакции, с
последующим его восстановлением Н А Д Ф Н приводит к о б р а зо ­
ван ию жирной кислоты с разветвленной цепью.
В виду высокой скорости обмена мембранны х липидов синтез
м ем бранны х компонентов постоянно требует большого количест­
в а ж и рн ы х кислот д л я об р азо в ан ия диацилглицеридов. И з них
о б р азу ю тся фосфатидная кислота, л е ж а щ а я в основе обмена
фосфолипидов, или галакт озилдиглицерид , приводящий к глико­
л ип и д ам . Ж и р н ы е кислоты вклю чаю тся т а к ж е в обмен сф инга-
н и н о в ы х соединений, приводящий к образованию церам ид а и
сфингозина. В обмен стероидов ж ирные кислоты вступают на
последних стадиях, когда становится возможны м о б разован ие
эф иров холестерина и его аналогов. А цилирование при этом про­
те к а е т при участии специального ферм ента лецитин-холестерин-
ац и л тр ан сф еразы , а ацильная группа, используемая д л я о б р азо ­
в а н и я эф и ра холестерина, происходит от молекулы фосфатидил-
хо л ин а (лецитин), из которой при этом образуется лизолецитин.
Х арактеристика липидного состава некоторых мембран ж и ­
вотных п редставлен а в табл. 3 и 4.
И з таб л . 3 видно, что основными липидами мембран ж и в о т­
ных клеток являю тся ф осф ат идилхолин и фосфатидилэтанол-
ам ин. Гликолипиды в большом количестве присутствуют в мем­
б р а н а х миелина; в фотосинтезирующих л а м е л л а х хлоропластов
основным компонентом т а к ж е являю тся гликолипиды: диацилга-
л актози л гл и ц ери д (4 5 % ), диацил д игал актози л гл и ц ер и д (30% )
и диацилсульфоквиновозилглицерид ( 8 % ). С ледовые количест­
в а фосфолипидов представлены л иш ь фосф атидилглицерином,
со д ер ж ащ и м необычную жирную кислоту —-транс-гексадецено-
вую.
Аналогичен липидный состав мембран водорослей (хотя у
них не встречается транс-гексадеценовой кислоты) и ц и а н о б ак ­
терий. В то ж е врем я мембраны других растительны х органелл
со д е р ж а т в основном те ж е липиды, что и мембраны животных
клеток. Главной особенностью их являю тся низкое содерж ание
или полное отсутствие сфингомиелина и высокий уровень поли-
ненасы щ енны х ж ирны х кислот.
Особенности липидного состава бактерий часто используют
д л я их классификации. Д ел ен ие их на грамотрицательные и грам-
полож ительные основано на отсутствии или наличии окраски по
Г р ам у генцианфиолетовым (реактив, содерж ащ ий сафранин с
кристаллическим иодом) в соответствии с наличием или отсутст­
вием в составе клеточной стенки пептидогликанов и тейхоевых
кислот. Особенностями строения бактериальной оболочки объ-
15
Таблица 3. Липидный состав некоторых биологических мембран,
/о различных липидов от общего их количества

Э ритро­ М иелии М итохонд­


Л ипид циты ч е­ рии с е р д ­ е. сои
челов ек а
л ов ек а ц а бы ка

Ф осфатидная кислота 1,5 0,5 од> О


Фосфатидилхолин 19,0 ЮД> 39,0 О
Фосфатидилэтаноламин 18,0 2 ОД) 27,0 65
Фосфатидилглицерин 0,0 0,0 0,0 18
Фосфатидилинозит 1,0 1,0 7,0 0
Фосфатидилсерин 8,5 8,5 0,51 0
Кардиоляпин 0,0 0,0 22,Э 12
Сфингомиелин 17,5 8,5 0,0 0
Гликолипиды 10,0 26,0 0,0 0
Холестерин 25,0 26,0 3,0 0

ясняется и тот ф акт, что на грам полож итёльны е бактерии дей­


ствует пенициллин, а на гр ам о т р и ц а те л ь н ы е — стрептомицин.
Г рам полож ительны е бактерии (например, В . т е§а1егш т ) со­
д ер ж а т, в основном кардиолипин, фосф атидилглицерин и фосфа-
тидилхолин; ж ирные кислоты в составе липидов представлены
соединениями с нечетным количеством атомов углерода и с р а з ­
ветвленными цепями. Грам отрицательны е бактерии (Е.соН) со­
д е р ж а т не фосфатидилхолин, а ф осф атидилэтанолам ин, имеют
ж ирны е кислоты с четным числом атомов углерода, а в составе
гликолипидов о б н а р у ж и ва ю т оксикислоты. Обе группы бактерий
относятся к эубактериям, или истинным бактериям.
Галоф ильны е солелюбивые, термофильные и метаногенные
бактерии т а к сильно отличаются от эубактерий по целому ряду
признаков, что в настоящ ее время их выделяю т в отдельную
группу архебактерий. П олагаю т, что они являю тся представите­
лям и наиболее древней ветви ж и вы х существ. Все они со д ерж ат
м а л о холестерина и много глико- и сульфолипидов.
С о лелю б и вы е бактерии Н а1оЬас(егш т со д ерж ат в составе л и ­
пидов вместо жирных кислот т ак назы ваем ы е фитанильные
Сго-соединения, вклю чаю щ ие четыре ответвления метильных
групп. Они соответствуют фитольным группам хло роф и лл а после
насыщ ения всех их двойных связей. Особенно интересным, хотя
и неясным по сути, фактом является то, что структура липидов
галофильны х бактерий представляет собой зеркальн ое о т р а ж е ­
ние тех липидов, с которыми встречается исследователь, ан а л и ­
зирующий липиды ж ивотны х клеток (рис. 2 ).
Фитанильные фосфолипиды о б ладаю т такой ж е стереоконфи­
гурацией, аналогичным расположением зар я д о в в полярных го­
л о в ах и образую т типичные липосомы в смеси с гликолипидами..
Получаю щ ийся при этом бислой о казы вается более плотно у п а­
кованным и об нар уж и вает повышенную стабильность против
действия кислорода, влияния кислот и щелочей. Такие особен­
16
ности липидного состава объясняю т повышенную неприхотли­
вость галофильны х бактерий.
Т ерм оацидоф ильны е и мет анобразую щ ие бактерии, ж ивущ ие
в сточных водах, со д ер ж ат в составе фосфолипидов мембран

Г—О—СИ.
СПОК
I ■
С—О— С—Н 0 Н— С — о н

сн,—о—р—о—сн,
I
о-
0~
I I 3
С1Ь—О—Р—о—сн .

Рис. 2. С труктура некоторых лнпн-


дов. А — сравнение строения днацил-
и дифнтанилфосфатидилглицеринов;
Б —■образование тетраэфнров нз двух
производных дифнтанилглицерина;
В — представитель бифитанилтетра-
эфира метаиогенных бактерий

сомкнутые метильными концами дифитанильны е глицероэфиры:


бифитанильные диглицеротетраэфиры (см. рис. 2). Это создает
повышенную прочность бислоя, способного сопротивляться как
действию высокой температуры, т а к и растворяю щ ем у эффекту
метана. Интересно, что такие бифитанильны е молекулы с п оляр­
ными головами разной природы сами по себе будут за д а в а т ь
асимметричное строение бислоя, в котором различны й набор
полярных голов по обе стороны гидрофобной сердцевины мем­
браны определяется структурой входящих в ее состав соедине­
ний. При этом, ка к правило, с внутренней, цитоплазматической
17
стороны бислоя оказы ваю тся молекулы глицероф осфата, а с
внешней-—м о л е к у л ы глицерина, к которым прикрепляются угле­
водные компоненты (см. рис. 2 ).
Н астоящ ей сенсацией явилось обнаруж ение в 1964 г. того
ф а к т а , что диатом овы е водоросли содер ж ат сульфолипиды, ана-
Таблица 4. Жирнокислотный логичные по строению фосфолипи­
состав фосфолипидов дам , но с зам еной атом а N на атом
эритроцитов человека 5. По-видимому, эти водоросли сп о ­
собны производить сульфохолин из
Жирная цистеина и метионина, что, по пред­
к и сл о т а Фх Фэ Фс См
положению М. Кейтса, о б н а р у ж и в ­
шего эту особенность диатомовых
С1б:0 34 29 14 28
С18:0 13 9 36
водорослей, и д ел ает их несъедоб­
7
С 18:1 22 22 15 6 ными д л я морских организмов.
С1В:2 18 6 7 2 Ж ирнокислотны й состав мем­
Сго:4 6 18 21 8 бранных липидов животных в отли­
Сг4:о — — — 20
чие от бактериальных и р асти тел ь­
Сг4:1 — — ■
— 14
ных организмов не т а к своеобразен,
но более вариабелен. И з табл. 4
видно, что разны е липиды об л а д а ю т различным ж и рн оки слот­
ным составом. Систематические исследования показы ваю т, что
специфика этого состава сохраняется т р и условии неизменности
среды обитания, преимущественного х а р а к т ер а питания и т. д.
Так , д л я жирнокислотного состава фосфатидилхолинов типич­
ными являю тся пальм итиновая и пальм итоолеиновая кислоты,
а д ля ф осф ати ди лэтанолам ин а — еще и арахидоновая; сфинго-
миелин, как правило, содерж ит ж ирные кислоты, более ненасы ­
щенные, чем фосфатидилсерин и т. д. П оскольку все фосфолипи­
д ы являю тся продуктами обмена фосфатидной кислоты, можно
заключить, что именно ж ирнокислотный состав ее молекул будет
определять, какой вид фосфолипида образуется из этого п р е д ­
шественника в д ан ны х условиях.
И зменение состава диеты, особенно ее липидной части, быстро
приводит к изменению липидного состава мембранны х структур.
Так, д л я крыс показано, что в озрастани е в пище жирных кислот
с ненасыщенными связями увеличивает жидкостность мембран
мозга, печени и слизистой кишечника, приводя к изменению со­
отнош ения фосфолипидов к сфинголипидам, а т а к ж е липидов к
б елкам .
С мена условий среды обитания при переходе к зимней спячке
у гибернирующих животных, при изменение: солености воды у
проходных рыб и т. д., влияя на гормональный обмен, т а к ж е
изменяю т жирнокислотны й состав мембранных липидов, приспо­
сабл и в ая свойства мем бран к условиям среды и новым потребно­
стям организма. Гипотеза адаптационной р о л и м ем бран ны х л и ­
п ид о в была выдвинута и обоснована Е. М. Крепсом (1981): н аи ­
более резкие разли чи я в жирнокислотном составе при сравнении
мембран мозга рыб разных сред обитания об наруж и ваю т гангли-
озиды. В них ж е наиболее быстро об наруж и ваю тся изменения в
18
наборе ж и рн ы х кислот при смене температур и глубины об ита­
ния: понижение температуры и увеличение глубины синергично
повышают содерж ание полиненасыщенных ж и рн ы х кислот в со­
ставе ганглиозидов. В то ж е время изменений насыщенности
жирнокислотных р ад и кал о в сфингозинового основания не н аб л ю ­
дается. Ц ереброзиды и сульф атиды адаптационной изменчивости
не проявляют.
Обмен холестерина в организме связан с образованием и в з а ­
имопревращ ениями целого ряд а биологически активных веществ,
в частности ж елчных кислот. В организм человека холестерин
поступает с пищей и всасы вается в кишечнике (300— 500 м г/сут).
Кроме того, в дополнение к потребляемому с пищей в печени
синтезируется 700— 1000 мг/сут холестерина. Источником его я в ­
ляю тся ацетил-КоА и малонил-КоА, обеспечиваю щие о б р азо в а­
ние р-гидрокси-р-метилглутарил-КоА, который затем восстанав­
л ивается в мевалоновую кислоту под влиянием гидроксиметил-
глутарил-К оА -редуктазы . Этот фермент контролируется холе­
стерином — повышение содерж ан ия холестерина в клетках
печени п одавляет ка к активность, т а к и новообразование гидро-
ксиметилглутарил-К оА-редуктазы . Н едостаток холестерина сни­
мает тормож ение этой реакции. И з мевалоновой кислоты о б р а ­
зуется сквален, и, начиная с этой стадии, возникаю щ ие соедине­
ния абсолютно гидрофобны, их присутствие в водной ф азе воз­
можно лиш ь в комплексе со стеринпереносящими белкам и
(А. И. Климов, 1983).
П ревращ ен и я холестерина, описанные ниже, протекают в мем­
б р ан ах эндоплазматического ретикулума печени.
С квален

*
Ланостерин

Д есчос(ерии— ► Ж елчны е к и с л о т

/-Д егидрохолесгернн
I
Холесюрин

I
Холекальииферол

Эргостерин
I
Эргокал ы ш ф ер ол
Прсгненолон

О к с и п р е г н е н о л он

1
Т ес гостерон Кортизол

I
Эсгралиол
I
Кортизон

В процессе обмена холестерина возникает возможность об­


разован и я витаминов группы Э (холекальциферол и э р го к ал ь ­
циферол), половых гормонов, м и н ер ал о к о р г и к о и д а—• альдосте-
рона, глю кокортикоида — кортизола, антивоспалительного ф а к ­
тора — кортизона. Р а с п а д холестерина приводит к образованию
19
ж елчн ы х кислот: холевой, таурохолевой и гликохолевой. Высокое
с од ер ж ан и е холестерина в м ем бран ах р ассм атри в ал и ранее как
зап асн у ю форму этого важ н ого метаболита. И сследовани я по­
следних 25 лет п оказали, что в составе мембран холестерин иг­
рает важ н у ю роль модиф икатора бислоя, регулируя упаковку и
контролируя подвижность его компонентов.

Рнс. 3 . Фосфолипидный бислой (заш трихована область полярных


голов, насыщенная водой)

Основную (структурную) роль в мембранном бислое играю т


ф осф олипиды (рис. 3). Минорные компоненты мембран, иногда
весьма необычного строения, выполняют своеобразны е функции.
Так, обнаружено, что сульфатиды мембран мозга ответственны
з а рецепцию опиатов (К.-А. Ка1гззоп, 1982), а га н гли о зи д ОМг
выступает как природный рецептор холерного токсина. П ри св я­
зы вани и одной из субъединиц этого токсического белка с у ч а с т­
ком мембраны, сод ер ж ащ и м олигосахаридны с цепи молекул ган-
глиозида, инициируется высвобождение другой субъединицы
токсина, активирующей аденилатциклазу. В этом и заклю чается
основное м олекулярное действие холерного токсина, приводящ ее
к неуправляем ой н араб отке циклического АМФ.
Природной функцией мембранны х га н гли о зи д о в является
участие в дифф еренцировке нейрональной ткани — особенно в ы ­
соко их содерж ание в сером веществе головного мозга; ганглио-
зиды других клеток, в том числе лимфоцитов, определяю т видо-
20
специфичность и регулируют межклеточные контакты. Н а к а п л и ­
вается все больше фактов, характеризую щ их роль различны х
гликолипидов в функции иммунокомпетентной системы организ­
ма. При определенных состояниях организма некоторые ганглио-
зи ды могут являться м одуляторам и иммунного ответа: высво­
бо ж д аяс ь с поверхности форменных элементов крови в среду, они
способны блокировать дей- Таблица 5 Время полужизни липидНЫХ
ствие клеток-киллеров, на- компонентов мембраны
пример, при опухолевом
росте (Э. В. Д ятл о в и ц ка я, В рем я п олуж и зн и
в со с т а в е
1984). Н а фоне снижения К ом п он ен т
иммунной реакции о рган и з­ м ем бран ы
митохонд­
м и ел н н а ,
м а создаю тся более удобные м ес р и ал ь н ы х
м ем бран
условия для развития опухо­
ли. В модельных системах Цереброзиды 13 2 мес
т ак и м действием, ка к о б н а­ Сфингомиелии 10 1 »
ружено, об л а д а ю т ганглио- Фосфатидилхолин 2 2 недели
зиды О М 3 и СЮз. Увеличение Ф осф атидилэта­ 7 4 »
ноламин
содер ж ан ия свободных форм Фосфатидилсерин 4 3 »
этих соединений сн и ж ает з а ­ Фосфатидялинозит 1 2 дня
щитные возмож ности о р г а ­
н изм а. Все мембранны е ком­
поненты многократно обмениваются в течение жизни клетки
{табл. 5), время их ж изн и зависит от интенсивности функциони­
рования мембраны.

Мембранные белки

Гидроф обны е белки б лагодаря особенностям своей структуры


л е г к о встраиваю тся в фосфолипидный бислой. Д л я этого необ­
ходимо, чтобы температура среды бы ла выше критической тем ­
пературы (Гкр) для данного бислоя. Взаимодействие белка с
фосфолипидной мембраной осущ ествляется в несколько стадий.
С н а ч а л а происходит адсорбция б елка на поверхности бислоя.
Э то изменяет конформацию белковой глобулы и индуцирует в о з­
никновение гидрофобного контакта м еж д у белком и ацильными
цепями фосфолипидов. З а т е м белок внедряется в бислой. Г лу­
бина внедрения зависит от силы гидрофобных взаимодействий и
от соотношения гидрофобных и гидрофильных областей на по­
верхности белковой глобулы.
Гидрофильные области бел ка взаимодействуют с примембран-
ным слоем по одну или обе стороны мембраны. Т аким образом,
белковая молекула фиксируется в бислое с помощью в заи м од ей ­
ствий двух типов — электростатических (на уровне полярных го­
л о в фосфолипидов) и гидрофобных (в толще б ислоя). Такие
белки рассм атр иваю т к а к интегральный компонент мембраны .
М ем бранны е белки могут вклю чать в свой состав липидные или
углеводные фрагменты. Особенно велико содерж ание гликопро­
21
теинов в цитоплазматических м ембранах. У глеводная часть их
выступает н ар у ж у с внешней стороны мембраны.
П ериф ерические белки мем бран отличаются от интегральны х
меньшей глубиной проникновения в бислой и более слабыми бе-
лок-липидными взаимодействиями. И нтегральны е белки, к а к сле­
дует у ж е из самого их названия, т а к тесно связаны с мембранным
бислоем, что изменение состоя­
ния этих белков передается на
окруж аю щ и е их липиды. Д е л е ­
ние мембранны х белков на пе­
риферические и интегральны е
определяется их структурой,
количеством гидрофобных ам и ­
нокислот и их расположением
в первичной структуре, т. е.
всеми теми свойствами, кото­
рые определяю т характер в за и ­
модействия белка с бислоем.
Периферические белки о к а зы ­
ваю т менее значительное воз­
Рис. 4. Монотопическаи (Л ), битопи- действие на состояние и по­
ческая (Б ) и политопическая (8 ) д виж ность сецильных цепей
локализация белков в мембране фосфолипидов. Напротив, под­
вижность липидов, непосредст­
венно примыкаю щ их к инте­
гральны м белкам мембраны, — а н н у л я р н ы х л и п и д о в, сильно ог­
раничивается вследствие их взаимодействия с белковой м олеку­
лой. А ннулярны е липиды часто н азы ва ю т связан ны м и (см. н и ж е ).
П о х ар а к тер у взаимодействия белка с мембраной белки под­
разд ел яю тся т а к ж е на монотопические, битопические и политопи-
ческие (рис. 4). М онот опические б ел к и относятся к перифериче­
ским белкам, а би- и полит опические — к интегральным. П р и ­
мером битопического белка яв л яется гликофорин, политопиче-
ских — транспортные АТФ азы, бактериородопсин.
Ф ункциональная активность мембранны х белков оп р ед ел я­
ется их высокой конформационной лабильност ью . В основе этого
свойства лежит способность белковой молекулы осущ ествлять
конформационный переход из напряженного состояния в р а с ­
слабленное и обратно, что приводит к изменению третичной, а ч а ­
сто и четвертичной структуры белка и изменяет взаимодействие
белковых молекул друг с другом. Э н ергия конф орм ационного пе­
рехо да белков в мембране зависит от плотности упаковки {мик­
ровязкость) мембранных липидов, состояния окруж аю щ и х белок
липидных молекул.
Аннулярные липиды по своему поведению и подвижности от­
личаю тся от суммарного липидного бислоя. Д л я р яд а белков
«подходящие» аннулярные липиды — те, которые являю тся более
жидкими, или, по крайней мере, содерж ат большое количества
ненасыщенных жирных кислот в цис-конфигурации, обеспечива­
22
ю щ их более рыхлую упаковку окруж аю щ его слоя. В других сл у­
чаях, наоборот, белковые молекулы ограничивают подвижность
«прилипающих» к их поверхности липидов, и аннулярный слой
о к а зы в ае тся более упорядоченным, заторм ож енны м в своей по­
дви ж н ости .
Анализ белок-липидных взаимодействий в мембране позволя­
е т выделить контакты четырех основных типов (рис. 5). Н аибо-


в
I
^ 4^)

Рис. 5. В ы званная белком модификация бислоя. А — локальные изменения


упаковки бислоя; Б — модификация поверхиостиого моиослоя периферическим
белком, сопровож даю щ аяся обратимым изменением формы и подвижности
белковой молекулы в мембране; В — локальное искривление бислоя; / ' —
изменение виутреииего давления бислоя, сопровож даю щ ееся неравномерным
растяжением и сж атием отдельных частей (по Е. З а с Ь т а п п е! а1., 1984)

л е е часто распространен случай, когда внедряю щ ийся в бислой


б ел о к вызы вает локальное возрастание упорядоченност и анну-
л яр н о го сло я — так действуют пептидный ионофор — грам и ц и ­
дин, бактериородопсин и многие другие интегральные м ем бран ­
ные белки.
Периферические белки, проникающие не на всю глубину, би­
слоя, вызы ваю т эласт ическую деф орм ацию одной его стороны.
Т а к о е влияние на физико-химические парам етры бислоя х а р а к ­
теризуется определенным дальнодействием. Именно им опреде­
ляется облегчение взаимодействия мембранных рецепторов с
гормонами типа инсулина.
Я рко в ы р а ж ен н ая гидрофобность белка мож ет привести к
резкому изменению градиента кр и ви зн ы и деформировать бислой,
к а к это имеет место в случае взаимодействия с мембраной цито­
23
хрома 65. Наконец, сочетанйе гидрофильных и гидрофобных
свойств белковой молекулы мож ет обеспечить не только проник­
новение белка через бислой, но и существенное давление на негог
приводящее к изм енению геометрии б и с л о я —-сж и м ан ию одних
частей и уширению других (например, гликофорин). Р азн ы е при­
меры взаимодействия белка с мембраной приведены на рис. 5.
М ем бранны е белки выполняю т различные функции. Н а и б о л е е
распространены белки-ферменты, в их число входят к а к инте­
гральны е белки (мембранные А Т Ф азы ), т а к и периферические
(ацетилхолинэстераза, кислая и щ елочная ф осф атазы , Р Н К а з а ) .
Белки-рецепторы и белки, определяю щие иммунную реа к ц и ю
клетки,— антигены, т а к ж е могут быть ка к интегральными, т а к
и периферическими компонентами мембраны. Часто рецепторы
входят в состав более сложных мембранных комплексов, содер­
ж а щ и х белки-исполнители. Н априм ер, холинорецептор воспри­
нимает сигнал от нейромедиатора и передает его на белок-кана-
л ообразователь. Эта реакция откры вает проницаемость м е м б р а ­
ны д ля ионов и формирует возбуж даю щ и й потенциал.
Структурные б е л к и м ем бран, к которым относятся белки ци­
тоскелета, строго говоря, не являю тся мембранными: они приле­
гаю т к цитоплазматической стороне мембраны (спектрин) и мо­
гут прикрепляться к истинно мембранным белкам. Так, белок
полосы I I I эритроцитарных мембран объединяется в ансамбли с
м олекулами спектрина через специальный и изкомолекулярны й
белок анкерин. М икротрубочки и микрофиламенты цитоскелета-
обеспечивают противодействие клетки изменению ее объема и
создают эластичность. Основным белковым элементом цитоске­
лета является тубулин, способный агрегировать, образуя т р у б ч а­
тые структуры. Целостность этих структур в клетке сохраняется
лишь в отсутствие ионов Са — при появлении кальц ия в клетке'
ее цитоскелет рассыпается.
В нормальной клетке уровень ионизированного кальция весь­
ма низок — его аккумулирую т в специальные депо или откачи­
ваю т н ар уж у специальные ионны е насосы. О к азал ось, что а л к а ­
лоиды винбластин и винкристин разру ш аю т цитоскелет, а т а к ж е
митотическое веретено, формирую щ ееся аналогичным образом ,
вследствие ингибирования ионного Са-насоса, в связи с чем уро ­
вень внутриклеточного С а 2+ сильно возрастает. П ри этом р а з р у ­
шение митотического веретена устраняет т а к ж е и возм ож н ость
деления клетки. К так ом у ж е результату приводит любое другое
нарушение целостности клеточной мембраны.
Д л я функционирующей клетки нарушение мембранной струк­
т у р ы — экстраординарное явление. Ее целостность обеспечивает­
ся не только внутриклеточным цитоскелетом, но и м еж клеточн ы ­
ми структурами, создаваемы ми нитями коллагена, «насыщенно­
го» протеогликанами и гликопротеинами (см. н иж е). Все клетки
животных, за исключением свободноплаваю щ их эритроцитов или
лимфоцитов, об л а д а ю т вы ш еуказанной оболочкой, или внеклеточ­
ным матриксом. Его н азы ваю т т а к ж е гли кокаликсом . К р ай н и м
24
вы раж ен и ем внеклеточного матрикса является соединительная
ткань.
В ремя жизни мембранных белков составляет от двух до пяти
дней. По этой причине в клетке существует механизм, обеспе­
чиваю щ ий поставку вновь синтезированных молекул белка к со-

Рис. 6. В страивание синтезируемого белка в мембрану эндоплазматического


ретикулума (по К. Н агпзоп, О. О. Ьип!., 1980).
С и н т е з п еп т и д н о й ц еп и и н и ц и и р уется м Р Н К на с в о б о д н о й р и б о с о м е , причем в н а ч а л е
о б р а з у е т с я си гн аль н ы й п еп ти д ( / ) , сп особн ы й о б н а р у ж и т ь р ец еп то р (2). которы й о б л е г ­
ч а ет в ст р а и в ан и е б ел к а в м ем б р а н у (3 ). П о с л е встр аи в ан и я п еп т и д о с в о б о ж д а е т с я от
си г н а л ь н о г о к он ц а, п р о д о л ж а я р асти и о д ев а т ь ся у г л ев о д н о й « ш у б о й » (4 ). Н а п о с л е д ­
н е й ст а д и и р и б о со м а о с в о б о ж д а е т с я от св язи с м ем б р а н о й (5)

•ответствующим участкам мембраны. Синтез белка начинается на


свободны х рибосомах (рис. 6 ).
Рост пептидной цепи, начинающийся с М-конца, приводит к
об р азо в ан и ю последовательности, которая способна найти на
м ем бран е рецептор, облегчающий проникновение белка в бислой.
П о мере роста пептида он отсоединяется от рецептора, сохраняя
св язь с рибосомой, при этом последняя оказы вается связанной с
■мембраной. Н а более поздних стадиях синтеза сигнальный у ч а ­
сток, «помогавший» внедрению б елка в мембранную структуру,
отщ епляется, к гидрофильной части молекулы присоединяются
углеводные компоненты. По заверш ению синтеза рибосома от­
соединяется от мембраны и готовый белок переносится к месту
своего функционирования. О днако его диф ф узия по мембране в
л ат е р ал ьн о м направлении во зм ож н а лиш ь на короткое рассто я­
ние. М играция белка в отдаленные районы клетки протекает в
резу л ь тате либо контактов меж ду различными органеллами, в
процессе которых они обмениваю тся мембранными компонента­
ми, либо транспорта синтезированных в ретикулуме белков спе­
циальн ы м и одетыми клатрином (покрытыми) ве зи кула м и , от­
щ епл яю щ им ися от ап п а р а та Гольджи.

25
Углеводные компоненты мембран
Углеводы в составе мембран не представлены сам остоятель­
ными отдельными соединениями, а об наруж и ваю тся лиш ь в со­
единении с бел кам и (гликопротеины и протеогликаны) и липи­
д ам и (гликолипиды). В м ем бр анах гликозилировано около '10%
всех белков и от 5 до 26% (в зависимости от объекта) липидов.
Углеводные цепи белков колеблю тся по составу от двухзвен ­
ных структур до разветвленных 18-членных полисахаридов, на­
зы ваем ы х гл и к а н а м и , весьма разнообразного состава. В них
вклю чаю тся глюкоза, гал ак то за, нейраминовая кислота, ф у ко за
и манноза. В составе соединительной ткани и м еж клеточного
вещ ества обнаруж и ваю тся протеогликаны: углеводные компонен­
ты в них сульфатированы. И х типичными представителями я в ­
л яю тся хондроитинсульфат, дерматансульфат и гепарансульф ат .
Углеводный компонент гликолипидов т а к ж е сульфатирован.
В этом случае олигосахара соединены с молекулами ц ер ам и д а,
а функции, которые они осущ ествляют в клетке, аналогичны т а ­
ковым у гликопротеинов и протеогликанов. Все три кл ас са уг­
левод сод ер ж ащ их соединений назы ваю т гликоконъю гат ам и
(табл. 6 ).
В соответствии с типом связей присоединяемые углеводны е
компоненты д ел ят на О -гликан ы и N -гликаны . В случае глико­
протеинов в об разован ие гликозильной связи вовлекаю тся обы чна
асп араги н ов ая или глутам и н овая кислота, серии, треонин, при
образовании гликолипидов — церамид.
Углеводные компоненты мем бранны х структур в п од а вл я ю ­
щем большинстве откры ваю тся во внеклеточную среду. И х ф унк­
ции связаны с контролем за межклеточными взаимодействиями,
поддерж анием иммунного статуса клетки, обеспечением ста б и л ь ­
ности белковых молекул в мембране. Н и ж е приведены некоторы е
конкретные функции гликоконъюгатов.
В качестве наиболее распространенного примера гликопро­
теинов, содерж ащ и х Ы-гликаны, обычно приводят иммуноглобу­
лины крови. О днако они, ка к и сод ерж ащ и е О-гликаны муцины
слюны и слизи,— немембранны е гликопротеины, проявл яю щ и е
свои функции вне контакта с мембраной. Типичным примером
гликоконъю гатов, выполняю щ их свои функции в составе мем­
бран, являю тся антигенные детерминанты гр уп п крови. Они п ред­
ставлены ка к гликолипидами, т а к и гликопротеинами, в числе
которых — известный гликоф орин.
В а ж н а роль углеводного компонента белковых молекул и в
формировании слож ны х молекул со специфическими ф ункция­
ми — процессинге. Многие белковые молекулы, особенно биоло­
гически активные вещества (например, нейропептиды), синтези­
рую тся в виде крупных неактивных предшественников, которы е
затем р асщ епляю тся специфическими протеазами с ф орм и р ов а­
нием «зрелых» биологически активных продуктов. Д е я т е л ь ­
ность протеаз контролируется уровнем гликозилирования белков.
26
Таблица 6. Состав и роль гликокоиъюгатов клетки

Д ополнительны е
ком поненты
Н а и б о л е е р а сп р о ст р а н ен ­
ны е м о н о са х а р и д ы Л о к а л и за ц и я

обы ч н ы е р ед к и е

В гликопротеинах
Глюкоза
Г алактоза
М анноза Белок Фосфат, Клеточный секрет,
Глю козамин1 сульфат мембраны клеток и со­
Г алактозам ин1 единительная ткань
Н ейрамииовая кис­
л о т а1
Фукоза
В протеогликанах
Г алактоза
К силоза Сульфат, Внеклеточный м ат­
Глю куроиовая кис­ белок рикс и соединительная
лота ткаиь
И дуроиовая кислота
Глю козамин1
Г алактозам ин1
В гликолипидах
Глюкоза
Г алактоза
Глю козамин1 Ц ерамид С ульфат Мембраны клеток, ми­
Г алактозам ин1 норные компоненты
Н ейрамииовая кис­ плазмы крови
л о та1
Ф укоза

1 А ц и л и р ов аи ы по Ы -коицу.

Т а к , многие белки, синтезируемые вн а ч а ле как гликопротеины,


в дальнейш ем в результате процессинга теряют олигосахарид-
ную часть.
Обычно гликозилирование начинается с активации р а зв е т­
вленной углеводной части, состоящей из 9 молекул маннозы и
3 молекул глюкозы. Она присоединяется к липидному «носите­
лю »— долихолпирофосфату, о б разуя гликолипид.
П осле того ка к олигосахари д ная часть переносится с липида
на белок, что происходит на самых ранних стадиях синтеза б ел ­
ка, наблю дается сн ачала потеря рад и кал ов глюкозы, затем поч­
т и половины рад и кал о в маннозы, потом присоединение Ы-аце-
тилгал акто зам и на, г ал ак тозы и сиаловой кислоты. Хотя общ ая
последовательность стадий гликозилирования белка установле­
на, до настоящ его времени не ясно, что уп равл яет ею, ка к она
инициируется и к а к приостанавливается.
О бнаруж енны й недавно блокатор гликозилирования туника-
м иц и н был использован для решения этих вопросов с перемен­
ным успехом. В опытах с О-белком вируса стом атита было полу­
чено, что туникамицин, препятствуя гликозилированию, вы зы вает
27
агрегацию 0 -б е л к а и тормозит его функции. В аналогичных опы­
та х другой лаб ор атори и показано, что О-белок способен р а б о т а т ь
и в агрегированном состоянии. Тем не менее мож но сказать, ч т о
олигосахари дная часть сложного белка влияет на его конф ор­
мацию в мембране и хар актер взаимодействия с соседними бел ­
ками. В ряде случаев негликозилированны е белки становятся
более доступны протеазам, и можно предположить, что этот путь
облегчает удаление из мембраны «отработавш их» белковых мо­
лекул.
В данной выше краткой картине об разован ия и внедрения в
мембрану белковых молекул п оказана необходимость форм иро­
в ания сигнальной последовательности в белковой молекуле, спо­
собной найти на мембране свой «рецептор». Часто в состав сиг­
нального пептида вклю чаю тся углеводные компоненты. В кл ет­
ках, обработанны х туникамицином, эндоплазматический
ретикулум становится набухшим. Он буквально переполнен
негликозилированными белками, которые не могут внедриться в
соответствующие части клетки. Ярким примером подобного со­
стояния является заб олеван и е человека — недостаточность а р а н -
титрипсина: в печени таких больных образуется практически т а ­
кой ж е ингибитор протеазы, к а к и у здоровых людей, однако его
углеводная часть п редставлена недостроенными олигоманнозид-
ными цепями, не содерж ащ и м и сиаловой кислоты.
Ещ е одной функцией клеток, з а которую ответственны глико­
протеины, является адгезивностъ — способность клеток прочно
прикрепляться к поверхности «субстрата» или друг к другу. З а
это свойство отвечают лектины — белки, обладаю щ и е повышен­
ной способностью связы вать углеводы. Первы м лектином, вы д е­
ленным для ан ал и за, был рицин касторовых бобов, полученный
П. Эрлихом (1900). П о зж е Д ж . Самнер (1919) получил в кри­
сталлическом состоянии из ка н а ва л и и мечевидной широко из­
вестный ныне к он канавали н А. Этот лектин применяют д ля изу­
чения углеводных компонентов клеточных мембран. Л ектин ы в
растениях, по-видимому, выполняю т функцию, аналогичную ро­
ли иммунокомпетентной системы животных: фиксируют патоген­
ные микробы и способствуют их разрушению. Л ектины азотф ик-
сирующих растений обеспечивают контакт корней с азотфикси-
рующими микроорганизмами. В а ж н а я роль в регуляции м е ж к л е ­
точных взаимодействий клеток животных принадлеж ит ф ибронек-
тину.

Современная концепция структуры


биологических мембран
С овременная картин а биологической мембраны сильно отли­
ч ается от первой концепции строения мембран, выдвинутой в
1929— 1933 гг. Д . Д ан и эл л и и Г. Доусоном. В основе современ­
ных представлений леж и т ж ид кокр и сталл и ческая (м о заи ч н ая )
концепция, выдвинутая С. Сингером и Д ж . Никольсеном в 1972 г.
28
и усоверш енствованная С. Сингером в 1981 г. Согласно этим,
представлениям бислой яв л яется ж идкой структурой, в которой
образую щ ие его липиды способны осущ ествлять сегментальную
подвижность, в р ащ ател ьн ы е движения и латер ал ьн у ю дифф узию
(рис. 7) .С меньшей скоростью они способны к переходу на д р у ­
гую сторону бислоя и к выходу из него.

Рис. 7. Различные виды подвижности липидов в бислое (Л) и их фазовый


переход (Б):
/ — се гм ен т а л ь н а я п о д в и ж н о ст ь , 2 — в р а щ а т ел ь н а я п о д в и ж н о ст ь , 3 — л а т е р а л ь н а я д и ф ­
ф у зи я , 4 — ф л и п -ф л о п п е р е х о д (в обы ч н ы х у сл о в и я х в есь м а р е д о к ) , 5 — « ж и д к о е » с о ­
ст о я н и е б и сл о я с р ы хл оуп ак ов ан н ы м и ж и р и ок и сл отн ы м н ц еп ям и , 6 —<у п о р я д о ч ен н а я
уп а к о в к а б и сл о я , в ы зы в аем ая п о н и ж ен и ем тем п ер ат ур ы

Белки в бислое т а к ж е весьма лабильны. В рем я вращ ат ельной


диф ф узии д ля белка в бислое может составлять величины, мень­
шие 1 мкс. Л ат еральная подвижность белка определяется не
только его собственными свойствами, но и микровязкост ью л и ­
пидного окружения, его упаковкой — ф азовы м состоянием л и п и ­
дов. Т аким образом, подвижность белковых молекул и их ассо­
циация в м ем бране контролируются липидами. Аннулярные
липиды выявляю тся в виде слоя, окруж аю щ его белковые м олеку­
лы, с временем жизни, соответствующим 10-5— 10-8 с. О гран и че­
ние подвижности (обмениваемость) молекул аннулярных лип и ­
дов может иметь определенное значение. В ремя обмена м олеку­
лами меж ду аннулярным слоем и суммарным липидным фондом
зависит т а к ж е от структурированности мембраны, а значит, от
температуры, жирнокислотного состава ее компонентов, х а р а к ­
тера взаимодействий молекул липидов друг с другом и т. д. Л и ­
пиды способны об разовы вать упорядоченные области с общей
«системой координат»— кластеры, в которых плотность у п а к о в ­
ки мож ет существенно отличаться от соседних с ними частей.
В ремя жизни кластеров составляет п орядка 10-6— 10~7 с, коли­
чество молекул в кластере — от нескольких десятков до сотен,
а м е ж кластерн ы е зоны могут об р азовы вать зоны дефектов, об­
легчаю щ их проникновение в бислой модификаторов.
В аж н о й особенностью мембраны является асимметрия б и сло я ,
со зд ав ае м ая за счет действия внутриклеточных ферментов (н а ­
пример, дем етилаза ф о сф ати д и л х о л и н а), различий ионного со­
29
с та в а цитоплазмы и интерстициальной жидкости, а т а к ж е осо­
бенностей структуры молекул фосфолипидов и асимметричной
л о к а л и за ц и и белков в бислое (рис. 8 ). Асимметрия бислоя — это

Рис. 8. Современные представления о строении биологических мембран (Л)


и подвижности их компонентов (5 ) :
I — л а т е р а л ь н а я п о д в и ж н о ст ь л и п и д о в в б и сл о е { й —10—в см* • с —] ), / / — л а т ер а л ь н а я
п о д в и ж н о ст ь бел к ов ы х м о л ек у л (Ь = 10“ 9 с м 2 , с - 1), I I I — в р а щ а т ел ь н а я п о д в и ж н о ст ь
(X— 1 м к с ), I V — ф л н п -ф л о п п е р е х о д л и п и д н ы х м о л ек у л (* = 1 ч ), V — ф л и п -ф л о п б е л ­
ковы х гл обул 5 = 1 м с)

фактор, обеспечивающий создание градиента кривизны, складок,


сморщиваний, отшнуровки частей мембраны в виде везикул, что
существенно д ля обеспечения межклеточных взаимодействий.
Концепция ж и дкокристаллического состояния мембран находит
свое подтверждение в исследовании мембранной структуры со­
временными физическими методами.
Выделение
и методы
исследования
мембранных
препаратов

Получение мембранных фракций


М етаболические пути клетки п редставляю т собой совокупность
катал изиру ем ы х ф ерм ентами реакций, в ходе которых происхо­
дит превращение субстратов. Осуществление реакций каж дого
цикла протекает с высокой скоростью б лагодар я тому, что ф ер ­
менты, ка тализирую щ и е эти реакции, локал и зован ы поблизости
друг от друга и расположены в строго определенном месте клет­
ки. Так, синтез белковых молекул происходит в рибосомах, р а с ­
положенных на наруж ной поверхности мембран шероховатого
эндоплазматического ретикулума, а присоединение к белкам уг­
леводов или липидов (образование гликопротеинов и протеоли-
пидов) осущ ествляется в гладком эндоплазматическом ретику-
луме; в яд ре протекает синтез Д Н К , а в митохондриях — процессы
окислительного фосфорилирования, переаминирования, окис­
ления ж и рн ы х кислот и т. д. Клеточные мембраны д а ж е в к л ет­
к а х одного типа значительно отличаю тся друг от д руга ка к по
составу, так и по осущ ествляемым ими функциям. По этой при­
чине первоочередной зад ач ей исследования обычно является по­
лучение изолированных мембран в достаточно чистом виде.
В усредненной неспециализированной клетке вы деляю т сле­
дую щие органеллы: ядро, окруженное двойной мембраной и со­
д е р ж а щ е е плотно упакованную Д Н К , митохондрии, эндоплазма-
тический ретикулум, представляю щ ий собой сеть трубочек и ци­
стерн; ап п а р а т Гольдж и; лизосомы; пероксисомы (см. табл. 1).
Кроме того, необходимо выделять плазматическую мембрану,
которая является границей меж ду содержимым клетки (цито­
плазмой) и окру ж аю щ ей средой. С пециализация клеток сопро­
во ж д ается потерей одних органелл и видоизменением других.
Н апример, зрелые эритроциты человека лишены ядер, э н д о п лаз­
матического ретикулума, митохондрий. В кл етк ах мышечной т к а ­
ни п лазм ати ч еск ая м ем брана об разует впячивания, простираю­
щиеся в глубь клеток (Т-сист ем а); в секреторных кл етк ах хоро­
шо р азви т шероховатый эндоплазматический ретикулум, в ри бо­
сомах которого идет синтез секретируемых белков, и т. д.
31
Д л я получения мембран клетки сн ач ал а разруш аю т, испо;
з у я один из следую щих методов: осмотический шок, растиран
кусочков ткани с кварцевы м песком или стеклянными ш арш
ми, разм ельчение гомогенизаторами различны х типов. Мет
разру ш ен ия клеток и время обработки выбираю т в зависимое
от типа ткани. Б ак тер и ал ьн ы е протопласты и эритроциты об!
но подвергаю т осмотическому шоку. М ягкие ткани (печень, мо:
разр у ш аю т с помощью гомогенизатора Поттера, более плотн
(сердце, скелетные мышцы) — ножевым гомогенизатором, ж аб
ршб растираю т с кварцевы м песком.
Если полученным путем гомогенизирования смесь органе
и мембранны х фрагментов подвергнуть центрифугированию,
частицы, имеющие различную плотность и размеры, будут осг
д ать ся с разной скоростью. При постоянном центробежном ус
рении скорость осаждений будет прямо пропорциональна ма
частиц и разности м еж д у их плотностью и плотностью среды.
Р азруш енн ы е клеточные мембраны способны замы'катьез
об р азо в ы в ать пузырьки диаметром 0,3— 3,0 мкм. Смесь везик
о б разо в ан н ы х из мембран различной природы, но имеющих п
мерно одинаковую плотность, н азы вается ф ракцией м икрос
В табл. 7 приведены данны е о р азм е р а х и плотности различ!
органелл и получаемых из них фрагментов.
И з табл. 7 видно, что если гомогенат какой-либо ткани г
трифугировать с небольшим ускорением (например, в реж
600 § , 15 мин), то осядут только яд р а и неразруш енны е кле-
при больших ускорениях (10 000 § , 15 мин) можно осадить фр
цию, со д ерж ащ ую преимущественно митохондрии, а затем с
ш анную микросомальную фракцию. П осле центрифугирован!
р еж и м е 100 000 §, 1 ч в супернатанте остаю тся только растве
мые белки (ф ракц ия ц и то зо л я); все мембранны е фрагменты
п ад аю т в осадок. М етод избирательного осаж дения клеточ
фрагментов н азы ваю т методом диф ф еренциального центриф
рования, а получаемые с его помощью препараты — су б к ле
ны м и ф ракциям и.
Фракции, полученные при однократном центрифугирова
никогда не бы ваю т чистыми. Так, митохондриальная фра!
кроме митохондрий и их фрагментов будет со д ер ж ать в раз,
ных количествах лизосомы, везикулы, образованны е из пла:
тической мембраны и эндоплазматического ретикулума.
лучшего разд елени я процедуру повторяют несколько раз; в
которых случ аях для удал ен и я примесей (например, сокр
тельных белков при выделении субклеточных фракций из мьп
ной ткани) мембранны е фрагменты о б раб аты ва ю т раствор
высокой ионной силы.
Р езу л ь таты фракционирования зави сят от способа разр
ния, состава среды и типа клеток, т а к ка к эти ф акторы опр
л яю т х ара ктер разры ва мембран и, следовательно, р азм ер ь
разую щ ихся фрагментов. Так, при непродолжительной гоь
низации из п лазматических мембран получаются дово
32
крупные фрагменты, осаж д аю щ и еся вместе с ядерной фракцией.
В этом случае м икросомальная ф ракция содерж ит небольшое
количество везикул, образованны х из клеточной мембраны. Если
при гомогенизации получаются мелкие пузырьки, то отделить
фрагменты наружной мембраны от фрагментов эндоплазматиче-
ского ретикулума практически невозможно.

Таблица 7. Клеточные компоненты печени крыс

Реж им осаж дени я


Д иам етр Р а в н о в ес н а я
Ф р акции ч аст и ц , мм в р ем я , п л о т н о ст ь,
у ск о р ен и е, § мин г/см

Целые клетки 15—20 600 15 1.20


Ядра 3— 12 600 15 1,32
А ппарат Гольджи
крупные фрагменты 1—3 2000 20 1,12— 1,16
везикулы 0,05—0,5 145 000 15 1,06— 1,14
Митохондрии 0,7— 1,1 10 000 %5 1,17— 1,21
Лизосомы 0,4—0,8 10 000 26 1,12— 1,16
Ш ероховатые микро­ 0,05—0,2 145 000 26 1,13— 1,25
сомы
Гладкие микросомы 0,05—0,3 145 000 25 1,06— 1,23
Плазматические мем­
браны
крупные фрагменты 3— 20 1500 15 1,15— 1,19
везикулы 0,05—0,3 145 000 30 1,07— 1,19

Грубые субклеточные фракции мож но разд ели ть на более


чистые, состоящие преимущественно из мембран одного типа.
Д л я этого проводят центрифугирование грубых фракций в гр а ­
диенте плотности сахарозы и л и ф икола.
С уществует д ва в ар и ан та этого метода. В первом — зо н а л ь ­
но-скоростное цент риф угирование — используют градиент с не­
большим диапазоном концентраций. Его функция состоит г л а в ­
ным образом в предотвращении перемешивания фракций при
центрифугировании вследствие конвекции. Нанесенный на гр а ­
диентный раствор гомогенат или грубую ф ракцию мембраь цен­
трифугируют непродолжительное время. Ч астицы расп р е д е л я­
ются в соответствии со скоростями их седиментации. П ри д о ста­
точно большом времени центрифугирования все фракции пооче­
редно о са ж д аю т ся на дно пробирки.
Во втором варианте — равновесное, и л и изо пикническое, цен­
т риф угирование— используют градиент, охваты ваю щ ий весь
д иапазон плотности р азд ел я ем ы х частиц. Н а дно наносят р ас­
твор с плотностью, превыш аю щ ей плотность самого тяж елого
компонента смеси. Ц ентрифугирование проводят до тех пор, по­
ка все частицы не р азд ел ятся по зонам, соответствующим их
собственной плотности.
2— 133 33
П осле выделения субклеточных фракций необходимо их иден­
тифицировать и проверить степень загрязненности другими орга-
неллами. Д л я этого применяют несколько методов.
Микроскопия. Этот метод используют в первую очередь для
идентификации ядерной фракции (фазово-контрастный микро­
скоп). М итохондриальные фрагменты или везикулы ш е р охо ва­
того эндоплазматического ретикулума, сод ерж ащ и е на своей по­
верхности рибосомы, т а к ж е легко распознаются морфологически.
Если диаметр везикул, образованны х из наруж ны х мембран
клетки, достаточно велик ( ~ 4 м к м ), их т а к ж е можно отличить
от более мелких везикул, образованны х из внутриклеточных мем­
бран. Если ж е диаметр этих пузырьков меньше 2 мкм, то м орф о­
логически идентифицировать плазматическую м ембрану н евоз­
можно. С помощью микроскопии легко установить присутствие
в п р еп ар ате и других структур (незамкнутые обрывки мембран,
ф ибриллы и т. п .) .
Определение липидного состава. Все клеточные мембраны со­
д е р ж а т липиды, однако соотношение липид/белок и набор липи­
дов, ка к указы вал о сь выше, часто бывают специфичны д ля д а н ­
ного типа мембраны. По этой причине определение липидного
состава выделяемой ф ракции является необходимым этапом ее
характеристики.
Определение белкового состава. В большинстве случаев вы ­
деляем ы е мембраны содер ж ат большой набор белков с р азл и ч ­
ной молекулярной массой. Тем не менее определение белкового
состава с использованием электроф ореза в полиакриламидном
геле (в присутствии д одеци лсульф ата натрия) мож ет оказаться
полезным для идентификации мембран или определения их чи­
стоты. Д л я некоторых типов мембран характерн о присутствие
значительных количеств белков с определенной молекулярной
массой. Так, С а-А Т Ф аза саркоплазматического ретикулума, об­
л а д а ю щ а я молекулярной массой 100 кД, составляет 50— 70% от
общего количества б елка микросом мышечной ткани, для п л а з ­
матических мембран характерно присутствие значительных ко­
личеств гликопротеинов, которые можно вы являть специальным
окраш иванием.
Определение активности маркерны х ферментов. Фермент мо­
ж ет служить маркером определенного типа мембран, если он
прочно связан с мембраной, не инактивируется при выделении
данной фракции и локализуется исключительно в данных орга-
неллах. Хотя не все эти требования выполняются для больш ин­
ства маркерных ферментов, изучение их поведения в процессе
получения данной фракции позволяет довольно точно установить
принадлежность выделенных мембран.
К сожалению, многие маркерны е ферменты (например, Иа,
К -А Т Ф аза, б '-нуклеотидаза, сукцинатдегидрогеназа) при вы д е­
лении или хранении могут терять активность. Кроме того, боль­
шинство встроенных в м ембрану ферментов характеризуется
асимметричной л окал и зац и ей активного центра. По этой причине
34
их активность в зам кнуты х ф рагм ен тах не удается определить
из-за недоступности для субстрата. Это т ак н азы ва ем а я латент­
н а я активность фермента. Она мож ет быть вы явлена в присут­
ствии низких концентраций детергента или ионофоров (типа ала-
м етицина), образую щ их крупные к а н а л ы в зам кнуты х м ем бр ан ­
ных везикулах.
Р азл и чн ы е ткани содер ж ат различные количества м аркерн о ­
го фермента. Н апример, глю ко зо ф осф атаза обнаруж ивается
главны м образом в эндоплазматическом ретикулуме печени и
почек, в других тканях количество этого фермента невелико, он,
по-видимому, не может служить маркером органелл одного типа.
В табл. 8 приведены маркерны е ферменты различны х субклеточ­
ных фракций.

Таблица 8. Биохимические маркеры различных клеточных мембран

О р ган ел л а Б и охи м и ч еск и й м арк ер

П лазматическая мембрана К а, К-АТФ аза, 5'-нуклеотидаза, аденилат-


циклаза
Э ндоплазматический ретикулум Глюкозо- 6 -ф осф атаза1, цитохром Р 450 ,
Н А Д Ф Н -дегидрогеназа, цитохром Ь5
Митохондрии
н аруж ная мембрана М оноаминоксидаза
матрикс М алатдегидрогеназа
внутренняя мембрана Цитохром с-оксидаза, сукцинатдегидро-
геназа
Аппарат Гольджи У Д Ф -галактозилтрансфераза
Лизосомы Кислая ф осфатаза, кислые гидролазы
Пероксисомы К атал азы
М ембраны щеточной каемки Щ елочная ф осф атаза, сахараза
Синаптосомы Ацетилхолинэстераза, ацетилхолиновые
рецепторы

1 О б н а р у ж и в а е т с я только в о п р ед ел е н н ы х т к а н я х (п еч ен ь , почки)

И з написанного выше можно заключить, что д л я определения


происхождения той или иной субклеточной ф ракции или степени
ее чистоты недостаточно использовать один тест, а ж елательно
иметь подробное описание полученной фракции. В то Же время,
определяя активность м аркерны х ферментов, мож но оценить сте­
пень загрязненности используемой ф ракции мембран примесями.

Распространенные методы исследования


мембранных структур
П редпринимая исследование процессов, протекаю щих в мем­
бранны х структурах, необходимо п редставлять их временные х а ­
рактеристики и одновременно временное разреш ение методов, ис­
пользуемых для ан ал и за. Н а рис. 9 проведено д ля примера со­
2* 35
поставление некоторых химических и физических реакций, име­
ющих отношение к функционированию мембран с диапазоном
скоростей, доступных для измерения с помощью распростран ен ­
ных методов.
Электронный парамагнитный резонанс (Э П Р ). Принцип п а­
рамагнитного резонанса был открыт в 1944 г. проф. Е. К. Завой-
ским. К а к метод исследования подвижности (упорядоченности)
макроструктур он стал применяться лиш ь после разр аботки спо­
соба создания ст абильных нит роксильны х р а д и ка ло в, впервые
синтезированных Э. Г. Р озан цевы м . Введение такого р а д и к а л а
в состав молекулы позволяет использовать Э П Р-зонд ы д ля х а ­
рактеристики микровязкости бислоя, степени упорядоченности и
в ращ ательной или поступательной подвижности меченых моле­
кул в разны х условиях. Э П Р -сп ектр «реагирует» на изменения
не только анизотропии, но и скорости вращ ения метки, описывае­
мое временем корреляции. Подвиж ность, и зм еряем ая этим мето­
дом, находится в п ределах 10~9— 10й с.
М етоды ЭП Р-спектроскопии требуют дорогостоящего обору­
дования, однако сами измерения высокоавтоматизированы, п ис­
пользование этого подхода широко и разнообразно. Так, вслед­
ствие того, что н арком ания приобрела во многих капиталистиче­
ских странах х ара ктер социальной опасности, наркологические
служ бы нуж даю тся в тестах д ля оценки склонности к морфину
и его аналогам , а т а к ж е для определения его концентрации. Д л я
этого используют высокоизбирательный метод определения мор­
фина в биологических жидкостях, включающий иммунологические
подходы в сочетании с ЭП Р-спектроскопией. Использую т анти­
тела против морфина, соединенного с сывороточным альбумином.
При их взаимодействии со спин-меченым морфином образуется
прочный комплекс, имеющий характерны й для иммобилизован­
ной метки спектр. Если среда, в которую вносится этот комплекс,
содерж ит морфин, сигнал спектра Э П Р затухает вследствие об­
мена м еж д у молекулами свободного морфина и морфина в сос­
т ав е комплекса. М етод об л а д а ет высокой чувствительностью и
избирательно позволяет выявить следовые количества н а р к о ­
тика.
Спин-меченые жирные кислоты, содерж ащ ие нитроксильную
группировку на разном расстоянии от полярной СООН-группы,
встраиваю тся в бислой трансверзально, ориентируясь в попереч­
ном направлении. Вид Э П Р-сп ектра этих зондов зависит от глу­
бины погружения р ад и к ал а с неспаренным электроном внутрь
бислоя (рис. 10). И спользование набора таких зондов позволяет
оценить скорость в ращ ательной подвижности и, соответственно,
плотность упаковки на разной глубине бислоя.
Спиновый р ад и к ал мож ет быть введен в разнообразны е со­
единения, л о кал и зац и ю которых в мембране достаточно легко
п редсказать, поэтому этим методом можно оценивать подвиж ­
ность и взаимодействие меж ду собой разны х компонентов мем­
браны. ;
О д н ако в последнее время появились обоснованные в о з р а ж е ­
ния в связи с некритическим использованием метода ЭП Р-спек-
троскопии (О. СНаршап, 1982). Ц елы й р яд результатов, полу­
ченных этим методом, не согласуется с другими подходами,

Переходы типа „спираль-клубок“


, 1
Перераспределение электронов в молекулах
I-------------------- .------------------------ 1
Фермент-субстратный комплекс:
образование распад
ассоциация диссоциация
Кислотно-основной I----------- 1------ Н---------------------------------- 1
катализ:
Гидратация и гидролиз

Поверхностная
диффузия ^ Перенос протонов, диссоциация
Перенос электронов
I--------------------------1
Вращательная диффузия:
в растворе в мембране
| 1 I------1

Ю4
Спектроскопические методы
I____________ | Температурный Ручные методы
Рассеяние лазерного света I— ёкачок— 1 1

Я дерны й магнитный резонанс


I-

Деполяризация флуоресценции
I--------------- 1
Ь
ЭПР-спектроскопия
Ультразвуковое поглощение
* *Концентрационный скачок
I-------------------------------►
(метод остановленного потока)

Рис. 9. Д иапазоны констант скоростей некоторых физических п


химических процессов (А) и методов, адекватны х для их изме­
рения (Б)

хорошо коррелирую щими м еж д у собой. Высокие концентрации


спиновых зондов модифицируют бислой, а ковалентные метки,
связы ваясь с белками, могут инактивировать их. В результате
исследователь изучает мембрану не в нативном состоянии, а в
том виде, который она принимает после модификации. Многие
результаты , полученные с помощью ЭП Р-спектроскопии, не н а­
ходят однозначного объяснения (Б . МагзЬ, 1983). Скорости про­
цессов, описываемых с помощью этого подхода, много больше
тех, которые л е ж а т в основе функционирования биологических
мембран.
37
Я дерно-магнитный резонанс ( ЯМР) . В основе Я М Р -с п е к тр о -
скопии л еж и т поглощение электромагнитных волн в радиочастот­
ном д и а п а з о н е я д р а м и , о б л а д а ю щ и м и м а г н и т н ы м м ом ентом . Н а ­
иболее ч ас т о и с п о л ь з у ю т в и с с л е д о в а н и я х 13С, ’Н, 31Р. С т р у к т у р а
Я М Р-спектров определяется временем жизни различных спиновых
состояний, величиной диполь-дипольного взаимодействия меж ду

сн

10 Гс

Рис. 10. Спектр Э П Р д л я двух спин-меченых производных стеариновой кис­


лоты в мембранах эритроцитов (стрелкой указано направление возрастания
напряженности магнитного поля Но)

данным ядром и соседними ядрам и, неоднородностью магнитно­


го поля и т. д. Х арактерны м парам етром Я М Р-спектров является
величина хим ического сдвига 6 ; иногда для ан ал и за используют
вр ем я р ел а к са ц и и %, связанное с б соотношением 6 = 10—т.
Н а ширину линий Я М Р-спектров влияют неоднородность м аг­
нитного поля, а п олная ширина обратно пропорциональна в р е­
м ени поперечной р ел а к са ц и и Т2, поэтому процессы релаксации,
связанны е с диполь-дипольным взаимодействием между ядрами,
т а к ж е могут служить мерой «подвижности» отдельных атомов в
молекуле. Пики Я М Р л е ж а т в радиочастотном диапазоне, а р а з ­
личия в частотах сигналов для разны х изотопов намного превы ­
шаю т ширину сигнала поглощения. Спектры Я М Р м алы х моле­
кул хорошо разреш имы . Так, спектр Я М Р молекулы холестерина
позволяет идентифицировать резонанс каж дого атома в отдель­
ности и 'получить информацию о подвижности различны х участ­
ков молекулы в зависимости от ее окружения.
П а р ам етр Т и характеризую щ ий процесс продольн ой (спин-
решеточной) р ела кса ц ии, прямо пропорционален увеличению по­
движности отдельных атомов. Таким образом, метод Я М Р по­
зволяет с высокой селективностью получить сведения о поведе­
нии разны х частей молекулы. Н а рис. 11 у ка зан ы значения Т\
для отдельных атомов углерода в молекуле фосфатидилхолина.
38
Увеличение Т\ соответствует возрастанию подвижности С -С-свя-
зей.
При переходе к более крупным м олекулам спектры Я М Р
сильно услож няю тся и зачастую становятся неразрешимыми. Так,
Я М Р-спектроскопия белков в л уч­
шем случае мож ет позволить о х а ­
рак тер и зо вать состояние (л а б и л ь ­ Струкгурная формула
фосфолипида
ность) отдельных групп молекулы,
например окруж ение фосфолипидно- 3,3 С П , СП ,
го р а д и к а л а в активной группе транс- 11 3 [ *
1,8 СНт сн ,
ф ераз и т. п. Д ругим недостатком 11 - ]1 -
ЯМ Р-спектроскопии является д о ­ 1,1 СНт 1
СП,
1 -
вольно низкая чувствительность —
0,6 (с н 2)10 (С Н ,)10
концентрация о б разц а д о л ж н а быть 1
не менее 10_3 моль/л, в то время ка к о,2 0,2 СНт СИ’
1 “
оптические методы позволяют п олу­ 0,1 сIн . СП,
чить информацию о молекулах, ! -

-о-
концентрация которых составляет <Г=о

II
1 *1
10~б— 1(К7 моль/л. о О
С опоставление подвижности ж и р ­
нокислотных цепей в бислое, осу­ 0,1 СН,- СП ■ си2
щ ествляем ое разны ми способами,
вскры вает разли чи я м еж д у мето­ I
д ам и Э П Р - и ЯМ Р-спектроскопии “О— р = о
I
(рис. 12). о
Судя по результатам измерений
СИ,
опектров Э П Р можно заключить 0,3
I
что упорядоченность падает, а по- о,з СИ,
движ ность соответственно растет мо I '
м е н ,к
нотонно в направлении от эфир 0,7 +
ной связи к метильному концу мо­
лекулы. ЯМ Р-спектроскопия п о ка­ Рис. 11. Значения Т 1 для тем-
зывает, что область, прим ы каю щ ая пературы, выше критической,
к сложноэфирной связи, х ар а к т ер и ­ рассчитанные из данных ЯМ Р-
спектроскопии углерода в мо­
зуется определенной жесткостью, и лекуле фосфатидилхолин а мем­
снижение упорядоченности н аступ а­ бранного бислоя (по А. Ьи е!
ет при движении по жирнокислот­ а1„ 1973).
ной цепи к метильному концу, начи­ З н ач ен и я Т ] в о зр а ст а ю т (п р о п о р ­
ная с Сб-атома. Аналогичные ре­ цсти ионально
а т ом ов )
у в ел и ч ен и ю подвиж но­
о т п о в ер х н о ст и м ем ­
зультаты получены и при ан ал и зе бр ан ы к атом ам , п р и бл и ж ен н ы м
к с е р е д и н е б и сл оя
подвижности дейтерированных фос­
фолипидов в мембранном бислое
(О. С Ь а р т а п , 1984). Причины различий в оценке подвижности
фосфолипидов в мембране, вы являем ы х при сравнении двух м ето­
дов, заклю чаю тся в основном в том возмущ аю щ ем влиянии, кото­
рое спиновые зонды о казы в аю т на уп аковку бислоя. Кроме того,
временные характеристики подвижности, измеряемы е методами
Э П Р - и ЯМ Р-спектроскопии, сильно различаю тся (см. рис. 9).

39
Н есмотря на то что для изучения мембранны х белков ЯМ Р-
спектроскопия о к а з а л а с ь не столь эффективна, этот подход
часто используют ка к немодифицирующий метод изучения мем­
бранных структур. Столь ж е перспективны и другие немодифи­
цирующие методы в мембранной биологии — метод кругового
д и хроизм а и метод сканирую щ ей
калоримет рии.
V } 0,8
Дисперсия оптического вращения

I* %
и круговой дихроизм. П ри п р охо ж ­
дении через оптически активный об ­
разец монохроматического линейно
поляризованного света происходит
поворот плоскости поляризации
электрического вектора. Угол, на
1 ^ о
который п оворачи вается эта плос­
кость, может быть измерен с помо­
2 Ч 6 8 п щью поляризаторов. Основной в кл ад
в спектры дисперсии оптического
Рис. 12. Зависимость величины
угловой подвижности (п ара­ вращ ени я вносят белки б лагодаря
метр упорядоченности 5 ) от спиральным участкам. Эту х а р а к т е ­
положения метки по данным ристику используют чаще всего для
Э П Р (1)- и ЯМ Р (2 )-спектро­ определения относительного содер­
скопии (по А. ЗееНп^, V . №е-
йсгЪещег, 1974). ж а н и я а-спиралей в белках. Однако
П а р а м ет р у п о р я д о ч ен н о ст и сп и н о ­
существует ряд факторов, влияющих
в ого з о н д а р ассч и т ан и з сп ек тр ов на х ар а ктер спектров и являю щ ихся
Ы а-соли сп и н -м еч ен ой д ек а н о в о й
кислоты , та ж е вел и ч и н а, по д а н ­ источником возможны х ошибок.
ны м Я М Р , п ол уч ен а и з а н а л и за П реж де всего бывает трудно учесть
сп ек тров д ей т ер и р о в а н н ы х СН*-
гр уп п ее м ол ек ул ; п — пор я д ок влияние о кр уж аю щ ей среды на
атом ов угл ерода в ц еп и от к а р ­
б о к си л ь н о г о конца
спектр дисперсии оптического в р а ­
щения белка. Кроме того, надо
иметь в виду наличие в м олекулах
исследуемых белков деформированны х неспиральных участков
и разны й в к л а д в спектр длинных и коротких спиралей, а так ж е
то, что меж ду реальными (природными) белками и их синтети­
ческими аналогами, используемыми в качестве «эталонов спи-
ральности», невозможно достичь структурной эквивалентности.
Величина кругового дихроизма, хар а ктер и зу ем ая обычно э л ­
липтичностью, п р едставляет собой разницу в поглощении о б р а з ­
цом право- и левополяризованного света. Она объясняется р а з ­
личиями в коэффициентах молярной экстинкции право- и левопо­
ляризованного по кругу света.
Спектры кругового дихроизма используют д л я тех ж е целей,
что и спектры дисперсии оптического в ращ ения,— чтобы вы яс­
нить, какой тип вторичной структуры п реобладает в мембранных
белках. При интерпретации спектров кругового дихроизма в о з ­
никаю т некоторые трудности, которые связаны в основном с не-
гомогенностью мембранны х суспензий, обусловливаю щ ей с г л а ­
живание спектральны х кривых. Н есмотря на то что процент спи-
рали зац и и п редставляется на первый взгляд не самым и н ф о р м а­
40
тивным парам етром, с помощью этих методов можно выяснить,
осущ ествляется ли прямое влияние на мембранны е структуры
внешних факторов, если это влияние изменяет спирализацию
белковых молекул. Эти изменения часто имеют место в тех слу­
чаях, когда наблю дается собственный конформационный сдвиг
в молекуле белка или взаимодействие молекул белка друг с д р у ­
гом, изменяющ ее их конформацию.
В ы зы вает интерес вопрос о природе оптической активности
соединений, участвую щих в метаболизме. К аким образом воз­
никло почти полное превосходство одних химических изомеров
н ад другими, например Ь-аминокислот над О-аминокислотами?
Традиционные объяснения основаны на предположении о пред­
почтительной поляризации света, пронизывавшего изначальную
атмосферу на ранних э т ап ах развития Зем ли ка к планеты, по­
скольку известно, что поляризованный по кругу свет мож ет из­
бирательно р азр у ш ать молекулы оптического антипода.
В действительности объяснение оптической активности не
требует привлечения внешних факторов. Физические экспери­
менты показы ваю т возможность спонтанного появления опти­
ческой активности в исходной (оптически неактивная) рацем иче­
ской смеси. При определенных условиях кристаллы , выращ енные
из рацемической смеси, со д ерж ат весьма значительные (иногда
преимущественные) количества одного из оптических изоме­
ров. Видимо, з атр а в к а, с л у ж а щ а я точкой роста начального кр и ­
сталла, определяет стереоспецифичность продукта, наиболее
успешно используемого для его роста. Т ак же действуют и при­
родные ферменты, способные дискриминировать оптические изо­
меры.
Сканирующая калориметрия. Значение теплоты, выделяемое
или поглощ аемое в процессе химической реакции при постоянном
давлении, можно использовать для оценки прочности хим ической
связи. Изменение физического (фазовое) состояния вещества при
постоянном давлении т а к ж е мож ет сопровож даться поглощени­
ем или выделением тепла. Чем выш е значение поглощенного
тепла, тем более значительна м олекулярн ая реорганизация в об ­
разц е при этих изменениях. Таким образом, изменения конф ор­
мации макромолекул мож но измерять, регистрируя тепло, вы ­
деляемое или поглощ аемое при конформационных переходах.
П оскольку фазовый переход обычно осущ ествляется в с р а в ­
нительно узком температурном интервале, его регистрируют, и з­
меряя количество тепла, необходимое д ля малого увеличения
тем пературы системы в пределах этого интервала. Основная
сложность эксперимента состоит в том, как подвести определен­
ное количество тепла д ля увеличения тем пературы исследуемого
образца на 1°С при постоянном давлении. Д л я нахож дения теп ­
лоты изменения фазового состояния вещества необходимо из
регистрируемого поглощения (или выделения) системой тепла
вычесть тепло, поглощ аемое (или выделяемое) ею в отсутствие
ф азовы х переходов,— собственную теплоемкость.
41
Принцип метода диф ф еренциальной сканирую щ ей калометрии
состоит в измерении тепла, необходимого д ля увеличения тем пе­
ратур ы об ъекта на очень малую величину при непрерывном по­
вышении тем пературы объекта. В к л ад теплоемкости, которая в
узком температурном и нтервале является сопз1, вычитается, а
итоговая величина характери зует «энергетическую стоимость»
ф азовы х пеоеходов.

А Ь ' в

Рис. 13. Калориметрический анализ липидных мембран:


А — пр им ер р еги стр ац и и эн д о т ер м и ч ес к о г о п е р е х о д а в в од н ой с у с п ен зи и д и п а л ь м и т о и л -
ф о сф а г и д и л х о л и н а ; / — и зм ен ен и е т еп л о ем к о ст и п р обы , 2 — кр ив ая интегр ир ован ия
п л о щ а ди п о д кривой I;
В — ф а зо в ы е п ер ех о д ы в с м ес н ф о сф а т и д и л х о л и н а и ф о с ф а т и д и л эт а н о л а м и п а , в зя ты х
в р а зн ы х с о о т н о ш ен и я х (У — 100/0, 2 — 80/20, 3 — 50/50, 4 — 20/80. 5 — 0/100):
В — р еги ст р а ц и я эн д о т ер м и ч ес к и х п е р е х о д о в в с р е д е д и о л еи л л ец и т и н а (У) н пальми>
тои л сф и и го м и ел п и а (2 ) в п р и сутств и и р азл и ч н ы х к оли честв х о л е ст ер и н а ; 3 — с м ес ь
р а зл и ч н ы х ф о сф о л и п и д о в б е з д о б а в к и х о л е с т е р и н а , 4 — то ж е , +10% х о л е ст ер и н а , 5 —
ю ж е , +20% хол е ст ер и н а , 6 — то ж е , +35% х о л е ст ер и н а

Современные чувствительные калориметры позволяю т из­


мерять фазовы е переходы в водно-липидных дисперсиях с ис­
пользованием небольших (несколько миллиграммов) порций
м а тер и ал а. Применение этого метода д ля исследования простых
искусственных систем (мицеллы, везикулы, бислои которых о р ­
ганизованы из фосфолипидов заданного вида) д ал о ценную ко­
личественную информацию о принципах организации бислоя.
Б ы ло обнаружено, что в бислоях индивидуальных ф осф оли ­
пидов критическая тем пература (7\ф) для фазового перехода з а ­
нимает доли градуса. В смеси фосфолипидов область фазового
перехода зан и м ае т 1— 2°. Н екоторы е фосфолипиды плохо см е­
ш иваю тся друг с другом, например, если их ж ирнокислотные це­
пи отличаются по длине более чем на 4 атом а С. Н е смешиваются
т а к ж е глицерофосфолипиды и сфингофосфолипиды; пики, х а р а к ­
теризую щ ие их ф азо вы е переходы, регистрируются на тер м о гр ам ­
мах отдельно. Д о бавл ен и е к таким образцам холестерина спо­
собствует о бразованию ф азы со смешанными свойствами
(рис. 13), при этом фазовый переход у ж е не выявляется. В фос­
фолипидах смешанного состава, образую щ их одну фазу, величн-
42
на ТКр представляет собой, ка к и энтальпия фазового перехода,
характеристику этой смеси.
Н а величину Гкр влияю т д ли н а жирнокислотных цепей в мо­
лекуле (чем больше атомов углерода в жирнокислотном р а д и к а ­
ле, тем выше тем пература перехода) и степень ее гидратации.
Обводнение бислоя снижает тем пературу фазового перехода.
А нализ термограмм некоторых фосфолипидов вы являет перед
наступлением области фазового перехода, так назы ваемы й пред-
переход (рис. 13, А ) . Он устраняется добавкой в смесь фосфати-
дилэтан о л ам и на или кислых фосфолипидов, а т а к ж е снижением
содерж ан ия воды в системе. П ервоначально предпереход об нару ­
жили Э. СЬаргпап и В. ЬабЬгооке (1969); они объяснили его
вращ ением полярных голов липидов. В н астоящ ее время его о б ъ ­
ясняют образованием морщин и ск ладо к при подготовке бислоя
к ф азовом у переходу.
Д л я нативных мембран ценность метода дифференциальной
сканирующей калориметрии ниже, чем д л я искусственных сис­
тем. Высокое содерж ание холестерина в п лазматических м е м б р а­
нах не позволяет выявить отчетливых изменений теплопродукции
в области ф азовы х переходов. В случае внутриклеточных мем­
бран фазовы е переходы не обнар уж и ваю тся по другой причине —
эти мембраны оказы ваю тся достаточно «жидкими» в приемлемом
интервале тем ператур (5— 60°С).
Флуоресцентная спектроскопия. Световая волна, сталкиваясь
с молекулой какого-либо вещества, либо рассеивается (изменяет
направление д ви ж ен и я), либо поглощ ается (передает свою энер­
гию м олекуле). При этом молекула переходит в возбужденное
состояние. Энергия, поглощ енная молекулой, может перейти в
тепло (в результате столкновения с другими молекулами) или
излучиться в виде света. К акое именно событие из указанны х
здесь будет иметь место — определяется состоянием молекулы
в момент столкновения.
В озбуж денны е электроны во звращ аю тся на основной уровень
двумя путями: либо испуская свет, либо с помощью безызлуча-
тельного перехода. В первом случае — излучат ельны й переход —
испускаемый свет об л а д а ет меньшей энергией и большей длиной,
так как часть энергии теряется; при этом наб лю д ается т а к н а ­
зы ваемы й Стоксов сдвиг.
Эффективность флуоресценции (вероятность излучательного
перехода) характеризуется квантовым выходом 0 , равным отно­
шению числа излученных фотонов к числу поглощенных. В ели­
чину 0 , ка к и Стоксов сдвиг, определяю т и внутренние, и внеш ­
ние факторы. Н априм ер, 0 транс-изомеров в несколько раз выше,
чем цис-изомеров флуоресцирующих молекул. К числу внешних
факторов относится столкновение с молекулой туш ителя (д и н а­
мическое тушение) или образование комплекса флуоресцентной
молекулы с тушителем (статическое т у ш е н и е). Первы й процесс
зависит от вязкости среды и мож ет быть использован д ля ее из­
мерения. Туш ителями флуоресценции являю тся т я ж е л ы е анио­
43
ны или катионы (Г- , Вг_, Сз+, С и 2+), парам агн ети ки (М п2+, нит-
роксильные р а д и к а л ы ). Кроме того, наблю дается тушение ф л у о ­
ресценции в полярных растворителях, например в воде.
Второй случай — безы злучат ельны й переход в основное со­
с т о я н и е — происходит, если наиболее высокий колебательный
подуровень основного состояния имеет ту ж е энергию/ что и низ­
кий колебательны й уровень возбуж денного состояния. Такой пе­
реход хар актерен для «гибких» молекул. У «жестких» молекул,
со д ерж ащ и х аром атические кольца, ч ащ е всего наб лю д ается из­
лучение части поглощенной энергии.
Если система конформационно лаб ил ьн а, то происходящие
в ней перестройки требуют много энергии — до 80 кД ж /м о л ь .
В этих условиях Стоксов сдвиг м ож ет достигать 100 нм. В ел и ­
чина С токсова сдвига о тр аж ает, кром е того, такое важ н о е свой­
ство окруж аю щ ей среды, как полярность. П ереход молекулы в
возбуж денное состояние сопровож дается изменением дипольного
момента молекулы. Это, в свою очередь, поляризует электронные
оболочки окруж аю щ и х молекул, что приводит к смещению ато ­
мов и периориентации молекул. З а т р а т а энергии на эти процессы
и приводит к длинноволновому сдвигу. Стоксов сдвиг будет тем
больше, чем больше: 1) изменение дипольного момента молекулы
при возбуждении, 2 ) время ж изн и молекулы в возбуж денном
состоянии, в) поляризуемость окру ж аю щ и х молекул.
В некоторых случ аях в о збу ж ден н ая м олекула, стал ки в аясь с
идентичной невозбужденной молекулой, об разует комплекс —
эксимер. П ри этом из плоских молекул возникаю т структуры ти ­
па сандвич, которые стабилизированы переносом за р я д а от од ­
ной молекулы к другой. Н а перенос з а р я д а тратится часть
энергии поглощенного кванта, поэтому эксимер флуоресцирует в
более длинноволновой области. Степень эксимеризации зависит
от концентрации хромофора, тем пературы и вязкости о к р у ж а ю ­
щей среды. Так, степень эксимеризации пирена (располагается
в м ем бране м е ж д у жирнокислотны ми хвостами липидов) при
данной температуре и концентрации определяется главны м
образом вязкостью среды и мож ет служить ее характеристикой.
И зм енение тем пературы при прочих равных условиях уменьш ает
микровязкость мембранного бислоя. Подвиж ность жирнокислот­
ных цепей в середине бислоя возрастает, увеличивается и вер о­
ятность встречи молекул пирена. Изучение зависимости эксиме­
ризации пирена в м ем бр ан ах от температуры позволяет в ы яс­
нить, каким образом изменяется микровязкость мембранны х
структур, и выявить область температур, при которой происхо­
дит фазовы й переход в м ем бр ан ах (рис. 14).
Т уш ени е ф луо р есц енции иногда представляет собой резуль­
тат дальней безызлучательной передачи, т ак назы ваемого р езо ­
нансного переноса энергии. В таком случае система содерж ит
два флуоресцирую щих хромофора, причем спектр испускания
одного из них (донор) д о л ж ен перекры ваться со спектром погло­
щения другого (акцептор). При наличии переноса энергии интен­
44
сивность флуоресценции донора снижается, а акцептора увеличи­
вается. Эффективность переноса зависит от дистанции между
донором и акцептором, и это явление мож ет быть использовано
для определения расстояния м еж д у какими-либо группами в
мембране в качестве своеобразной спектроскопической линейки.

О$ 1___I---- 1---- 1---- 1 ч


3,2 ЗД 3> 3,5 1/Г* 10 К

Рис. 14. Спектр флуоресценции пирена в суспензии мембран микросом почек


(Л); реакция образования эксимера пирена из возбужденной (отмечена звез­
дочкой) и невозбужденной молекул (Б); график Аррениуса для соотношения
экснмерной (максимум флуоресценции 465 им) и мономерной (для расчетов
использован пик при 392 нм) форм пирена (В).
О б л а с т ь ф а зо в о г о п е р е х о д а х а р а к т е р и зу е т с я п ер ег и б о м иа гр а ф и к е при т ем п ер а т у р е
21,9°С. К р и в ая 1 — н у л ев а я линия р еги ст р ац и и , кривы е 2 —9 со о т в ет ст в у ю т и зм ер ен и я м
при т е м п е р а т у р а х 8, 15, 18, 20, 23, 30, Э2, 45°С

Флуоресцентные методы часто применяют д ля определения


парам етров, х арактеризую щ их связы вание хромофора с м ем б р а­
ной. Д л я этого используют 1-анилин-8-,кафталинсульфонат
(А Н С ), первый зонд, примененный Д . Лоуренсом в 1952 г. для
исследования мембранных структур. В неполярном окружении
интенсивность флуоресценции этого зонда зам етно в озрастает и
м аксимум ее сдвигается в область более коротких длин волн.
П ри правильно выбранной области возбуж дения и флуоресцен­
ции практически вся флуоресценция будет исходить от зонда,
связанного с мембраной. С вязы вание зар я ж ен н ы х зондов с м ем ­
браной зависит от плотности з а р я д а на ней и мож ет быть ис­
45
пользовано для определения этого п арам етра, а т а к ж е величины
трансм ембранного потенциала. рН-чувствительные флуоресцент­
ные зонды (производные акридина) применяют д ля измерения
градиента рН на мембране.
Р азл и чн ы е модификации флуоресцентной спектроскопии с ус­
пехом используют в биохимии мем бран д ля характеристики со­
стояния белков и белок-липидных взаимодействий в процессе
функционирования. Один из примеров такого рода — расчет по­
движности белковых молекул из величин поляризации ф луорес­
ценции. Д л я измерения используют флуорофоры с хорошим
квантовым выходом, способные избирательно модифицировать
химические группы белка (дансилхлорид, атакующий ЫНг-груп-
пы, или эритрозин, присоединяющийся к 8 Н-группам б е л к а ). П о ­
ляри зац и ю флуоресценции Р определяю т (в стационарном ре­
жиме при непрерывном освещении образц а) из уравнения
Р = { 1 в — I±)Ц1 в )>
где I ц и 1± — величины интенсивности флуоресценции в стацио­
нарном состоянии при вертикальной и горизонтальной п о л я р и за­
ции света.
В р ем я вращ ательной корреляции определяют из граф и ка з а ­
висимости величины Р от тем пературы (Э. М арш ел л , 1981). В
последние годы р азр а б о та н ы методы, позволяю щие изм ерять
поляризацию флуоресценции в нестационарных условиях мето­
дом флаш-фотолиза. Н аносекун д ная вспыш ка лазерного луча
нужной длины волны и высокой интенсивности позволяет отде­
лить во времени возбуж даю щ ий свет от испускаемого и у с т р а ­
нить к а к повреждения белков постоянным освещением, т а к и
в к л а д рассеивания в измеряемы е параметры . Безынерционные
системы быстрой регистрации флуоресценции соединяют с бы­
стродействующим анализатором . Такой комплекс ап п аратуры
одновременно с регистрацией поляризации флуоресценции позво­
ляет рассчитать и время в ращ ательной корреляции тВр. Н и ж е
приведены значения времени в ращ ательной корреляции для не­
которых белков (табл. 9). И з данны х таблицы видно, что эта
величина коррелирует с р азм ер ам и белков и изменяется под
влиянием условий среды. Например, мембранный бислой о г р а ­
ничивает вращ ател ьну ю подвижность белков, которая существен­
но зависит от температуры и присутствия субстрата.
Флуоресцентные методы находят широкое и р азнообразное
применение в мембранной биохимии. Так, введение хлортетра-
циклина, который вследствие своей гидрофобности концентриру­
ется в м ембранах, в среду с мембранны ми ф рагм ентами об­
н аруж и в ает флуоресценцию, количественно о тр аж аю щ ую ак ку ­
муляцию кальция мембранны ми насосами (М. Б1хоп е( а1.,
1984). Это позволяет использовать хлортетрациклин д ля контро­
ля за скоростью перемещения С а2+ через мембрану.
Флуоресцентный хелатор кальция, синтезированный недавно
на основе ЭГТА, Квин-2 (К. Т51еп, 1980), можно использовать
46
Таблица 9. Время вращательной корреляции некоторых
белков (25°С)

М о л ек у л я р ­
Б ел ок ная м а сса , Твр
кД

Апомиоглобнн 17 8,3 не
Р-Лактоглобулин (мономер) 18 8,5 »
Трипсин 25 12,9 »
Р-Лактоглобулин (димер) 36 20,3 »
Сывороточный глобулин 66 41,7 »
М акроглобулин 900 80
Са-А ТФ аза (мембраносвязанная) 100 62 мкс
То же, в присутствии АТФ 30 »
То же, при повышении темпера­ 28 »
туры до 45°С

д ля измерения концентрации ионизированного кальц ия в клетке


или в органеллах. Б л а г о д а р я своей гидрофобной природе он
легко проникает через мембрану и оказы в ается «запертым» во
внутренней области клетки в результате действия мембранны х
гидролаз, отщ епляю щ их его гидрофобные хвосты и лиш аю щ их
способности проникать через бислой. Комплексируя ионизиро­
ванный кальций внутри ком партмента, куда его привела исход­
ная гидрофобность, Квин-2 флуоресцирует в специфической об ­
ласти спектра. Величина флуоресценции прямо пропорциональна
концентрации его ком плекса с С а 2+.
В а ж н а я роль С а2+ в регуляции метаболизма все более увели­
чивает число примеров использования флуоресценции для изу­
чения этого процесса (К- Тз1еп е! а 1 1984). Белок, регулирующий
Са-чувствительность многих клеточных ферментов,— кальм од у-
л и н , является мощным модулятором клеточных (мембранных)
функций. Д олгое время исследователи не находили методов, по­
зволяю щ их контролировать его функции. О казалось, что при
взаимодействии с кальцием кальмодулин переходит в активное
состояние, меняя свою конформацию; этот конформационный пе­
реход о тр аж ает с я на п ар ам етрах флуоресценции хромофора,
если таковой присоединить к молекуле кальмодулина. Простой
способ сделать функции кальмодулина «видимыми»— дансили-
рование (Л. Э. ЛоЬпзоп, Ь. А. \\Д 1епаиег, 1983; В. А. Ткачук и др.,
1983). Д ан си л-кал ьм о д ул ин о б ладает специфическим спектром
флуоресценции, чувствительным к присутствию двухвалентных
ионов, а т ак ж е белков и мембранных липидов, с которыми он
способен связы ваться. Таким образом, можно оценить с в я зы в а ­
ние с кальмодулином гидрофобных лигандов.
Х арактеристика конформационного состояния белка в мем­
бране. К онф орм ационное состояние б ел к а наиболее просто изу­
чать, оценивая доступность тиоловым реагентам 5Н -групп белка
в разны х условиях. Одно из эффективных соединений — 2-хлоп-
47
4-нит робензо-2-окса-1,3-диазол, Н Б Д -х л о р и д ( Н Б Д - С 1 ) / Это
вещество способно взаимодействовать с ИНг-группой Лизина,
ОН-группой тирозина и 5Н-группой цистеина, причем Л егкость
реакции с разными группами зависит от условий проведения экс­
перимента. /
Интересные результаты получены при исследовании в заи м о ­
действия Н БД -С 1 сС а -А Т Ф а зо й саркоплазматичесдого ретикулу­
ма, обеспечивающей активный транспорт С а2+ {А . М. Рубцов,
11982). Это взаимодействие осущ ествляется достаточно медленно,
поэтому за процессом мож но следить непрерывно.
П о скорости модификации 5Н-группы Са*АТФазы делятся на
медленно и быстро реагирую щ ие (малореакционноспособные и
высокореакционноспособные). Только вторые имеют отношение
к проявлению ферментативной активности: ингибирование ф ер­
мента НБД-С1 осущ ествляется по мере их связы вания. АТФ
обеспечивает уменьшение скорости взаимодействия 5Н -групп
с НБД-С1 и переводит их из «быстрого» типа реагирования в
«медленный». При низких концентрациях АТФ защ и щ ает одну
8 Н-группу фермента, при повышении концентрации лиганд а вы ­
является защ итное действие ещ е на одну группу.
Тем ж е «защитным» эффектом о б ладает А Д Ф . Зн ач ен ия Ка
д л я АТФ, рассчитанные из величины защ итного эффекта, соот­
ветствуют величинам Кт Для этого субстрата. Ка Для АД Ф
имеет сходные величины. В ходе этих экспериментов о б н а р у ж и ­
лось определенное соотношение м еж д у скоростями модификации
5Н -групп фермента НБД-С1 и ингибированием его активности:
ингибирование ферм ента протекает в четыре р а за быстрее моди­
фикации его 5Н-группы, из чего следует, что модификация
5Н -группы одной молекулы белка способна «выключать» из р а ­
боты четыре молекулы фермента. Этот ф акт о т р а ж а е т олигом ер­
ную природу Са-А ТФ азы. АТФ, зам ед л я я м одификацию 5Н-груп-
пы НБД-С1, одновременно уравн ивал константы инактивации и
м одификации ферм ента так, что они составляли в его присутст­
вии величины одного порядка. Это позволяет предполагать, что
АТФ н аруш ает взаимодействие молекул в олигомерном ан ­
самбле.
Особенности кинетических исследований мембранны х фермен­
тов. Скорость ферментативных реакций существенно зависит от
рН-среды. Эта зависимость могла бы использоваться при регул я­
ции метаболизма, если бы в клетке не присутствовали буферные
системы: белки и сл аб ы е кислоты типа бикарбонат- или фосфат-
ионов. Экспериментаторы т а к ж е стараю тся проводить опыты в
условиях постоянства. рН, используя для этого буферные р а с ­
творы.
П р о б л ем а выбора буфера заклю чается в том, что природные
буферы трудно использовать в эксперименте : альбумин — из-за
опасности белковой ошибки в определении рН ; фосфат является
участником или продуктом многих протекаю щ их реакций. По
этой причине получил распространение синтетический буфер
48
трис-Ъидроксиметиламинометан. Он о б ладает высокой буферной
емкостью при рН 7— 8 ( р К = 8 , 1 3 ) , м ало токсичен, не образует
комплексов с ионами металлов, мож ет быть легко очищен от
примесей. О днако существуют серьезные препятствия д ля ис­
пользования этого буфера. Он оказы вает вы раж енное побочное
влияние на транспортные системы: природные переносчики анио­
нов в п лазматических м ем бранах способны транспортировать
молекулы триса, со зд ав ая потенциал на поверхности бислоя.
К роме того, р К трис-буфера сильно зависит от температуры (при
сдвиге температуры от 5 до 40°С рН раствор а понижается на
1 ед.) и от его активной концентрации (рН буфера при концен­
трации 0,01; 0,05 и ОД М составляет п, п + 0,05 и п + 0 ,1 ед. рН
соответственно). Н едавн о обнару ж ен а способность триса реаги­
ровать с компонентами электродов рН-метров р яд а фирм, вы зы ­
в аю щ а я искаж ения в значениях рН.
И м и д а зо л (рКа = 7,0) лишен этих недостатков, его рН почти
не меняется с тем пературой (рКа/°С = 0,01), но сам он м ож ет про­
я вл ять биологическую активность, например, ка к активатор фос-
фодиэстеразы цАМ Ф или Ы аК-АТФазы. Гистидин (рК 6,0 ) —
недостаточно сильный буфер в области рН 7— 8, кроме того, он
связы вает ионы Са, Си, Ре и др.
В н астоящ ее время в практике экспериментальных р абот ши­
роко используют синтетические буферы со значениями рКа в о б ­
ласти нейтральны х значений рН — М Е 5 , Р 1 Р Е 5 , Н Е Р Е 5 и др.
Д л я того чтобы обезопасить себя от возмож ны х ошибок, св яза н ­
ных с неудачным выбором буфера, следует сравнивать р езу л ь ­
таты экспериментов, полученные в разны х буферных средах.
Д л я связы ван и я ионов Са или в среде инкубации часто
используют специфические комплексоны, о б ладаю щ и е высоким
сродством к этим ионам (табл. 10). О д н ако при нейтральных и
слабощ елочных рН комплексоны активно взаимодействую т и с
мембранны м бислоем, модифицируя его структуру, индуцируя
диссоциацию от бислоя периферических белков (которые могут
быть регуляторами мембранны х ферментов) и модифицируя са­
ми белки. В частности, все комплексоны, приведенные в таб л . 10,
в д ва р а з а и более активируют мембранную Иа, К-АТФазу пу-

О" О' о- о- о- о- о- о о~ о
о=с с=о о = с о=с. с= о с=о о = с о= с с= о с= о

с=с с=о
о_ о_
элт а Э Г ТА ЦЛТА

49
Таблица 10. Логарифмы констант тем, не связанны м с у с т р а ­
связывания комплексонами некоторых
металлов в стандартных условиях нением из среды ио^ов т я ­
ж елы х металлов. /
В опытах часро исполь­
Э тил еи- Э т и л ен - Д иамии-
д и ам и и - гл нколь- ц и к л огек - зуют фрагментыу^леток или
Иоиы тетр а-
ац ет а т ,
т ет р а-
а ц ет а т ,
са т ет р а - клеточные органеллы с
а ц ет а т ,
ЭДТА ЭГТА ЦДТА замкнутыми / мембранами.
Д оступность субстратов и
активаторов к активным
М § 2+ 8,7 5,2 11,0
С а2+ 10,7
центрам белков в таких
1:Ц0 13,2
Си2+ 18,8 17,8 21,3 структурах ограничена и
Р е2+ 14,3 ? ? может варьировать под
Р Ь 2+ 18,3 ? 19,'7 влиянием неконтролируемых
5 г 2+ 8,6 8,5 10,5
2 п 2+ 14,5
факторов. По этой причине
16,3 18,7
экспериментатор мож ет по­
лучать разн ы е значения
удельной активности того или иного ферм ента в зависимости от
условий эксперимента. О днако эти разли чи я не будут служить
объективной характеристикой исследуемой системы. К о б ъясне­
нию результатов привлекаю т понятие так назы ваемой латентной
активности.
В результате маскировки части активных центров м ем бран ­
ных белков в зам кнуты х структурах ферм ентативная реакция
протекает нелинейно во времени д а ж е при использовании мини­
мальны х количеств белка, при которых не наблю дается его а г ­
регации. Вэтих ситуациях для наруш ения мембранны х структур
применяют детергенты. О днако д а ж е те из них, которые я в л я ­
ются достаточно мягкими (сапонин, дигитонин, тритон Х -100,
л у б р о л ), могут повр еж д ать липидное окруж ение фермента и мо­
дифицировать (инактивировать) фермент. В этих случаях ц еле­
сообразно использовать ионофоры, способные индуцировать спе­
цифическую (ва ли н о м и ц и н д ля калия, А 23187 или Х-537А для
кальц ия) или неспецифическую (алам ет ицин) проницаемость
мембранных структур.
В а ли н о м и ц и н о б л а д а ет следующей первичной структурой:
( в а л — сер — про — л е й ) 3. С труктура кальциевого ионофора
представлена ниже:

Аламетицин — антибиотик, создаю щ ий в м ем бране достаточ­


но большие ка н а л ы д ля проникновения АТФ, можно использо­
50
вать д ля выявления латентной А ТФ азы в зам кнутых (или инвер­
тированных) мембранны х образованиях.
В ы сокая информативность исследований температурной за в и ­
симости свойств биологических структур, теоретическое обосно­
вание которых сконцентрировано в уравнениях В ант-Г оф ф а и А р­
рениуса, неоднократно п о б у ж д а л а ученых использовать этот
подход. И сследование изменений энтальпии и энтропии отдель­
ных стадий ферментативного ц икла в широком интервале тем ­
ператур может многое д ать для понимания м олекулярных м еха­
низмов реакции.
О д н ако при проведении так их экспериментов и трактовке
получаемых результатов следует соблю дать известную осторож ­
ность. Н еобходимо учитывать температурный сдвиг рН буфера,
влияние температуры на величины констант диссоциации комп­
лексов субстрата с ионами-активаторами (например, М§-АТФ)
или комплексона с ионом, концентрацию которого он долж ен
стабилизировать (о ксалат Са или М ^ - Ц Д Т А и т. д .), и, наконец,
наличие критических температур для физико-химического состо­
яния бислоя, его гидрофобный объем, легкость образования ми­
целл (например, в присутствии детергентов) и тем самым д о­
ступность субстрата или ионов-активаторов гидролитическим
и эффекторным центрам в белково-липидных ком плексах мем­
бранных ферментов.
Основной (эмпирический) п оказатель применимости у р ав н е­
ния Аррениуса для изучения конкретного процесса — линейность
его температурной зависимости в координатах Аррениуса при д о­
статочно малом угле наклона с <2 ю ~ 2— 4 (температурный коэф ­
фициент (2 ю определяется к а к соотношение скоростей реакции
при двух тем пературах, различаю щ ихся на 10°С). Д л я контроля
линейности зависимости рассчитывают (Зю для разны х и нтерва­
лов тем ператур (10— 20°, 15— 25°, 30— 40° и т. д .). В случае л и ­
нейной зависимости величины Сю д олж ны совпадать.
О д н ако более строго уравнение Аррениуса выглядит так:
а \п к _ Еа _ , 1 _ АН° + ЯТ
ат ~ ЯТ2 ~ ЯТ2 Т ~~ ЯТ2
откуда энергия активации процесса (Е а) р ав н а не АН°, а АН° +
+ Я Т, т. е. величина Е а сам а зависит от температуры, ум еньш а­
ясь с удалением от 0°С температурного интервала, выбранного
для исследования. Эта причина сам а по себе д о л ж н а вызы вать
искривление гр аф и ка Аррениуса, хотя и на малую величину (по­
р яд ка нескольких килодж оулей на моль).
Д ругой, д а ж е более существенной причиной того, что иссле­
дователи слишком часто встречаются с нелинейностью зави си ­
мостей биологических функций в координатах Аррениуса, я в ­
ляется неправомочная зам ен а измеряемы х параметров. Так, при
исследовании ферментативных реакций константу скорости фер­
ментативного процесса следовало бы находить из уравнения
У 0= к +2 \Е З \,
51
проводят реакцию в условиях насыщения ферм ента субстратом и
лигандам и. Однако это требует большого объема эксперимен­
тальной работы. В то ж е время значение к+2 пропорццнально
значению Ктах и зам ен а к+2 на Ктах д ля построения граф й ка А р ­
рениуса правомочна, что широко используют. Однако, неправо­
мочна зам ен а Ушах на V0, поскольку последняя величина, хотя и
легко изм еряем ая экспериментально, не эквивалентна значению
Ушах- Б ол ее того, разница м еж д у Кщах и К0 д а ж е при оптим ал ь­
ных условиях реакции будет различной при разны х тем перату­
рах.
П р и использовании д л я построения граф и ков Аррениуса
величины начальной скорости измеряемы х ферментативных ре­
акций можно ан ал и зи р овать лиш ь вид гр аф и ка Аррениуса (ли­
н е е н — нелинеен, какова область критических тем ператур и т. д .),
но не абсолютные значения энергии активации.
В ряде случаев, например при терм оденагурации белка в хо­
де опыта, и этот ан ал и з провести невозможно. Критерием п р а ­
вильности р езу л ьтата может служ ить его независимость от ус­
ловий постановки опыта (вариации времени инкубации и пре-
инкубации, количества б елка в пробе и порядка добавок
и т. д .).
В целом ряде случаев м ембранны е ферменты обнаруж иваю т
отклонения от гиперболической кинетики, описываемой ур ав н е­
нием М ихаэлиса — Ментен. Д л я объяснения этого феномена соз­
даю тся оригинальны е концепции, вклю чаю щ ие предположения о
существовании специального регуляторного центра с низким
сродством, обеспечивающим аллостерическую регуляцию ак ти в ­
ности; исходную или индуцируемую гетерогенность активных
центров фермента в олигомерных ан сам блях; изменение конфор­
мации белковых молекул вследствие ф азовы х переходов мем­
бранны х липидов и т. п. К. Фриден (1979) р а зр а б о т а л модель,
предусматриваю щ ую существование стадии, на которой в заи м о ­
действие с субстратом индуцирует медленное изменение конф ор­
мации фермента, аналогичное гистерезисному. Согласно этой
концепции простейш ая ф ерм ентативная реакц ия такого типа
д о л ж н а вклю чать хотя бы одну дополнительную стадию — м ед­
ленную релаксацию фермента в исходное состояние из того кон-
формационно-напряженного состояния, в котором он о к а за л с я в
ходе ферментативного процесса (переход из Е 2 в Е х):

В р а м к а х описываемой модели присоединение субстрата к


активному центру протекает ка к равновесная стадия, конформа-
ционный переход сравним по скорости с м аксимальной скоростью
52
реакции и увеличение концентрации субстрата сдвигает равн ове­
сие меж ду двум я конформациям и фермента. Поэтому повышение
концентрации 5 зам ен яет стадию I стадией V. Действительно,
такое объяснение правомочно в целом ряд е случаев.
Н аиболее частыми ошибками, приводящими к отклонению
субстратной зависимости ферментативной активности от гипер­
болического вида, являю тся следующие.
1. Н еопти м альн ая концентрация лигандов (случай описан
д ля анионной А ТФ азы секреторной тк а н и ): если в ари ац и я кон­
центрации АТФ осущ ествляется на фоне высокой концентрации
ионов М ^, об наруж и вается отклонение субстратной зависимости
от гиперболической, т ак как увеличение концентрации АТФ сни­
мает ингибирование реакции избытком ионов (С. Ьогепзоп
е* а1., 1981).
2. П о л и м ери зац и я ферм ента или агрегация белково-липидно-
ного м а тер и ал а, обеспечиваю щ ая зависимость кинетического по­
ведения фермента от разведения белка или способа инициирова­
ния реакции (добавление белка или суб ст р а та). Повышение ион­
ной силы, как это описано д л я щелочной ф осф атазы , мож ет уп ­
ростить вид кинетики (К- О е1 Агсо, 1982).
3. Л имитирование реакции медленной скоростью диссоциации
лигандов в среду от соответствующих центров связы ван и я в ус­
ловиях недостатка лигандов или затруднений д л я их проникно­
вения к этим центрам в вези кулах мембранного м атери ал а
(Л В егде е! а1., 1980; V. З П у ш з е! а1., 1978).
4. Н аличие в мембранном материале белков, модифицирую­
щ их изучаемую активность (описано д л я Са-А ТФ азы эритроци­
тов, имеющей сложную кинетику гидролиза АТФ в присутствии
кальм одули на, но простую после его экстракции; Ь. М и а 11е т ,
5. Л. О. КагНзЬ, 1979).
Чтобы и зб е ж ать ошибок в интерпретации, следует прежде
всего не ограничиваться исследованием удельной активности,
а исследовать сами константы реакции. Полезным и достаточно
простым подходом мож ет явиться измерение констант ингибиро­
вания ферм ента каким-либо соединением в разн ы х условиях.
Этот подход мож ет послуж ить основой д ля построения модели
функционирования фермента, ка к это сделано в лаборатори и
М. Н а к а о (1981) по отношению к Ыа, К-АТФазе. И зм ер ял и ско­
рость ингибирования фермента ш оудом ицином (2-р-7)-рибофура-
н о зи л -м ал еи м и д ), необратимо взаимодействую щим с 5Н-груп-
пами ферм ента в соответствии с кинетикой псевдопервого порядка.
Р еак ц и ю проводили в присутствии всех необходимых л и г а н ­
дов (Ыа+, К+, М д 2+, АТФ) в 16 различны х комбинациях. П о вли­
янию на величину константы ингибирования лиганды разд ел и ­
лись на пять групп (табл. 11).
М ак си м ал ь н а я скорость ингибирования об н ару ж ен а в присут­
ствии Ыа+, М § 2+ и АТФ, когда происходит о б разован ие фосфо-
ф ерм ента, м ин им ал ьн ая — в условиях его работы с Ыа+, К+, М ^ 2+
и АТФ. И сследование показало, какие лиганды и на каком эта-
53
Таблица 11. Влияние лигандов пе реакции изменяют ско­
на константу ингибирования № , рость ингибирования шоудо­
К-АТФазы шоудомицином
(М. Нага е! а!., 1981) мицином, т. е. конформацию
фермента. Например, отщеп­
ление К+ или М&2+ от комп­
Группа П р и сут ств и е л и г а н д о в М-'-мпн-1 лекса Е - М ё 2+- К+ не и зм еня­
ет конформации фермента,
1 К а+ + М е 2+ + АТФ 108+7 так к а к по величинам к
И М д2+ 59+5 (табл. 11) состояния 7:-К,
М д 2+ + К+ 55+5 и Е - М ё неразли-
к+ 50+5
мы. Не происходит таких
Б е з лигандов 50+5
111 К а+ + М д2+ 37+5 изменений и при переходе
N8+ 36+5 от Я -А ТФ к Я- Ыа - К- АТ Ф.
Ыа+ + К+ 35+6 Н аборот, связывание АТФ
К а+ + К+ + М § 2+ 35+2
IV М е 2+ + К + + А Т Ф 39+1
зам ед ляет ингибирование, а
К++А ТФ 38+3 а К+ — ускоряет его.
М д 2+ +А Т Ф 34+2 Из этих опытов М. Н а к а о
V К+Ч-Иа+Н-АТФ 21+7 и сотрудники постулировали
К а+ + А Т Ф 20+5
№ + + К + + М § 2+ + 14+2
необходимость нескольких
И-АТФ конформаций фермента и
АТФ 12+3 впервые д ал и обоснованную
кинетическую схему его ре­
акции:

АТФ + /Г • А Т Ф — и - /Г, • Р — /А . Р ^ р.
Функции
мембранных
липидов 3

Состояние липидов в мембране


Р а с т я н у т а я углеводородная цепь жирной кислоты, со д е р ж а ­
щ а я :18 углеродных атомов, зан и м ае т длину 2,0 нм. По этой при­
чине можно было бы предположить, что бислой, составленный
из фосфолипидов, ж и рн ы е кислоты которых со д ер ж ат 118— 20
углеродных рад и калов, долж ен иметь толщину не менее 4,0 нм.
О д н ако часто р еа л ь н ая толщ ина мембраны не превыш ает 3,5 нм.
Это означает, что жирнокислотны е рад и кал ы бислоя не р ас п р я м ­
лены полностью, а образую т рыхлые структуры, в связи с чем
площ ад ь мембраны несколько больше, чем следует из расчета
теоретического пространства, приходящегося на одну молекулу
фосфолипида. Т а к а я у п аковка бислоя вы зы вается многими ф а к ­
торами.
Н а л и ч и е в м ем бран е в составе фосфолипидов цис-изоме-
ров ж ирны х кислот, разветвленны х или содерж ащ и х цикличе­
ские кольца углеводородных цепей, а т а к ж е высокая скорость
вращ ения вокруг С— С-связей жирнокислотных рад и кал ов д е л а ­
ют бислой достаточно рыхлым.
Потенциальны й барьер вращ ению вокруг единичной связи
составляет 8— 15 кД ж /м о л ь , а поворот вокруг двойной С — С-свя-
зи «стоит» — 150 кД ж /м о л ь . И з уравнения Аррениуса можно оце­
нить частоту в ращ ения вокруг единичной С— С-связи: она со­
ставл яет <1010 с-1 , а вокруг С -С -св язе й — 108. Р азли чн ы е формы
молекул жирны х кислот, возникаю щ ие при поворотах (в р а щ е ­
нии) вокруг единичных С— С-связей, н азы ваю т ротамерами или
конф орм ерам и, а изменение конформации молекулы за счет т а ­
ких поворотов носит название т ранс-гош -изомеризации. П осколь­
ку транс-гош-переход оценивается примерно в 2 к Д ж /м ол ь, его
вероятность очень велика и сильно увеличивается при в о зр а с т а ­
нии температуры. П ри переходе двух соседних тран с-кон ф игура­
ций в гош-конформацию, образуется складка, или кинк. О б р а з о ­
вание дефектов такого рода иллюстрирует риг. 15.
Н али чие структур такого типа следует р ассм атривать как
подвижные дефекты, способные захв аты в ать целые блоки мем­
55
браны — кластеры. И х концентрация и подвижность зави сят от
температуры. Границы кластеров определяются их упаковкой,
т. е. общими осями симметрии, одним и тем ж е парам етром упо­
рядоченности, общим м гновенны м угло м н а к ло н а цепей.

Рис. 15. О бразование дефектов в бнслое:


А — в с е ж и р и о к и с л о т н ы е ц еп и м ол ек ул ы ф о сф о л и п и д а н а х о д я т с я в . т р а н с-к о н ф и г у р а -
цнн: у к а за н ы н а п р а в л ен и я в р ащ ен и я в о к р у г С — С -св я зей ( / ) , а т а к ж е р е зу л ь т а т н е ­
со г л а со в а н н о г о в р а щ ен и я , п р и в о д я щ ег о к ск ош ен н ой (гош ) к о н ф о р м а ц и и ( / / ) или о б ­
р а зо в а н и ю кинка (III)',
Б ^ в л и я н и е кииков н а у п а к о в к у бн сл оя : I — кинки о т су т ст в у ю т , / / — о д и н кинк на
ж н р н о к и с л о т н у ю ц еп ь, I I I — д в а кинка н а ж и р н о к и с л о т и у ю цеп ь

К а к правило, цепи фосфолипидов в бислое представляю т


скошенными относительно перпендикулярной оси мембраны. Угол
н аклон а определяется природой полярной головы молекулы:
наклон возникает в том случае, если объем гидратированной го-
56
ловы молекулы больше площ ади сечения хвоста. В случае, когда
эти величины равны (например, д ля ф о сф ати д и эт ан о л а м и н а ),
скоса практически нет. Таким образом, угол наклона молекул
фосфолипидов в мембране определяется природой фосфолипида
и мож ет служ ить критерием отбора при о бразовании кластеров
в бислое. Н али ч и е перечисленных особенностей обеспечивает
определенную рыхлость упаковки (жидкостность или теку ­
честь) мембранного бислоя при нормальны х условиях. Эта
ж идкостность определяет функциональную динамичность м ем ­
браны.
С ледовательно, динам ическое состояние б и сло я с высокой
подвижностью его компонентов определяется одновременно не­
сколькими ф акторами. С одной стороны, это в р а щ а т е л ь н а я под­
вижность отдельных молекул фосфолипидов. Затем, это транс-гош-
рот америзация углеводородных цепей. Вблизи метильного конца
она осущ ествляется для каж дой молекулы независимо, но с при­
ближением к полярной голове и возрастанием плотности у п а ­
ковки (особенно начиная с 9-го углеродного атома, б ли ж е кото­
рого к поверхности бислоя почти не встречается цис-двойных
связей) транс-гош -ротамеризация мож ет осущ ествляться только
д ля нескольких цепей одновременно. П ри этом упаковка бислоя
н аруш ается много меньше, если в к аж д о й цепи происходит одно­
временно два гош-поворота и образуется кинк. Синхронные
транс-гош -превращ ения могут быть представлены как движ ение
кинков вдоль цепи. Вместе с этим движением через бислой воз­
мож но проникновение молекул гидрофильных веществ.
В ы раж енны е когезионные взаимодействия меж ду цепями в
бислое определяются, в основном, первыми 8— 9 метиленовыми
группами углеводородной цепи. Цис-двойные связи по этой при­
чине никогда не встречаются вы ш е уровня Сд или Си. По этой
причине С г и Сг-углеводородные цепи в молекуле фосфолипидов
оказы ваю тся неравнозначными. Обычно из двух цепей лиш ь при­
н а д л е ж а щ а я С2-углеродному атому имеет двойные связи, обес­
печивающие создание более рыхлой упаковки бислоя. П ер ем ещ е­
ние ненасыщенной жирной кислоты из полож ения С2 в п олож е­
ние С[ (обмен жирнокислотными р ад и к ал ам и внутри молекулы
фосфолипида) позволяет достичь более плотной упаковки: д л я
18 : 0/18 : 1-фосфатидилхолина критическая температура ф азов о­
го перехода составляет 3°С, а д ля 18 : 1/18 : О-фосфатидилхоли-
на — 22°С.
Существование ассоциатов фосфолипидных молекул с одно­
родно наклоненными цепями, организованными более уп орядо­
ченно, чем их окружение, было п редсказано Б. М а к Ф ар л ан д о м и
Г. М акКоннелом. В 1971 г. наличие таких ассоциатов с временем
жизни > 1 0 -8 с было п оказано в экспериментах со спин-мечеными
жирным и кислотами, вклю чаемы ми в лецитиновые бислои.
Фазовые переходы

В водной среде структуры, образуем ы е фосфолипидами ( л а ­


меллярны е, мицеллярные, гексагональные и д р .), ведут себя как
анизотропные жидкости, о б ладаю щ и е признаками упорядочен­
ности, т. е. жидкие кристаллы. Таким структурам присущ л и о ­
тропный м езом орф изм (зависимость состояния от гидратации) и
термотропный м езом орф изм (зависимость структуры от темпера-

/ — ж и д к о к р и ст а л л и ч еск о е состоя н и е, би сл ой ;
/ / — д в у х ф а з н а я си ст ем а в од а — би сл ой н ы е ст р у к ­
туры ; / / / —'О бласть сос у щ ест в о в а н и я л ам ел л яр ­
ны х и гек сагон ал ь н ы х стр ук тур ; I V — гель; ------- '
Гкр — кривая тем п ер атур ы ф а зо в о г о п е р е х о д а ЮГс

Рис. 17. Спектр Э П Р тетраметилпипериди-


нокснма в фосфолипидном бислое при тем ­
пературе выше Т кР в области перехода и
ниже Ткр (видно, что соотношение между
пиками А н В различаю тся при разных сос­
тояниях бнслоя)

туры ). Оба свойства связаны м еж д у собой. Ф азовые переходы


липидов, осущ ествляющиеся по типу «гель-жидкий кристалл»,
происходят при температуре (Т кр), величина которой зависит от
содерж ан ия воды в системе. Ткр достигает минимума, ка к только
общее содерж ание воды превыш ает то количество, которое мо­
гут связы вать липидные структуры. В то ж е время при тем пе­
ратуре выше 7 кр липиды могут находиться в упорядоченном со­
стоянии при недостатке воды. Ф азо в а я д и а г р а м м а д ля яичного
лецитина, х ар актери зу ю щ ая соотношение различных мезоформ
л ип и д а,в разны х условиях, п редставлена на рис. 16.
Д емонстративны м примером того, как существенно влияет
вода на фазовые переходы, является влияние перекисного окис­
ления липидов на фазовое состояние мембраны (Ю. А. В л ад и м и ­
ров и др., 1983). Н абл ю д аю щ ееся в результате перекисного окис­
ления мембранных липидов снижение Ткр объясняется увеличе­
нием содерж ания воды в бислое.
58
В области фазового перехода происходит несколько одновре­
менных событий: возрастает подвижность полярных +Ы— (С Н 3) 3-
групп; увеличивается вр ащ а тел ь н а я подвижность С— С-связей,
что приводит к облегчению транс-гош-переходов и образованию
кинков; увеличивается скорость л атерал ьн ой диффузии молекул.
Следствием этих изменений являю тся д ва в аж н ы х обстоятель­
ства: изменение геометрических разм еров бислоя, которое об ъяс­
няется латерал ьн ы м расширением площади, занимаемой каждой
молекулой фосфолипидов, и увеличение гидроф обного объем а
мембраны .
Б л а г о д а р я проявлению этих свойств в области ф азов о ­
го перехода бислоя более упорядоченные области мембраны
сосуществуют с у ж е «расплавленными» — наблю дается ф азовое
разделени е. В этих условиях д л я мембраны х арактерн о сущ ест­
вование разного рода дефектов, являю щ ихся основой облегчен­
ного взаимодействия белковых молекул, встраивания новых со­
единений, повышения проницаемости для ионов и т. д.
Термотропные переходы в однородном бислое — пример ко­
оперативных перестроек, в которых температурный интервал
перехода обратно пропорционален кооперативности. Д л я м уль­
тислоев дипальмитоилф осф атидилхолина А Гкр составляет 0,5°С,
для бислоя того ж е соединения ~ 7 ° , д ля гетерогенных биологи­
ческих мембран она может составлять еще большую величину.
Уширение температурного и нтервала фазового перехода х а р а к ­
теризует уменьшение разм еров кооперативной единицы. Ф ак то ­
ром, сообщаю щим бислою такую гетерогенность и снижаю щ им
его кооперативность, является встраивание белка в бислойные
структуры.
Ф азовы е переходы, индуцируемые температурой, являю тся
объективной характеристикой бислоя, состоящего из одного или
нескольких (двух или трех) компонентов. Они могут быть изме­
рены с помощью разнообразны х методов — сканирующей к а л о ­
риметрии, флуоресцентной спектроскопии, Э П Р (рис. 17). В слу­
чае более гетерогенных систем эти методы даю т результаты, с
трудом поддающиеся однозначной интерпретации (О. МагзЬ,
1983). Особенные сложности вы зы вает использование ЭП Р-спек-
троскопии из-за неясностей л окализации спиновых меток в гете­
рогенном бислое.
О днако фазовы е переходы в мембране индуцируются не толь­
ко изменениями температуры. Они могут быть вызваны сдвигом
рН среды, электрическим потенциалом, двухвалентными ка ти о ­
нами, способствующими образованию кластеров определенных
фосфолипидов и разделению фаз; фазовы е переходы сопровож ­
даю т эффект гормонов на биологические мембраны. В то же
время исследование термотропных переходов имеет не только
теоретическое значение: переходы такого рода осущ ествляются
в биологических системах при подготовке животных к гиберна­
ции или при выходе из зимней спячки, при терм оадаптациях,
адаптации мигрирующих рыб к морской воде и т. д.
59
Исключительно важ н ое биологическое значение ф азовы х пе­
рестроек бислоя зак л ю ч ается не только в том, что изменение
структурного состояния влечет за собой изменение подвижности
компонентов бислоя, возможность регулировать взаимодействие
мембранны х белков и т. д., но и в том, что в области фазового
перехода резко изменяется проницаемость мембран д л я ионов
(В. Ф. Антонов, 11982).

Асимметрия бислоя

Х а р акте р н а я особенность биологических мембран — р а зл и ч ­


ный состав липидов по обе стороны бислоя. Известны д ва м е х а­
низма, обеспечивающие асимметричное распределение фосф оли­
пидов в мембране. Один из них св язан с терм одинамической веро­
ятностью распределения в соответствии со стереоконфигурацией
их молекул. Д ействительно, при приготовлении липосом из смеси
фосфолипидов их бислой будет х ар актери зо в ать ся несимметрич­
ным распределением компонентов. Во внешней части бислоя при
формировании липосом о к азы в ается больше фосф атидилхолина, а
во внутренней — ф осф ати ди лэтанолам ин а: это обстоятельство об­
легчает образование изгибов, формирует градиент гибкости.
Второй механизм реализуется за счет различий в составе
среды по обе стороны бислоя в условиях нативной клетки. С вне­
клеточной стороны м ембрану омы вает среда с высоким содер­
ж анием N8+ и С а2+, со стороны цитоплазмы м ем брана контакти­
рует с М ^ 2+ и К+. Р азл и ч и я ионного состава вне- и внутрикле­
точной среды вносят в к л ад в создание и подд ерж ан ие изги­
бов.
Кроме того, асимметрия бислоя обеспечивается ферментами
л и п и д н о го обм ена и ли п и д -переносящ им и б елкам и. Последние
представляю т собой группу белков различной специфичности —
от высокоспецифичных, обеспечивающих обмен одного-двух ком­
понентов мембраны, до сравнительно мало специфичных, св язы ­
ваю щ их и переносящих к мем бранам (или от них) липиды р а з ­
личных классов. Перенос липидных молекул осущ ествляется в
виде комплексов с этими белками-переносчиками; при этом бе-
лок-липидные комплексы приобретаю т гидрофильную природу.
К ферментам, поддерж иваю щ им и создаю щ им асимметрию
мембраны, относятся главным образом липазы, система обмена
холестерина, а т а к ж е метилазы фосф атидилэтанолам ина. М ети ­
лирование ф осф ати ди лэтанолам ин а с превращением его в фос-
фатидилхолин осущ ествляется в д ва этапа: образование мономе-
тилф осф ати д ил этан о л ам и н а под влиянием м етилтран сф еразы / и
образование ф осф атидилхолина под влиянием м ети л тран сф ера­
зы II. Ферменты располож ены на разных сторонах бислоя. Фос-
ф атидилэтанолам ин, как и его предшественник фосфатидилсе-
рин, находится преимущественно на внутренней стороне бислоя.
В этой ж е области об наруж и вается и м етил тран сф ераза I.
60
М етилирование п обуж дает м онометилфосф атидилэтаноламин
перем ещ аться с внутренней стороны бислоя на внешнюю, где под
влиянием метилтрансф еразы I I заверш ается его превращение в
фосфатидилхолин. Этот процесс зав ерш ается локальны м сн и ж е­
нием микровязкости («разупорядочивание») бислоя, благопри­
ятствует увеличению л атеральн ой дифф узии белков, вызы вает
кластери зац и ю рецепторов, сборку олигомерных ансамблей. М е­
тилирование ф осф ати ди лэтанолам ин а является «сигналом», спо­
собным запустить функционально в аж н ы е мембранны е процес­
сы: связы вание рецепторов с лигандам и, освобождение медиато­
ров из синаптических окончаний и т. д. (Р. Н1га1а, Л. Ахе1гой,
1980).
Во фракци ях сарколем м ы сердца и саркоплазматического ре­
тикулума скелетных мышц обнаруж ен а способность к обратимо­
му ферментативному превращ ению ф осф ати ди лэтанолам ин а в
фосфатидилхолин. Э та реакц ия контролирует микровязкость и
градиент гибкости бислоя, а значит, и условия работы м ем бр ан ­
ных ферментов. П о к азан о, что п ревращ ение ф осф атидилхолина
в фосф атидилэтанолам ин ингибирует С а-А ТФ азу ретикулума и
эритроцитов, активирует Ыа, К-А ТФ азу микросом мозга. Есть
основания считать, что этот механизм регуляции существует и
в клетке (Л. Ма1о, 5. А 1етапу, 1983).
Кроме различий в заря де молекул фосфолипидов и р азл и ч ­
ной гидратации их полярных голов по обе стороны бислоя опре­
деленный в кл ад в создание мембранной асимметрии вносит т а к ­
же асимметричное расположение в мембране молекул инте­
гральны х белков (см. рис. 8).

Модификация бислоя белками


(проблема аннулярных липидов)
Внедрение белка в фосфолипидный бислой упорядочивает по­
следний, д ел ая его структуру более жесткой. Считают, что это
происходит за счет прилипания и ориентации фосфолипидных
молекул, прим ыкаю щ их к поверхности белка, где затрудняется
их подвижность. Липиды, образую щ ие такой слой, н азы ваю т ан-
н уляр ны м и . Р езультаты , указы ваю щ ие на снижение п одвиж но­
сти аннулярных липидов, получены разными методами. Ф луорес­
центный ан али з свидетельствует о повышении микровязкости би­
слоя при внедрении в него белковых молекул. ЭП Р-спектроско-
пия об наруж и вает ограничение подвижности зондов в бислое с
присутствующими в нем белками. Растворен и е мембранных бел ­
ков неионными детергентами приводит к получению солю били­
зированны х белок-липидных комплексов, вероятнее всего, это
комплекс белка с аннулярными липидами.
И золированны е в индивидуальном виде мембранные белки
мож но реконструировать в липосомы с разным соотношением
фосфолипид/белок и исследовать изменение ферментативных
свойств и физико-химических п арам етров бислоя в зависимости
61
от того, какое количество молекул липида приходится на 1 мо­
л екулу белка. При этом проявляю тся различия в поведении л и ­
пидов, не св язанны х с белком, и липидов, непосредственно при­
м ы каю щ их к белковой глобуле.
Н а рис. 18 приведены данные, характеризую щ ие наличие ан-,
нулярного слоя липидов при реконструкции бактериородопсина.

0,02 0,04 0,05 0,03 0,10 0,12


30 35 40
Температура, г С
45
Молярное отношение дактериородопсин/ди-
миристоилфосератидилхолин
Рис. 18. Влияние белка на свойства липидного бислоя. А — дифференциаль­
ная сканирую щ ая калориметрия смеси дипальмитоилфосфатидилхолина с бак-
териородопсином в разных соотношениях (указаны иад термограммами);
Б — изменение поляризации флуоресценции дифенилгексатриена в смеси бак­
териородопсина с димиристоилфосфатидилхолином при разных молярных со­
отношениях.
С трелк а у к а зы в а ет на с т а д и ю н асы щ ен и я м о л ек у л б а к т ер и о р о д о п си н а м о л ек у л а м и л и ­
п и д а при д о с т и ж е н и и 22-к р ати ого м о л я р н ого избы тк а д и м и р и ст о и л ф о с ф а т и д и л х о л и и а

Внедрение бактериородопсина в липосомы из дипальм итоилф ос­


фатидилхолина устраняет «предпереход» на кривых, получаемых
с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии, и
расш и р яет интервал температур, где н аблю дается фазовы й пере­
ход липида. При увеличении количества белка в пробе (сни ж е­
ние соотношения липид/белок) интервал перехода в еще большей
степени расш иряется, а высота пика снижается. Следовательно,
часть молекул липида не вклю чается в ф азовы е перестройки. При
значении молярного отношения липид/белок менее 25 фазовый
переход не регистрируется вообще (рис. 18, Л ) . Д ругими сло­
вами, около 20 молекул дипальмитоилф осф атидилхолина так
тесно связаны с к а ж д о й молекулой бактериородопсина, что не
вовлекаю тся в термоиндуцированные переходы.
Аналогичные результаты получены при измерении п о л я р и за­
ции флуоресценции гидрофобного зонда дифенилгексатриена,
величина которой соответствует упорядоченности бислоя. При
тем п ератур ах выш е критической в суспензии димиристоилфосфа-
тидилхолина п оляризация флуоресценции м ала (0,12), что соот­
ветствует высокой жидкостности фосфолипида. В страивание
бактериородопсина увеличивает поляризацию флуоресценции до
62
тех пор, пока при данной концентрации зонда все его молекулы
не окаж утся в окружении аннулярных липидов. При этом вели­
чина поляризации флуоресценции возрастает до 0,23 (рис. 18, Б ).
Эти опыты позволяют оценить различия в упорядоченности сво­
бодного от белка бислоя и аннулярного липидного окружения.
Эти же опыты позволяют рассчитать количество молекул липи­
дов, о круж аю щ и х каж д ую молекулу бактериородопсина: оно
равно 22.
Подобные данные были получены для других мембранных
белков. Так, найдено, что количество молекул фосфолипидов в
аннулярном слое цитохром-оксидазы равно 28— 30 и соответст­
вует ее молекулярной массе и разм ерам . Белковую молекулу
массой 120— 150 кД д олж ны о кр уж ать 30— 32 молекулы липи­
дов. Это и было найдено для Ыа, К-АТФазы. О днако в последнее
время эти представления стали подвергаться критике (О. СЬар-
ш ап, 1982).
О казалось, что делипидированные ферменты активируются
аннулярными липидами (к ак по отдельности, так и в разных со­
отношениях) не более чем на !10— 30%. Многие неаннулярные
липиды оказы ваю т лучшее действие на восстановление ф ерм ен ­
тативной активности мембранных липидов после удаления л и ­
пидного окружения. Б олее того, р я д детергентов т ак ж е э ф ф ек ­
тивно восстанавливает функциональную активность белка
(Е. И. Акимова, В. И. Мельгунов, 1981).
Степень реактивации коррелирует с величиной гидрофильно-
лппофильного б а л а н с а детергентов. Это означает, что гидрофоб­
ное окружение белков не о бязательно долж но быть специфиче­
ским. Изучение подвижности аннулярных липидов в мембранных
преп ар атах Са-А ТФ азы показало, что вокруг бел ка не сущ ест­
вует долгож ивущ его слоя липидов, по крайней мере, при тем пе­
рату р а х выше Ткр, необходимых д ля функционирования м ем бран ­
ных ферментов теплокровных. В ремя обмена «прочно связанных»
липидов с соседними молекулами составляет величины порядка
10-4— 10-5 с; это несоизмеримо меньше продолжительности од­
ного ферментативного цикла. Следовательно, аннулярные липи­
ды могут многократно обмениваться с общей липидной фазой уж е
в течение одного реакционного цикла и на его ход влиять не
могут.
Действительно, если контролировать солюбилизацию мем­
бранных фосфолипидов детергентами с помощью высокочувстви­
тельных методов, можно убедиться, что повышение концентра­
ции детергента экстрагирует из нативной мембраны все имею ­
щиеся там липиды с одинаковой скоростью, не д ел ая различий
меж ду аннулярными и неаннулярными (рис. 19).
Более того, использование спин-меченых фосфолипидов в
процессе реконструкции различных мембранных ферментов по­
зволило измерить скорость обмена молекул фосфолипидов между
аннулярным слоем и окруж аю щ и м и липидами. Д л я разных бел ­
ков обнаруж и вается своя доля иммобилизованного липида. По
63
вытеснению метки (рис. 20) из аннулярного слоя при д о б а в л е­
нии немеченого лип и да можно определить сродство каж д о го
липида к поверхности белка. Характерно, что значения стехио-

Рис. 19. 31 Р -Я М Р спектр мембран саркоплазматического ретикулума в при­


сутствии нарастающ их концентраций детергента С ц Е п (по М. Коих, РЬ.
С ЬатреП , 1984):
Ф э —■ф о с ф а т и д и л эт а н о л а м и н , Фи — ф о сф а т н д и л и и о зи т , Ф х — ф о сф а т и д и л х о л и и ; пик, с о ­
от в ет ст в у ю щ и й 31Р , п ом ещ ен д л я ср ав н ен и я к он ц ен т р ац и и су с п ен зи и в ези к у л р ет и к у л у м а

метрии связы ван и я липидов белком в аннулярном слое, изме­


ренной этим методом и рассчитанной из геометрических р а з м е ­
ров молекул белка, практически совпадали. Обнаружено, что

Рис. 20. Определение сродства липида к белку в аннулярном слое.


М о л ек у л а б^лка ( Р ) о к р у ж е н а м ол ек ул ам и ан н ул я р н ы х л и п и д о в (за ч ер н ен ы ). И н т ен си в ­
ность о б м е н а ан н ул я р н ы х л и п и д о в с ок р у ж а ю щ и м и л и п и д а м и , в ч и сл е котор ы х спин*
м еч ен ы е м олекул ы (п ом еч ен о зв ез д о ч к о й ) о п р е д е л я е т с я при пр оч их равны х у сл о в и я х
« ср о д ст в о м » м ол ек ул ы л и п и д а к п ов ер хн ости бел к а

д ля разн ы х реконструированных белков (цитохромоксидаза,


родопсин, Ыа, К -А ТФ аза, протеолипид миелина) ряды у б ы ваю ­
щего сродства фосфолипидов повторялись, т. е. сродство разных
64
фосфолипидов к белку определяется не спецификой белков,
а спецификой липидных молекул.

Модификация бислоя как способ регуляции


мембранных процессов
Существует целый р яд способов модификации фосфолипид-
ного бислоя, в результате которых изменяются асимметрия, г р а ­
диент гибкости, микровязкость, подвижность компонентов би­
слоя и ли его состав. Н и ж е будут суммированы основные спосо­
бы модификации, которые могут применяться к а к в процессе
регуляции метаболизма, т а к и д ля исследования свойств натив­
ных мембран.
Влияние на липидный состав. К группе модификаторов, изм е­
няющих липидный состав мембран, относятся липид-переносящие
белки, ферменты обмена фосфолипидов — фосфолипазы, деме-
ти лазы и пр., а т а к ж е системы обмена холестерина. В следствие
их деятельности осущ ествляется вы раж енное изменение со д ер ­
ж ан и я лизоформ отдельных липидов, накопление жирных кислот
в бислое, об ладаю щ и х детергентным действием, изменение соот­
ношения фосф атидилхолин/ф осф атидилэтаноламин или фосф оли­
пидов к холестерину. Все эти факторы, ка к отмечалось ранее, уп­
р авляю т микровязкостью мембраны и подвижностью ее компо­
нентов. Изменение микровязкости оказы вается существенным не
только д ля состояния внутримембранных структур, но и для
взаимодействия мембран друг с другом. Так, агрегации тромбо­
цитов долж ны предшествовать активац и я фосфолипазы и н а ­
копление лизофосфолипидов, облегчаю щее межмем бранны е
контакты.
Особого внимания зас л уж и в а ю т системы, регулирующие уро­
вень холестерина в м ембранах и роль самого холестерина
(Н.В. Перова, Е. Н. Герасимова, 1983; Ю. А. В ладимиров и др.,
1984). В страивание холестерина в фосфолипидный бислой вы зы ­
вает к а к нарушение квазикристаллической упаковки цепей при
температуре ниже Ткр, так и уменьшение подвижности (в о зр а с т а ­
ние упорядоченности) цепей при температуре выше Т1!р. Эти э ф ­
фекты холестерина н азы ваю т « разж и ж аю щ и м » и «конденсирую­
щим» соответственно. И збы ток холестерина увеличивает микро­
вязкость бислоя и пониж ает скорость таких реакций, которые
имеют диффузионно-зависимые лимитирую щие стадии. Оба эти
процесса составляю т характерную черту наследственных гипер-
холестеринемий, ишемической болезни сердца, атеросклероза.
Выяснение «вредной» роли холестерина в развитии атероскле­
роза д ал о основание многим клиницистам рекомендовать исклю ­
чение холестерина из диеты. Однако позж е было показано сущ е­
ствование в крови системы обмена холестерина и оказалось, что
в организме ежесуточно образуется гораздо больше холестерина,
чем поглощ ается его с пищей. Б о л ь ш а я часть холестерина окис­
ляется в печени до ж елчных кислот (см. выш е). Количество х оле­
3—133 65
стерина, оседающее в м ембранах, зависит от соотношения в п л а з ­
ме крови специальных липопротеинов, одни из которых «экстра­
гируют» холестерин из мембран (липопрот еины высокой
плотности, Л П В П ) , а другие (липопрот еины особо низкой плот­
ности, Л П О Н П ) способствуют его внедрению в мембрану.
В норме отношение атерогенных и антиатерогенных липопро­
теинов сбалансировано, и коэффициент атерогенности оп р ед ел я­
ется к а к ( Л П Н П + Л П О Н П ) / Л П В П (где Л П Н П — липопротеи­
ны низкой плотности, так ж е принимаю щ ие участие во внедрении
холестерина в бислой). Р я д животных о б л а д а ю т очень низким
значением этого коэффициента (например, собака, песец). У этих
животных н ел ьзя вызвать экспериментального атеросклероза
д а ж е при пищевой нагрузке холестерином.
П р и определении природной резистентности к атеросклерозу
об н аруж и ваю тся и парадоксы. Так, известно, что клеточные мем­
браны многих органов крысы достаточно легко подвергаются
атерогенным изменениям при алимент арной (п и щ ево й ) гиперхо-
лестеринемии. В ы раж ен н ы й атеросклероз сосудов наблю дается
уж е через 1—3 недели ежесуточного потребления организмом
15 мг холестерина на одну особь массой 150— 200 г. О днако в
одной из л аборатори й , изучающей механизмы развития атер о­
склероза, эта модель перестала «работать» — у крыс в ответ на
скарм ливаем ы й пищевой холестерин не об н ару ж и вали привыч­
ных нарушений мембран. А нализ свойств препарата холестери­
на п оказал, что в его составе об наруж и вается ряд продуктов
окисления холестерина. О казалось, что окисленный холестерин
не в состоянии в страиваться в мембраны; не уд ерж и вается в
мембранном бислое и эфир холестерина. Оба способа м оди ф ика­
ции молекулы холестерина, вероятно, используются мембраной
д л я защ иты от его избытка. Действительно, липопротеиновые
комплексы, уд аляю щ и е холестерин из мембраны, с о д ер ж ат ф ер ­
мент, этерифицирующий его молекулу — лецитин-холестерин-
ац и лтран сф еразу.
В последнее время обнаруж ен еще один способ снижения
уровня мембранного холестерина — использование в пищу по­
вышенного со д ер ж ан и я фосфолипидов, особенно тех, что содер­
ж а т полиненасыщенные ж ирные кислоты и легко образую т ми­
целлы (А. И. Арчаков и др., 1984). Так, введение в кровь
животным мицеллярной формы фосфолипидов соевых бобов на
фоне экспериментального атеросклероза сниж ает почти вдвое
содерж ание холестерина в эритроцитарных м ем бранах и восста­
навливает в них исходную активность транспортных ферментов.
Одновременно сниж ается агрегация тромбоцитов и коэф ф ици­
ент атерогенности, а микровязкость наруж ны х клеточных мем­
бран восстанавливается почти до нормального уровня.
Изменение гидратации бислоя. Этот ф ак тор зависит от при­
сутствия зар я ж ен н ы х фосфолипидов, так что может меняться,
например и при действии липид-переносящих белков. Однако
наиболее сильно гидратация бислоя изменяется при индукции
66
перекисного окисления природными факторами. Образую щ иеся
в качестве промежуточных продуктов гидропероксиды яв л яю т­
ся высокогидрофильными веществами, они эффективно р азр ы х ­
л яю т бислой, увеличивая доступность гидрофобных доменов для
воды. Именно по этим причинам перекисное окисление липи­
дов имеет такое «разруш ительное» влияние на состояние мем­
бран (Ю. П. Козлов и др., 1983; В. К аган, О. Орлов, 1986; Е. Ей-
ш агйз е! а1., 1984).
Ионофоры и каналообразователи. В недряю щ иеся в бислой
белки могут индуцировать неспециф ическую проводимость для
ионов и м алы х молекул. Это объясняю т ка к возможностью фор­
мирования неселективных каналов при образовании белковых
ассоциатов в бислое, так и разры хлен и ем упаковки бислоя за
счет упорядочивания слоя ан н улярн ы х липидов. К такой же не­
специфической проводимости приводит и процесс перекисного
окисления липидной фазы. Однако существуют и более специ­
фические способы обеспечения проводимости соединениям, для
которых нативный бислой непроницаем. Это р азнообразны е ан ­
тибиотики и другие биологически активные вещества, количест­
во которых б л а го д а р я успехам биоорганической химии с к а ж ­
дым днем в озрастает (Ю. А. Овчинников, 1984).
П ервы е природные ионофоры и кан алоо б разовател и были
обнаруж ены как антибиотики — они 'вы рабаты ваю тся микроор­
ганизм ам и в качестве «орудия» против врагов в «борьбе за сущ е­
ствование». В настоящ ее время структура многих из них р а с ­
ш ифрована, синтезированы их искусственные аналоги, зачастую
более эффективные, чем природные.
В мембранологии эти соединения используют д ля индукции
селективной или неселективной проницаемости мембранных
структур. В соответствии с этими зад а ч а м и мы кратко остано­
вимся на этих возможностях.
В а л и н о м и ц и н — циклический депсипептид, обладаю щ ий ис­
ключительно высокой селективностью к К+ и обеспечивающий
его проникновение через мембраны. Нактины — циклические по­
лиэфиры нонактиновой кислоты, классифицируемые по числу
присоединенных к лактонны м кольцам этильных радикалов, их
комплексы с Ыа+ и К+ об л а д а ю т различной устойчивостью, по­
этому в их присутствии на мембране мож ет созд аваться Ы а/К-гра-
диент. Н и гер и ц и н и м оненсин яв л яю тся заря ж ен н ы м и линейными
структурами, но образую т нейтральны й циклический гидрофоб­
ный комплекс с переносимым ионом; способны осуществлять К / Н ­
или Ыа/ЕЕобмен через мембрану. К р а ун ы — макроциклические
полиэфиры, обладаю щ и е коронообразной структурой. С интези­
рованы крауны, о бладаю щ и е приемлемой избирательностью для
Ыа+, С а2+ и М § 2+ (Б. А. Таш мухамедов и др., 1980). А23187 и
Х537А — ионофоры, считавшиеся до настоящ его времени вы соко­
селективными переносчиками С а 2+. Сейчас д л я них показан
ряд побочных эффектов, требующих осторожности в и нтерпрета­
ции их действия.
3* 67
ОН
соон Нигерииин

но

с и,

Фили.тин

ОН
N02

Ы0:
2,4-Динитрофенол

И а -К р а у н
В последнее -время находит широкое применение д ля исследо­
ваний транспорта С а 2+ через биологические мембраны антибио­
тик ионом ицин:

к к
сн, сн, с н 3

Этот инофор выделяю т из 81гер1отусез соп§1оЪа1и8, он активен


против грамположительны х, но не против грамотрицательных
бактерий; связы вает С а2+ со стехиометрией 1 : 1 ; разл и чает С а2+
и М ^ 2+ лучше, чем А23187, в то же время связы вает 5 г 2+, В а 2+
и одновалентные катионы незначительно. Ввиду высокого срод­
ства к С а2+ и своей липофильности иономицин способен перево­
дить С а2+ из водной ф азы в гидрофобную. От других п олиэфир­
ных антибиотиков его отличают два достоинства: вы р а ж ен н ая
способность поглощ ать свет при 300 нм и отсутствие флуоресцен­
ции, что позволяет определять в его присутствии С а2+ ф луорес­
центным методом (например, с к в и н о м -2 ).
Список ионофоров может дополнить ряд ж ирорастворимы х
слабы х кислот типа 2,4-динитрофенола, являю щ ихся протонофо-
рам и при рН, близких величинам р К их кислотных групп.
И з каналообразоват елей, которые образую т неселективные
структуры, способные пронизывать мембрану, наиболее распро ­
странены грамицидины, аламетицин, амфотерицин В, филипин.
Одни из этих соединений, такие как грамицидины, формируют
структуру кан ала независимо от компонентов мембраны, д ру­
г и е — как амфотерицин В или филипин, формируют канал вмес­
те с молекулами холестерина. П о этой причине они не в заи м о ­
действуют с мембранами, обедненными холестерином. Н екото­
рые кан алоо б разовател и имеют свободные заряды ; время жизни
формируемых ими каналов зависит от -мембранного потенциала.
Интересен тот факт, что разм ер каналов, образуем ых алам е-
тицином, зависит от его концентрации, поскольку увеличение кон­
центрации приводит к включению большего количества молекул
антибиотика в единичный канал.
Н есмотря на то что среднее время жизни ка н а л а в мембране
составляет 10_6— 10~8 с, к а н а л ь н а я проводимость на 2— 3 п о ряд ­
ка выше, чем проводимость ионофоров, поскольку д ля пересече­
ния м ем браны ионофору необходимо время. П о этой же причине
функция каналоф ормеров менее зависит от температуры, чем
функция ионофоров. В частности, последние практически не в со­
стоянии осущ ествлять перенос ионов при температуре ниже Ткр.
Солюбилизация мембранных структур. Этот процесс обеспе­
чивается детергентами-— группой амфильных соединений спо­
69
собных связы ваться с мембранны м белком гидрофобными с в я зя ­
ми, одновременно взаимодействуя полярными группами с водой.
В результате молекулы детергента сначала р азры хл яю т м е м б р а­
ну, при повышении их концентрации образую т смешанные м ицел­
лы, а затем и детергент-белковые комплексы (рис. 21). В ряде
случаев при замене липидного окруж ен ия на детергентное белок
сохраняет хотя бы некоторые свои функции.

М ембранный
белок

М ицелл ы
+ детергента.

С олю билизированны й
(.белок-липид-детергентны й
комплекс
Смешанные
мицеллы
+ детергента с
фосфолипидом

Рис. 21. В заимодействие детергента с мембраной

П о способности к мезоморфизму детергенты делят на две


группы. К гр уп п е А относятся детергенты, молекулы которых
способны о б разов ы в ать м ицеллярные и аналогичные структуры
(додецилсульф ат Ыа, цетилтриметиламмоний бромид, тритоны,
бриджы, лубр ол ы ). К приведенным детергентам группы А , об­
н ар уж и ваем ы м в тканях животных, относятся ж ирные кислоты
и лизофосфолипиды. К гр уп п е В относят детергенты, не способ­
ные к отчетливому мезоморфизму (холат Ыа, д езоксихолат Ыа,
дигитонин, сапонин).
Одной из в аж н ы х характери сти к детергента является крити­
ческая концент рация м и ц е лл о о б р а зо ва н и я (К К М ), поскольку
способ действия детергента на мембрану зависит от того, превы­
шает используем ая концентрация детергента эту величину или
не достигает ее. В первом случае детергент полностью солю били­
зирует мембранные структуры и вклю чает компоненты м е м б р а­
ны в собственные мицеллы, во втором — модифицирует м ем бра­
ну, не р а з р у ш а я полностью структуры бислоя. Величины крити­
ческих концентраций м и ц еллообразовани я для некоторых
70
детергентов при комнатной температуре представлены ниже. При
использовании фактических данных, однако, следует учитывать
зависимость этой величины от тем пературы и ионной силы среды..
Детергент КК.М, мМ
Д ецилсульф ат натрия .................................................... 33
Додецилсульф ат н а т р и я ................................................ 8,2
Тетрадецилсульфат н а т р и я ........................................... 2, 1
Миристат н а т р и я ............................................................ 4,1б
П альм итат н а т р и я ............................................................ 3,6
С теарат н а т р и я ................................................................... 0,2,
О леат н а т р и я ....................................................................... 0,02
Л инолеат н а т р и я ............................................................... 0/)5
Тетрадецилтриметиламмоний б р о м и д ...................... 4,Э
Ц етилтриметиламмоний б р о м и д ............................... 0,7
Яичный л и з о л е ц и т и н ....................................................... 0,9
Тритон Х - 1 0 0 ..................................................................... 0,24
Тритон Х - 1 1 4 ..................................................................... 0,2
Тритон Х - 4 5 ........................................................................ 0,11
Л уброл А У Х ......................................................................... 0Д)4
Холат н а т р и я ..................................................................... 14
Д езоксихолат натрия ..................................................... 5
Таурохолат натрия ......................................................... 10

Влияние фармакологических веществ. Многие средства, в том


числе и считавшиеся избирательными, способны в л и я ть непо­
средственно на физико-химическое состояние бислоя. Так, вещ е­
ства фенотиазинового ряд а , которые были введены в карди о л о­
гическую практику к а к специфические антиаритмические и
гипотензивные средства, подавляющ ие функциональную ак ти в ­
ность кальмодулина, оказал и сь агентами с гораздо более широ­
ким действием. Одно из наиболее активных соединений этого
ряда трифторперазин (трифтазин) мож ет взаимодействовать с
целым рядом С а-зависимы х белков мембранной локализации,
ограничивая их подвижность в мембране и затру д н яя функцио­
нирование (V. О. Ргокор)еуа е! а1., 1984).
Х ло р п р о м а зи н способен взаимодействовать непосредственно
с фосфолипидными компонентами мембраны и холестерином.
Д иф енилгидант оин, применяемый при лечении шизофрении, т а к ­
же является выраж енным мембранны м модификатором. И ссл е­
дование мембранотропных эффектов локальн ы х анестетиков
привело к созданию м ем бранной теории местного о б езб о ли ва ­
ни я (рис. 22). В основе действия антибиотиков т ак ж е зачастую
л еж и т влияние на целостность мембранных структур клетки.

Липиды как мишень для адаптации


Рост и деление клеток осущ ествляю тся организмом в условиях
постоянного обмена мембранны х компонентов с цитоплазмой,
поддерж иваю щ ей белковый, липидный и углеводный состав мем­
бран в состоянии динамического равновесия. Постоянство белок-
липидного состава мембран — раннее завоевание эволюции. Ос­
71
новной план химического строения мембран сформировался
очень давно — у разны х видов, не объединенных ни генетической,
ни экологической общностью, встречаются одни и те ж е фосф оли­
пиды в близких соотношениях (Е. М. Крепе, 1981). Видимо, этот
набор фосфолипидов обеспечил мембранным структурам какие-то

Действие
анестетика (А)

Ма"1

'Запр ет
конформа-
НИ ОН НО1 о
си г н а л а

(потенциал
действия
не возникает)

Рис. 22. М ембранная теория анестезии (по А. 5. ОапоН е! а1., 1982):


а — ф о сф о л и п и д н ы й би сл ой с о д е р ж и т Ы а-каиалы в зак р ы том состоя н и и ; б — в сл е д с т ­
вие в о з б у ж д е н и я Ы а-канал п р ет ер п ев а е т к он ф ор м ац и ои и ы е п ер естрой к и , п р и в о д я щ и е к
и зм ен ен и ю упаков ки о к р у ж а ю щ и х б ел ок л и п и дов , и п е р е х о д и т в откры тое состоя н и е;
в — м олекул ы а н ес т ет и к а , в н ед р я ясь в м ем б р а н у , р а зу п о р я д о ч и в а ю т о к р у ж а ю щ и е л и ­
пиды . ув ели чи в ая в н у т р ен н ее д а в л ен и е б и сл о я на бел ок : г — в этих у сл о в и я х в о з б у ж ­
д а ю щ и й им пульс не м о ж е т и н д уц и р ов ат ь к ои ф ор м ац и он и ы х и зм ен ен и й , п р и в о д я щ и х к
откры ванию Ы а-каиалов

еще не вполне ясные преимущества. Такими преимуществами мо­


гут быть терм одинамическая стабильность, динам ическая по­
движность, сочетание легкости обмена компонентами со средой
и определенная устойчивость структуры, избирательность. О д н а­
ко вопрос о том, каким образом определенный набор фосфолипи­
дов обусловливает те, а не иные свойства мембраны, не имеет од­
нозначного ответа.
В процессе онтогенетического созревания тканей выявляю тся
определенные закономерности в изменении липидного состава
72
клеточных мембран; ниже описано несколько основных из них.
Высокое сод ерж ан ие ф о сф ати ди лэтанолам ин а по отношению к
фосфатидилхолину и присутствие сфингомиелина, видимо, о тр а­
ж а ю т потенциальное «совершенство» мембран, поскольку эти по­
казател и увеличиваю тся в онтогенезе. Критерием определенного
усложнения мембран является зам ен а диацильной формы фос­
фолипидов на плазмалогенную , зам ена нервоновой кислоты сфин­
гомиелина на стеариновую (связан ная с появлением серого вещ е­
ства м озга). В онтогенезе происходит т а к ж е увеличение микро­
вязкости мембран за счет уменьшения количества ненасыщенных
жирных кислот (снижение индекса ненасыщенности).
Однако индекс ненасыщенности, так ж е как и ряд других ф а к ­
торов, регулирующих жидкостность мембран (положение двой­
ных связей, содерж ание жирных кислот с нечетным количеством
углеродных атом ов), в есь м а 'в ар и аб ел ен . Изменения этих вели­
чин о т р аж аю т механизм приспособления мем бран к изменяю ­
щимся условиям среды. Эволюционные (генетически зак реп л ен ­
ные) адаптации, сезонные акклим ати зац ии или акклим ац ия
в экспериментальных условиях осущ ествляю тся в ограниченные
сроки в ответ на дозированные изменения каких-либо ф акто­
ров среды, главный механизм д л я всех них — изм енение ж ирно­
кислотного состава м ем бран ны х ли п и д о в. Это положение позво­
лило Е. М. Крепсу выдвинуть концепцию о том, что биологиче­
ские мембраны являю тся м иш енью адаптации организма, струк­
турами, которые в первую очередь отвечают на изменения среды
приспособительной реакцией.
Приспособительная реакция организма демонстративно про­
является в процессе подготовки зимнеспящ их животных к гибер­
нации. Известно, что у таких животных в период спячки темпе­
р атура тела снижается до 5°С. М ем бранны е ферменты (при изу­
чении их в сезон бодрствования) при этой температуре уж е не
в состоянии функционировать, поскольку она гораздо ниже Ткр,
а в области тем ператур ниже фазового перехода мембраны слиш­
ком упорядочены, чтобы обеспечить конформационную л а б и л ь ­
ность белка. Однако .подготовка к зимнему сезону вклю чает и з­
менение фосфолипидного состава мембран и увеличение количе­
ства полиненасыщ енны х ж ирны х кислот в их составе. В резу л ь­
тате активность мембранны х ферментов таких животных о к а з ы ­
вается на достаточно высоком уровне д а ж е при понижении тем­
п ературы до 2°С (С. Л. СЬагпоск е! а1., 1980).
Мембранные
белки 4
Олигомерная организация

Г лобулярны е белки о б л а д а ю т повышенной лабильностью в


водном окруж ении. П о данны м Я М Р-спектроскопии установле­
но, что вода увеличивает свободный объем белковых глобул,
способствуя проявлению их внутренней конформационной по­
движности. И н а я ситуация возн и кает в случае гидрофобного
белка в мембране. В то время ка к вращ ение метиленовых групп
вокруг С— С-связей в бислое не требует свободного объем а, он
необходим д л я проявления конформационной лабильности мем­
бранного белка.
Существуют косвенные у к а за н и я на то, что внутренняя л а ­
бильность белков в озрастает при образовании ассоциатов из не­
скольких молекул. Возможно, именно это свойство обусловли­
в ает тенденцию мембранны х белков к олигомеризации. О б р а зо ­
вание олигом ерных ассоциатов не яв л яе тся случайны м
р езультатом «статистических взаимодействий» — образуем ые
структуры «запрограм мированы », соотношение субъединиц пред­
определено: в 'ряде случаев у д ается воспроизвести образование
таких структур спонтанно при реконструкции предварительно со­
лю билизированных комплексов. Л ипиды, участвуя в о р г ан и за­
ции мембранного бислоя, играю т важ ную роль в поддерж ании
нативной конформации мембранны х ферментов, контролируют
взаимоотношения между субъединицами внутри олигомерных
комплексов.
Д л я чего нужна т а к а я сл о ж н а я н ад м ол еку л яр н ая о р ган и за­
ция мембранны х структур, что получаю т молекулы взамен у т р а ­
чиваемой автономии? Н а эти вопросы не всегда мож ет быть дан
ясный и однозначный ответ. П ро щ е объяснить феномен н ад м ол е­
кулярной организации мембранны х систем, когда за счет меж-
белковых связей образую тся цепи, соответствующие м етаб оли ­
ческим (как в случае дыхат ельной ц еп и ), или когда образуем ые
74
ассоциаты о б ладаю т каким-либо дополнительным свойством: бо­
лее термостабильны, приобретаю т повышенную молекулярную
активность и т. д.
В ряде случаев ясно, что ассоциация гидрофобных белков не­
обходима д ля проявления функциональной активности, особенно
когда фермент состоит из несимметричных и комплементарно
соответствующих д руг другу субъединиц (V. Б е ^ а ш , 1980). Т а ­
кой случай н азы ваю т ит ерологической ассоциацией (в отличие
от и зо ло ги ческо й ассоциации, при которой взаимодействуют сим­
метричные протомеры, сохраняю щ ие «эквивалентность»). Пример
гетерологической ассоциации д ает гексокиназа, к атал и зи рую щ ая
фосфорилирование глюкозы в присутствии М §-АТФ (Н. Ю. Гон­
чарова, 1985). Гексокиназа сущ ествует в виде димера с моле­
кулярной массой 102 кД. Повышение рН или ионной силы вызы ­
вает диссоциацию димера, наличие обоих субстратов реакции —
ассоциацию. Субъединицы в ассоциате ориентированы несиммет­
рично: два типа кристаллов, о б н ару ж и ваем ы х на рентгенограм­
мах, соответствуют двум способам ассоциации. Д л я одного из
способов, соответствующего наличию ферментативной активно­
сти, показано, что группы, участвующие в о бразовании белково­
го домена, п р и н ад л еж а т различны м уч асткам каж дого прото­
мера. Это означает, что после связы вания партнеров к а ж д а я
м олекула в ассоциате имеет разн ы е группы в свободном со­
стоянии.
В отсутствие нуклеотида глю коза мож ет связы ваться лишь
с «нижней» глобулой димера, появление АТФ д ел ает субъедини­
цы равноценными в отношении связывания. Д им ер более акти­
вен, чем мономер. Более того, на границе взаимодействия про­
томеров формируется центр д л я связы ван и я дополнительной
молекулы АТФ, обеспечивающий аллостерическую регуляцию
активности.
Асимметричными являю тся т а к ж е и димеры креатинкина-
зы, — фермента с молекулярной массой 82,6 кД, обеспечиваю ще­
го обратимы й перенос «высокоэнергетического» фосф ата с аде-
ниловой системы на креатин. Об их асимметрии свидетельствует
р азл и ч н ая реакц ия субъединиц и а 5Н -реагенты . Гибридные ге­
теромеры образую т и аргинин киназа, вы полняю щ ая ан алоги ч­
ную функцию в ткан я х беспозвоночных (С. Н. Л ы зл о в а, 1981).
Существуют указан ия, что направление катализируемой этими
ферм ентами реакции (п рям ая или о б р атн ая креати нкин азн ая
реакц ия) зависит от того, мономерной или димерной формой
п редставлен ферм ент (Т. Ю. Л и п ская, 1985).
Д еги д р о ген а за 3-ф осф оглицеринового а льд егид а является
примером изологической ассоциации. Ее олигомерные ансамбли
составлены из эквивалентных протомеров, об ладаю щ и х исход­
ной ферментативной активностью (Н. К. Н а гр а д о в а , М. В. И в а ­
нов, 1984). Сборка ассоциата индуцирует асимметрию субъеди­
ниц и возможность кооперативной реакции на субстрат или ре­
гулятор.
75
К акую ж е функцию выполняет при этом липидное о к р у ж е ­
ние? Интересным примером фермента, для которого сущ ест­
вует простой и, по всей видимости, правильный ответ
на поставленный вопрос, яв л яется У Д Ф -глю куронилт ранс-
ф ераза, о б н а р у ж и в а е м а я в высокоактивной форме в соста­
ве микросомальных мембран печени. Этот фермент играет клю ­
чевую роль в нейтрализации как экзогенных, так и эндогенных
токсических веществ гидрофобной природы. Субстратом ф ер ­
мента являю тся спирты, фенолы, жирные кислоты, амины и д р у ­
гие соединения, в том числе вещества, загр язняю щ и е внешнюю
среду.
С равнение свойств У ДФ -глю куронилтрансф еразы , гидроли­
зующей водорастворимые субстраты, с ее свойствами, когда в
качестве субстратов выступают гидрофобные вещества, позво­
лило сделать вывод, что в образовании ансам блей У Д Ф -гл ю к у ­
ро н илтрансф еразы в мембране зал ож ен большой биологический
смысл: при образовании таких ансамблей возникают «гидрофоб­
ные карманы», способствующие концентрированию гидрофоб­
ных субстратов и ориентирующие их определенным об разом от­
носительно реактивных групп активного центра. Это приводит
к уменьшению энтропийного ф ак то ра свободной — активации
процесса. В данном случае липидная ф аза является непосредст­
венным участником каталитического акта.
Транспортные А Т Ф азы , функция которых заклю чается в
энергетическом обеспечении активного транспорта ионов, в н а­
тивной мембране так ж е представлены олигомерными конструк­
циями. Это было достоверно показано с помощью метода р а д и о ­
инакт ивации (метод радиоакт ивной миш ени, С. ЕПогу, 1979).
Принцип метода закл ю ч ается в определении кинетики инакти­
вации фермента в нативной мембране при ее облучении потоком
высокоэнергетических электронов. И спользуя эмпирическое
уравнение зависимости скорости инактивации от дозы радиации
(она пропорциональна р еальн ы м разм ерам фермента в м е м б р а­
не), можно найти эти р азм еры и соотнести их с молекулярной
массой протомера. Д л я Ыа, К -АТФ азы получено, что фермент в
мембране п редставляет собой молекулярную мишень, по к р а й ­
ней мере вдвое превыш аю щ ую разм еры молекулы. Аналогичные
результаты получены для Са-насоса ретикулума и К, Н -А ТФа-
зы слизистой ж елудка.
Первое предположение о биологической роли этих ассо ц иа­
тов заклю чалось в том, что мономеры соответствующих ф ерм ен ­
тов неактивны и активирую тся при образовании комплексов, но
вскоре были получены солю билизированные в детергентах мо­
номерные формы Ыа, К -АТФ азы и С а-А ТФ азы , об л а д а ю щ и е
гидролитической активностью. Б ы л о показано такж е, что воз­
растание жидкостности бислоя, индуцируемое низкими концен­
трациями детергентов группы В (например, дигитонин) или
ж ирных кислот, н ару ш ает м ежбелковые взаимодействия, но не
изменяет тип кинетического поведения ферментов этого класса.
76
О д н ако в этих условиях н аруш ается кооперативная реакция на
субстрат д ля Ыа, К-АТФазы. Д л я С а-А ТФ азы известно, что мо­
номерная ф о р м а не реагирует на факторы, вызы ваю щ ие разоб­
щение гидролитического и транспортного процессов. В связи с
этим возникает вопрос, на который пока что нет эксперимен­
тального ответа: какое значение имеет олигом ерная ассоциация
ионных насосов д л я осуществления их транспортной функции?
Возможно, о бразование олигомерных конструкций ионных
насосов повышает эффективность их функционирования, увели­
чивая количество транспортируемых ионов в расчете на 1 мо­
лекулу АТФ. Так, в лаборатори и й . Скоу было показано, что
Ыа, К -зави си м ая А ТФ аза, находясь в солюбилизированной (мо­
номерная) форме, связы вает меньшее количество ионов К +, а к ­
тивный транспорт которых осуществляет, чем в несолюбилизи-
рованном (димерное) состоянии.
Сопряжение гидролитической и транспортной реакций в про­
цессе работы ионных насосов зависит от состояния мембраны.
Так, на стехиометрию транспорта К+ и Ыа+ П аК -А ТФ азой
влияет тем пература, причем в области тем ператур 'ниже ТКр д ля
данного мембранного окруж ения н аблю дается эф ф ект раз общ е­
н и я — снижение стехиометрии транспорта (С. ЕНогу, 1981).
Граф,ики Аррениуса д ля транспортных А ТФ аз нелинейны с
переломом при температуре, соответствующей Ткр д л я данного
мембранного окруж ения. При этом вид гр аф и ка Аррениуса д ля
функциональной активности фермента можно использовать при
характеристике мембран.
Т ем пературн ая чувствительность ферментов, обеспечиваемая
специальными свойствами мембранных липидов, по-видимому,
гораздо глубж е проявляется в регуляции метаболизма, чем по­
л а г а л и ранее. Так, д ля ряда биологических объектов о б н а р у ж е­
ны та к и е критические температурные точки, о т которых зависит
не только поведение, но и внешний вид объекта. Р ако ви на корне­
ножки N ео§к>Ъоциа(1гта р а скуй егт а в ы р астает закрученной по
или против часовой стрелки в зависимости от того, при какой
температуре растет животное — ниже или выше ТКр (в этом слу­
чае ТКр со став л яет 7°С). Несомненно, что эта реакция на тем ­
п ературу обеспечивается поведением мембранны х липидов.
Н едавно отечественными учеными обнаруж ен многообещ аю­
щий феномен, названны й м о л е к у ля р н о й памятью ли п и д о в
(Л. Д . Бергельсон, 1984). Суть его закл ю ч ается в том, что мно­
гие краткосрочные события, протекающие в мембранном бислое,
влияю т на долговременные парам етры его функционирования.
При воздействии соответствующего лиганда на мембранный бе­
лок-рецептор конформация последнего изменяется, что индуци­
рует изменение ка к белок-липидных контактов, так и состояния
липидов, окруж аю щ их белок. Это изменение в состоянии липи­
дов сохраняется и после отщепления лиганда от рецептора, т. е.
служ и т способом закрепления рецептора в «возбужденной» кон­
формации. Таким образом, «память» липидов обеспечивает уси­
77
ление сигнала, передаваемого из внешней среды на клеточную
мембрану.
Это неизвестный ранее механизм усиления, не похожий на те
механизмы, в основе которых л е ж а т ферментные каскады (н а­
пример, а д е н и л ат д и к л а зн а я система). Этот механизм т ак ж е
требует «внешней» энергии — от нее зависит длительность воз­
бужденного состояния мембранного рецептора. По мнению
Л. Д . Бергельсона, таким источником энергии в данном случае
яв л яется фазовое разд ел ени е липидов в мембранном бислое.
С помощью флуоресцентных аналогов глико- и фосфолипидов
показано, что бислой способен воспринимать и сохранять в п а ­
мяти информацию об изменении состояния мембранных белков.
Этим можно объяснить сверхвысокую чувствительность биологи­
ческих структур к простагландинам и другим биологически а к ­
тивным соединениям, при которой одна м олекула лиганда может
полностью перестроить х ара ктер клеточного метаболизма.
Е щ е один важ н ы й см ысл об разован ия белковых олигомеров в
мембране мож ет быть связан с изменением их термостабильно­
сти. Однако, несмотря на простоту проверки, эта гипотеза до сих
пор не получила экспериментальной оценки. Существует т ак ж е
точка зрения, что, поскольку мембранные белки ста б и л и зи р о в а­
ны бислоем и время их жизни увеличено, мембранную форму
белка можно рассм атривать ка к запасн ую (С. И. Аксенов, 1983).
Д л я периферических белков, которые, ка к кальмодулин, могут
обратимо диссоциировать от мембраны и регулировать р а зл и ч ­
ные проявления метаболизма, эта точка зрения не лиш ена осно­
ваний.

Функции мембранных белков


Специфической особенностью мембранных белков является то
обстоятельство, что они функционируют под контролем липидной
фазы. Р асс м атр и в ая различны е классы таких соединений, надо
принимать это во внимание.
Транспортные белки. К транспортным мембранны м б елкам
относятся как интегральные структуры, обеспечивающие актив­
ный транспорт ионов — ионны е насосы (Ыа, К-АТФ аза, Са-
А Т Ф а за), т а к и низко м о л ек у ля р н ы е пер ено сч и ки , в числе кото­
рых Ыа/Са-обменник и А Т Ф /А Д Ф -трансл о каза, способствующие
специфическому обмену указан ны х соединений через м е м б р а н ­
ные структуры.
Ионные насосы д л я своей деятельности требую т энергии АТФ.
Характерно, что в физиологических пределах концентраций ио­
нов, которые переносятся ионными насосами, эти молекулярные
машины не зав и сят от создаваемого ими ионного градиента —
эффективность их работы уп равляется иными механизмами. Н а ­
против, тран слоказы контролируются как потенциалом на мем­
бране, так и величиной градиента переносимых ими веществ:
так, направление работы Ыа/Са-переносчика зависит от концен­
78
трации Ыа+ и С а2+ по обе стороны мембраны и тем самы м от ин­
тенсивности работы соответствующих ионных насосов.
Рецепторы и каналы. В аж н ой функцией мембранных белков
является их участие в специфическом узнавании определенных
биологически активных молекул. Эти молекулы могут иметь бел­
ковую (к ак инсулин), стероидную или иную природу. В каж дом
конкретном случае у знавание обеспечивается б лаго даря специ­
ф ической структуре центра связы ва н и я на молекуле белка-рецеп­
тора. Р езультатом связы вания лиганда с соответствующим р е­
цептором на мембране является транспорт этого лиганда через
мембрану или открывание канальны х структур, которые часто
оказы ваю тся связанны ми с рецепторными структурами (к ак в
случае ионных к а н а л о в ), или изменение активности ферментов,
управл яем ы х этими рецепторами. Д емонстративны м примером
последнего типа является фермент п лазматических мембран аде-
нилат циклаза, катализирую щ и й образование 3', 5'-цАМФ в ре­
зультате активации Р-адренорецепторами после их взаимодейст­
вия с адреналином или адреномиметиками.
Поведение белков-рецепторов в мембране, к а к и их сродство
к л иганд ам и «исполнительным структурам», зависит от м и кр о ­
вязкости окруж ения. Так, мембранны е липиды, контролируя л а ­
теральную дифф узию белков-рецепторов в бислое, обеспечивают
регуляцию ответа клетки на внешние факторы. Многие л е к а р с т­
венные вещества влияю т на метаболизм клетки именно на мем­
бранном уровне, изменяя чувствительность клеточных рецепторов
к лигандам.
Используя специфические метки на мембранные рецепторы,
мож но рассчитать количество и расположение белков-рецепторов
на мембране. Так, на плазматической мембране мышечных кле­
т о к — сарколем м е — об наруж и ваю т четыре основных типа рецеп­
торных белков, регулирующих мышечную активность: Йа, К-
А Т Ф аза, рецепторы С а-каналов, р-адренорецепторы и мускарино-
вые рецепторы ( т а б л . 12).
Таблица 12. Рецепторы сарколеммы сердца собаки

К оли ч ество
Л и га н д , и сп ол ь зуем ы й К о л и ч е­ м о л ек у л
Р е ц еп т о р д л я узн а в а н и я ств о иа ли п и до в на
1 мкм* 1 рецептор

И а-Н асоса Уабаин 330 8 500


С а-К аналов Нитрендипин 4 200 000
р-Адренергиче- Дигидроальпрено- 2 1 400 000
ский лол
Мускариновый Квинуклидинил- 5 530000
беизилат

Рецепторы С а-кан ал ов регулирую т деятельность этих к а н а ­


лов, о ткры вая их при взаимодействии с соответствующими л и г а н ­
дами и з а к р ы в а я после диссоциации. Этим обстоятельством м о ж ­
но воспользоваться в случае, когда требуется «перекрыть» Са-то-
79
ки в клетку. Д л я этой цели применяют лиганды, похожие по
своей структуре на природный, и по этой причине связы ваю щ иеся
избирательно и с высоким сродством с рецепторам и С а-каналов.
И звестна обш ирная группа производных дигидропиридина, о б л а ­
д аю щ и х высоким сродством к рецепторной части С а-кан алов и
способных ингибировать Са-токи в клетку (одним из них яв л яе т ­
ся нитрендипин,-, см. табл. 12); формулы некоторых из этих ве­
ществ приведены ниже.

0-600

Эти соединения находят применение и в медицинской п р ак ти ­


ке д л я лечения или профилактики заболеваний, в основе которых
л еж и т повышение проницаемости клеток д ля С а 2+: сердечная не­
достаточность в разны х формах, гипертонические явления и т. д.
К роме того, эти вещества, особенно те из них, которые обладаю т,
ка к фелодипин, собственной флуоресценцией, — полезный инстру­
мент в исследовании мембранных рецепторов.
Сродство специфических лигандов известной структуры к оп­
ределенным рецепторам можно использовать так ж е для реконст­
рукции лиганд-связы ваю щ его центра белков-рецепторов
(Ю. А. Овчинников, 1984). Б л а г о д а р я таком у подходу была осу­
ществлена реконструкция ацетилхолин-связываю щ его центра хо-
линорецептора зрительного ган глия ка ль м а р а.
Белки, определяющие иммунные свойства. Эти белки т а к ж е
обращ ены во внеклеточную среду, но в отличие от гормональных
рецепторов могут быть как периферическими, так и интегральны ­
ми. Специфику иммунного ответа клетки в связи с состоянием
мембраны активно исследуют (Р. В. Петров, 1982).
Белки цитоскелета. С внутренней стороны к плазматической
мембране п рим ыкаю т структуры, не относящ иеся собственно к
80
мембране, но составляю щ ие ск ел ет клетки. Цитоскелет в кл ю ча­
ет элементы двух типов: микрофиламенты и микротрубочки.
М икроф иламент ы состоят из актиноподобного белка, его об р ати ­
м а я п олим еризация происходит аналогично п ереход у актина из
глобулярного в ф ибриллярное состояние. М икрот рубочки — ци­
линдрические структуры с диаметром 20— 30 нм, образованные
м олекулами тубулина. С амосборка трубочек происходит под
влиянием ГТФ; п о лим еризация сопро вож д ается гидролизом
ГТФ. К аж д ы й виток спирали микротрубочек о бразуется из 13
молекул тубулина, который состоит из двух цепей с общей мо­
лекулярной массой 55 кД. Ф осфорилирование тубулина специ­
альными протеинкиназами ускоряет сборку трубочек, а С а2+
в ы зы вает их диссоциацию.
И з этого примера видно, ка к в а ж н ы д ля жизнедеятельности
клетки системы, поддерж иваю щ ие в ней низкий уровень свобод­
ного кальция. Порча этих систем озн ачает смерть клетки — по­
вышение концентрации в ц итоплазм е ионов Са р а з р у ш а е т цито­
скелет клетки. Одновременно Са2+ активирует фосфолипазы би­
слоя, которые р азр у ш аю т молекулы фосфолипидов мембраны.
З а к и с л я е тс я внутриклеточная среда, активирую тся лизосомаль-
ные ферменты, и процессы аутолиза п риводят к лизированию
клетки. В а ж н а я роль цитоскелета состоит в поддерж ании ж е с т­
кой конструкции клетки и противодействии изменениям осмоти­
ческого объема. Однако, кроме того, цитоскелет «армирован»
многими ферментами, которые ориентированы таким образом,
что их последовательность соответствует метаболическим путям,
осущ ествляемым в клетке. Так, большинство ферментов глико­
лиза ориентировано на цитоскелете эритроцитарных мембран
(рис. 23).
Регуляторные белки. М ем бранны е белки — регуляторы м е т а ­
болизма — можно раздели ть в первом приближении на две
большие группы. П редставители 1-й группы изменяю т .интен­
сивность ключевых реакций метаболизма, не меняя его н ап р ав ­
ления, представители 2-й группы модифицируют метаболизм,
и зм ен яя направление обмена .веществ.
Типичным регулятором 1-й группы является к а л ь м о д ул и н —
низкомолекулярны й (М г= 1 6 ,7 кД ) С а-связы ваю щ ий белок, спо­
собный обратимо соединяться с мембранными структурами. Его
первичная структура, состоящ ая из 148 аминокислот, в н асто я­
щее время расш иф рована. Примерно 30% аминокислот пред став­
лено аспартатом и глутаматом, в то время ка к цистеина, пролина
и оксипролина в нем вообще не обнаруж и вается. По этой причи­
не молекула кальмОдулина о б л а д а ет высокой конформационной
лабильностью. Четы ре центра связы вания д л я двухвалентных
катионов в его молекуле о б л а д а ю т высоким (два) и очень высо­
ким (остальные д в а ) сродством к С а 2+. Д ей ствие кальм одулина'
связано с обеспечением кальциевой регуляции работы многих
ферментов, при этом происходит и увеличение чувствительности
к нему С а-транспортирующей системы. Так, ак кум ул яц и я С а2+ в
4— 133 81
адипоциты в присутствии кальм одули на в о зр аст а ет в 3 р а за при
д о бавк е 0,7 мг к а ль м од ул и н а/м л суспензии (43 нМ ). П рисутствие
кальм од ули на в м ем бран ах эритроцитов ум еньш ает Ка ионных
центров Са-насоса д л я С а2+ приблизительно ,в 30 раз, одновре­
менно увеличивая м аксимальную скорость его работы (5. О г 1оу „
Уи. РозШоу, 1984).

Р ис. 23. Взаимодействие Ш , К-АТФ азы и ферментов гликолиза на мембране


эритроцитов (по А. К. 5о1отоп е{ а 1„ 1985);
/ — N 3 , К -А Т Ф а за , / / — б ел о к полосы I I I , I I I — ф ер м ен ты гл и к о л и за ; 1,3-Д Ф Г К —
1 ,3 -д и ф о сф о г л и ц ер и н о в а я к и сл о та , 3-Ф Г К — Э -ф осф огл и ц ер и н ов ая к и сл ота, Ф Е П — ф о с-
ф о е н о л п и р о в и и о гр а д и а я к и с л о т а , П В К —’ п и р о в и н о г р а д н а я к и сл о т а , М К — м о л о ч н а я к и с­
лота

К альмодулин можно экстраги ровать обработкой мембран щ е ­


лочным раствором ЭДТА. Это сн и ж ает его содерж ание до одной
молекулы на 400 молекул Са-насоса. У даление кальмодулина су­
щественно п ониж ает чувствительность насоса к С а2+. Э ф ф ект
обратим: будучи д обавлен в среду, кальмодулин легко с в я зы в а ­
ется с молекулами Са-насоса, Ка д л я этого 'комплекса составляет
2— 15 нМ при микромолярной концентрации С а 2+ в среде.
Кальмодулин способен активировать работу многих ключевых
ферментов клеточного м етаболи зм а — фосфодиэстеразы, кнназы
фосф орилазы и др. По кинетическим п а р ам ет р ам ферменты, а к ­
тивируемые кальмодулином, мож но раздели ть на две группы —
в одной из них ак тив ац и я приводит к возрастанию м акси м ал ь н о й
скорости реакции без изменения К т , к а к в случае фосф одиэсте­
разы ; в другой — происходит не только в озрастани е скорости р е ­
82
акции, но и многократное увеличение сродства к лигандам , акти­
вирую щ им работу фермента, — как, например, в случае С а-насо­
с а п лазматических мембран.
В основе влияния кальмодулина на эти кинетические п ар ам ет ­
ры , видимо, л е ж а т разны е механизмы. Увеличение максимальной
скорости реакции мож ет происходить в том случае, когда в ре­
зультате о б разо в ан и я комплекса С а2+ с кальмодулином о б разу­
е т с я обширная гидрофобная зона, и за счет неполярных взаи м о­
действий меж ду комплексом Са + кальмодулин и активируемым
ферм ентом последний переходит в иное конформационное сос­
тояние, характери зую щ ееся большей ферментативной активно­
стью.
Этот эф ф ект может имитировать целый ряд ам фифильны х со­
единений, в том числе ж ирны е кислоты, детергенты и т. д.
В случае влияния на Кт основную роль играют электростати­
ческие взаимодействия меж ду положительно зар яж ен н ы м и
у ч астк ам и фермента и отрицательно заряж ен н ы м и группами
кальмодулина. В результате доступность С а2+ д ля соответствую­
щ и х участков на молекуле активируемого фермента возрастает
и значение Кт снижается. В регуляции этого типа кальмодулин
м ож но заменить полианионами типа кислых пептидов, кислых
фосфолипидов, например полиф осф оинозит идов, и д а ж е таким
анионом, как распространенны й буфер Н Е Р Е 5 (С. Н. Орлов
и др., 1985).
Все кальмодулин-чувствительные белки с о д е р ж а т специаль­
ны е центры связы ван и я этого регулятора, однако д л я того, чтобы
связы в ан и е произошло, необходимы ионы Са. К омплекс д о ста­
точно прочен, и в р я д е случаев, например в случае ки н а зы фос-
ф ор и ла зы , кальмодулин выступает в качестве субъединицы фер­
мента (так н азы ва ем а я дельта-субъединица киназы ).
В случае Са-насоса эритроцитов связы вание кальмодулина с
молекул ам и насоса происходит медленно и обратимо. П ри физио­
логических концентрациях С а2+, М&2+ и кальмодулина лиш ь око­
л о половины молекул Са-насоса находится в комплексе с к а л ь ­
модулином. Увеличение концентрации ионизированного Са внут­
ри эритроцитов приводит к насыщению центров связы вания этого
иона на молекулах кальмодулина, что повышает сродство послед­
него к Са-насосу. К огда три из четырех С а-связы ваю щ их центров
кальмодулина зан яты С а2+, достигается максим альное сродство.
Таким образом, повышение уровня свободного Са в цитоплазме
кооперативно стимулирует о б разован ие комплекса кальмоду-
лин-С а-насос и активирует работу последнего.
В клетках, подверженных злокачественной трансформации,
об н а р уж и ва ется повышенный уровень кальмодулина и соответст­
венно более вы сокая активность Са-насоса. Это стоит в непосред­
ственной связи с устойчивостью этих клеток против внешних воз­
действий и с более низким, чем в контроле, уровнем С а2+ в их
цитоплазме. Ингибиторы цитоскелета, винбластин, винкристин
и др. препятствуют действию кальмодулина, что у казы в ает на не­
4* 83
обходимость нативной структуры примембранного слоя д л я осу­
ществления его действия.
И сследование кальм одули новой регуляции метаболизм а все
в большей степени увеличивает число процессов, на которые он
оказы в ает влияние. Возможно, существует большее количество
реакций, которые д олж н ы регулироваться кальмодулином. Это
мнение Какиуш и (5. К акш зЫ , 1983), который приводит расчеты
со д ер ж ан и я кальмодулина в мозге — около 400 мг /кг сы рой м а с­
сы (24 м кМ ). М енее чем 10% этого количества достаточно, чтобы
с избытком «обслужить» все известные сейчас ферменты мозго­
вой ткани, регулируемы е кальмодулином. З а ч ем нужен этот из­
быток регулятора, пока неясно.
Д ругой регуляторный мембранны й белок — ф осф оламбан,
кислый гидрофобный белок (М,.= 11 кД ) со склонностью о б р а зо ­
вывать димеры — обнаруж ен в составе мембран саркоп лазм ати -
ческого ретикулума сердца. Он ответствен за проявление п о лож и ­
тельного инотропного действия норадреналина, осущ ествляю щ е­
гося через цепь, которая вкл ю чает активацию ад енилатциклазы ,
образование активной формы цАМ Ф-зависимой протеинкиназы и
фосф орилирование ОН-группы серина в молекуле ф осф оламба-
на. В фосфорилированном состоянии ф осф олам б ан сти м ул и ру­
ет Са-насос ретикулума миоцитов, ускоряя тем самы м восста-
навление кальциевых градиентов в сердечной мышце (Д . О. Л е ­
вицкий, 1982).
И сследование регуляторной роли ф осф олам б ан а показало,
что кроме участков, фосфорилируемых цАМ Ф-зависимыми про-
.теинкиназами, на его молекуле сущ ествуют участки фосфорили-
.р о в а н и я С а-кальм одулин-зависимы м и протеинкиназами. Таким
образом, регуляторны е эффекты этих двух белков п ер ек р ы в а­
ю т с я — фосф оламбан испыты вает регулирую щ ее действие к а л ь ­
модулина (Ь. Р1апк е! ак, 1983).
К а к видно из рис. 24, ф осф олам б ан содерж ит два центра
фосф орилирования: один из них является мишенью д ля цАМФ-
зависимой, а другой — д л я С а2++ к а л ьм о д у л и н -зав и с и м о й проте-
инкиназ. П о данны м А. Ш а м у и соавторов, нарушение в за и м о ­
действий между мономерами Са-А ТФ азы в мембране приводит
к нарушению работы Са-насоса. Без ф осф олам б ан а Са-насос
сердечной мышцы п роявляет лиш ь гидролитическую активность.
Реконструкция целого комплекса и фосфорилирование ф осф о­
л а м б а н а по 1-му (кальм одулин-зависимому) участку востанав-
ливает аккумулирую щ ую способность системы. Ф осф орилирова­
ние участков 2-го типа (цАМ Ф -зависимые) дополнительно уве­
личивает м олекулярную активность Са-насоса. В м ем бранах
саркоплазматичеекого ретикулума сердца о бнаруж ен а и фосфо-
. протеинф осфатаза, которая обеспечивает дефосф орилирование
участков ф осф олам б ан а обоих типов, выполняя при этом функ­
цию «разобщ ителя» Са-насоса.
Активность всего комплекса и взаимодействие его компонен­
тов д о лж н ы зависеть от состояния липидного бислоя. И хотя

84
прямы х данных, иллю стрирующ их эту зависимость, не получе­
но, тот факт, что фосфорилирование ф осф олам б ан а д ел ает его
недоступным влиянию протеаз, позволяет заключить, что при
фосф'орилировании этот белок изменяет свое положение в мем­
бране относительно других участников ан са м б л я (см. рис. 24).

Рис. 24. Регуляция С а-насоса саркоплазматического ретикулума сердца фос-


фоламбаном (Ф л):
I — ф о сф о р и л и р о в а н и е п ер в ого ц ен тр а ф о с ф о л а м б а н а С а+кальм одулин (К М ) — з а в и ­
си м ой п р о т еи и к и н а зо й , /У — ф осф о р и л и р о в а н и е в торого ц ен тр а цА М Ф — за в и си м о й про-
теи и к н и а зо й , / / / — д е ф о с ф о р и л и р о в а и и е м ол ек ул ы ф о сф о л а м б а н а п р о т еи н ф о с ф а т а зо й ;
п о л о ж е н и е ф о сф о л а м б а н а от н оси тел ь н о г л о б у л С а -и а со са н б и сл о я за в и си т о т его
ф о сф о р и л и р о в аи н ост и

Р ассм отрен н ая р егуляция транспорта С а2+ имеет, как н ед ав ­


но выяснили, широкое распространение. Белок, подобный фос-
ф олам бан у, обнаруж ен в сарколемм е крыс. К альцидукт ин с а р ­
колеммы сердца собаки по ряду свойств т а к ж е чрезвычайно
похож на фосф оламбан. Он фосфорилируется цАМФ-зависимой
протеиикиназой, при этом Са-токи через мембрану у вел и чи ва­
ются в несколько раз. Этот ф а к т мож ет о тр а ж а т ь возрастание
склонности компонентов С а -к а н а л а к ассоциации и ф о рм и ро в а­
нию «рабочего состояния» канальны х структур.
С равнительно недавно во ф ракции плазматических мембран
гладких мышц обнаруж ен еще один регуляторный белок, моду­
лирующий процесс ф осф орилирования мембранны х белков в з а ­
висимости от присутствия и концентрации ионов м агн и я, —■маг-
м одулин.
К регуляторным белкам 2-го типа относятся протеинкиназы.
В н астоящ ее в р е м я известно семь типов киназ, фосфорилирую-
щих клеточные белки. К а к правило, активац и я процесса ф осф о­
ри ли ро в ан и я приводит к существенным перестройкам процесса
85
обмена веществ, что проиллюстрировано ниж е на примере уч ас­
тия киназ в регуляции клеточного м етаболи зм а (табл. 13).
Таблица 13. Участие киназ в регуляции метаболизма
(по Е. С. Северину, М. Н. Кочетковой, 1985)

Н азван и е Х ар ак тер и ст и к а Р о л ь в о б м е н е в ещ еств

Л -К иназа цАМ Ф -зависимая Регуляция транспорта


ионов и метаболитов че­
рез мембрану, ингиби­
рование стадии деления
клетки
Г-Киназа Тнрозин-киназа, зависимая Участвует в реализа­
от диглицеридов и активи­ ции эффектов сарк-гена
руемая фосфолипазой С на метаболизм
С-К иназа Са-активируемая, регулиру­ Регуляция клеточного
ется фактором роста, необра­ цикла?
тимо активируется форболовы-
ми эфирами
О -Киназа цГМ Ф -зависимая Регуляция транспорта
ионов?
С аМ -Киназа Са-кальмодулин- зависимая Регуляция транспорта
ионов, гликолиза и д р у ­
гих процессов, завися­
щих от кальмодулина
К азеинкиназа Зависит от двухспиральной Функция неясна
РНК
Н ерегулируемая Выраженные свойства не »
протеинкиназа известны

Смена стадий клеточного цикла регулируется так н азы вае-


ваем ы м и вторичными мессендж ерами — веществами, которые
появляю тся или образую тся ,в клетке в ответ на пер ви чн ы й м ес­
сендж ер (внешний сигнал) и которые действуют чащ е всего на
мембранны е регуляторны е белки. Н аиб ол ее важ н ы е посредни­
ки, ответственные за реакцию клетки на внешние сигналы, —
цАМФ, кальмодулин и 2',5'-триолигоаденилат (биологически
активное производное адениловой кислоты).
Современные представления о взаимодействии системы цик­
лического АМФ и олигоаденилат а вы гл ядят следующим о б р а ­
зом (К. Т. Турпаев и др., 1984). Р ост внутриклеточной концен­
трации цАМФ индуцирует образование олигоаденилат-синтета-
зы. П ри этом причина, п р ивод ящ ая к росту уровня циклическо­
го нуклеотида, оказы вается неваж ной — в эксперименте о д и н а­
ковый р езультат мож ет быть достигнут за счет активации
ад ен и л атц и к лазы адреналином или подавления фосфодиэстера-
зы цАМФ теофиллином. И ндукция олигоаденилат-синтетазы в
клетке мож ет быть обеспечена т а к ж е и за счет активации систе­
мы цАМФ интерфероном.
Интересным примером обратной связи является следующий
ф акт, установленный при исследовании взаимодействия двух р е­
гуляторных систем: цАМФ ингибирует ф осф одиэстеразу 2',5'-оли-
86
г оад ен и лата, который в свою очередь активирует фосфодиэсте-
разу цАМФ. Таким образом, цАМФ обеспечивает рост уровня
внутриклеточного регулятора метаболизма, который со зд ает ус­
ловия для снижения концентрации исходного активатора (рис.
25). Учитывая известные в настоящ ее время данны е о внутри-
Клеточная
мембрана

Рис. 25. Взаимодействие регуляторов клеточного метаболизма (по Е. С. Севе­


рину, М. Н. Кочетковой, 1985):
П К - п р о т еи и к и и азы , ол и гоА — о л и г о а д е н н л а т , 2 ,5 -Ф Д Э — ф о с ф о д и э с т е р а з а о л и г о а д еи н -
л а т а , 3 \ 5 '-Ф Д Э — ф о с ф о д и э с т е р а з а цА М Ф ; ф акторы р о ста , и н т ер ф ер о н и кальций вы­
ст у п а ю т к ак ин и ц и аторы и зм ен ен и й м е т а б о л и з м а (п ер в и ч н ы е м е с с е н д ж е р ы ), цА М Ф ,
к а л ь м о д у л и и и каль ц и й — к ак втори чны е п оср ед н и к и , о л и г о а д е и и л а т — третичны й м е с с е н д ­
ж е р или н еп о ср ед ст в ен н ы й и сп ол н и т ел ь э ф ф ек т о в , и н д у ц и р у ем ы х внеш н ей ср ед о й ;
тон к и м и ст р ел к ам и о б о зн а ч е н о и зм ен ен и е актив ности а ге н т а , толсты м и — и зм ен ен и е
ск о р о сти ег о си н теза

клеточной роли олиго адени л ата, можно с уверенностью утверж-


дать, что по крайней мере один из механизмов, обеспечивающих
цитостатическое действие цАМФ, связан с увеличением уровня
олигоаденилата в клетке.
В процессе смены стадий клеточного цикла происходят сл е­
дую щ ие события: на стадии 5 активирую тся А-киназы, увеличи­
вается уровень внутриклеточного цАМФ. цАМФ стимулирует
об разован ие высокоактивного соединения — олигоаденилата,
внутриклеточного антагониста С а2+, ингибитора клеточного рос­
та. Одновременно олигоадеиилат ингибирует метилирование
клеточной Р Н К и активирует нуклеазы. Происходит удлинение
клеточного цикла за счет стадии дифференцировки. В то же
время ол иго адеии л ат о б л а д а ет антивирусным и антипролифера-
тивным эффектом . П о этом причине сердечные средства типа
трен тал а и теофиллина, увеличиваю щ ие в клетках уровень
цАМФ. индуцируют образование олигоаденилата и усиливают
иммунный статус организма. Аналогичного эф ф екта можно д о­
стичь с помощью акупунктуры (Р. А. Д уринян, 1985).
Уровень олигоаденилата в озрастает в клетках т а к ж е в р е­
зультате голодания. Одновременно с этим пад аю т активность
87
фосфодиэстеразы 2/ ,5'-олигонуклеотидов и уровень ингибитор­
ного белка, «выключающего» деятельность А-киназ. В н о р м ал ь ­
ных условиях этого не происходит, и в результате действия это­
го белка стади я 5 сменяется стадией С%.
Н а этой стадии наступает активации киназ другого типа, в
том числе О-киназы. Р астет уровень цГМФ, увеличивается к а л ь ­
циевый градиент, на м ем б р а­
12: не возникаю т признаки п роли­
ферации и подготовки к по­
следующему делению. З а т ем
наступает стади я М — митоз.
Активность цАМФ- и
цГ М Ф -зависимы х протеинки-
наз, как и уровень соответст­
вующих циклических нуклео­
тидов, колеблется на п р о т я ж е­
нии стадий клеточного цикла,
регулируя длительность от­
дельных стадий и самого цик­
ла. Э та регуляция сопровож ­
д ается влиянием киназ на
энергетический обмен, а т а к ­
ж е на мембранные системы,
Рис. 26. Изменение активности обеспечивающие транспорт ио­
Иа, К-АТФазы, плазматической нов.
мембраны клетки на разных ста­ Н асколько важ н о это в л и я­
диях (С и 8 , Сц, М ) клеточного
цикла (активность фермента со­
ние, видно н а примере п атоло­
ответствует высоте столбиков, над гических отклонений, при кото­
которыми указаны значения рых оно нарушено. Так, по­
удельной активности; по С. П а­ скольку С а 2+ и олигоаденилат
стернаку, 1978) конкурируют друг с другом, яс­
но, что д л я смены соответству­
ющих стадий цикла необходима своевременная аккум уляц и я
С а 2+ во внутриклеточные депо (эндоплазматический ретикулум)
или вы брос его из клетки; д л я ускорения этих процессов надо
активи ровать Са-насосы клетки, что обеспечивает цГМФ.
Д л я перехода клетки от стадии роста к делению следует з а ­
тормозить процессы белкового синтеза, что происходит при по­
нижении концентрации Ыа+ и увеличении концентрации К + в
клетке, когда созд аю тся неблагоприятны е условия д ля функцио­
нирования рибосом. Это за д а ч а № -насоса клетки. Напротив, а к ­
ти вация Ыа, К-АТФ азы, н аб л ю д аю щ аяс я после окончания кл е­
точного деления, нап равлен а на восстановление низкого уровня
внутриклеточных ионов Иа и тем самы м н а зам ед лени е роста
клетки. К моменту, когда масса клетки достигает «заданного
уровня», определяемого соотношением массы цитоплазмы и м а с­
сы ядра, активность Ыа-насоса достигает такого уровня, который
характери зуется нормальной величиной Ыа-градиента, соответст­
вующей стационарном у уровню белкового синтеза. Рост клетки
88
п рекращ ается, и она готовится вступать в следующий клеточный1
цикл (рис. 26). В связи с этим фактом предлож ено использовать
величину активности фермента д л я определения стадии клёточ-1
ного цикла синхронно дел ящ ей ся культуры клеток. .
Д ействительно, Ыа, К -А Т Ф аза мож ет служ ить не только мар-1
кером плазматической мембраны , но и показател ем стадии кл е­
точного цикла при росте клеток в культуре. Существует п р я м а я ’
связь меж ду активностью Ыа, К-АТФ азы, темпами выброса Ыа+-
из клетки и зам едлением в ней процессов белкового синтеза.
В основе влияния Ыа, К -АТФазы на рост клетки леж и т в л и я­
ние ионов N8 на транскрипцию генетической информации. Ыа+ —
в аж н ы й ф актор дестаби ли зац ии структуры Д Н К (Л. Ып&, 1984).
Он н аруш ает водородные связи между нуклеотидами (а д е н и н —1
тимин, гуанин — ц и то зи н ), способствуя разверты ванию двойной
спирали и увеличению доступности генетической информации в
клетке (Р. НоЬга, С. 5апс1ог1у, 1984). Таким образом, высокий
уровень Ыа+ в клетке является непременным условием про тека­
ния процессов белкового синтеза.
О днако взаимоотношения меж ду ионным гомеостазом и со­
стоянием генетического а п п ар ат а клетки очень сложны. П р е д ­
ставление о том, что изменение соотношения Ыа/К непосредствен­
но уп р ав л яет считыванием информации с генетического м а тер и а­
л а, в л и я я на стабильность Д Н К , было бы слишком упрощенным,
а системы, ж ивущ ие по такому принципу, были бы недостаточно
устойчивы.
Если Ыа+ действительно дестабилизирует структуру двойной
спирали, то как ж е обеспечивается ее структура в покоящ ейся
клетке, где его содерж ание постоянно п оддерж ивается на д оволь­
но высоком уровне (около 30 ммоль/л в нейронах и 35—
40 ммоль/л в мышечных к л етк ах )?
С табили затором двойной спирали Д Н К в клеточном ядре яв ­
л яю тся молекулы воды. Н а к а ж д ы й ш аг спирали Д Н К приходит­
ся 240— 400 молекул воды. Ионы Ыа в клетке т а к ж е ги дратир ов а­
ны в соответствии с величиной гидратационного числа д ля них.
Э та с в я за н н а я вода предохраняет двойную спираль от д естаби ­
лизирую щ его действия Ыа+. В период деления, когда ионный со­
став клетки уравн ивается с таковы м во внеклеточной среде, про­
исходит повышение содер ж ан ия Ыа+ сверх «нормального» уровня
(с одновременным понижением уровня К +). Этот процесс стиму­
лирует белковый синтез и рост клетки, одновременно активируя
синтез новых молекул Ыа, К-АТФазы. В результате пропорцио­
нально активации ф ерм ен та уровень Ыа+ в клетке снижается,
структура Д Н К стаби ли зируется и рост к летки тормозится до но­
вого деления.
Следовательно, в нормальной клетке этот фермент принимает
участие в регуляции длительности клеточного цикла, что недавно
было продемонстрировано на синхронизированной культуре фиб-
робластов с помощью специфического ингибитора Ыа, К -А Т Ф а­
зы — уабаина. Н а стадии интенсивного роста культуры клетки
89
ока зал и сь весьма чувствительны к присутствию уабаина: инги­
бированием им активного транспорта Ыа+ и К+ в несколько р аз
уд л и н ял о эту стади ю ц икла (К. Ь е 1$1ег е! а1., 1985).
И н а я картина наблю дается, когда в клетку попадаю т гидро­
ф обны е индукторы трансляции, вы зы ваю щ ие злокачественное
п ерерож дение тканей (например, форболовые эф ир ы ). Они вы ­
сту п аю т к а к дополнительный ф актор дестаби ли зац ии нуклеино­
вых кислот, з а с т а в л я я клетку бороться против этой д ест а б и л и за ­
ции повышением активности Ыа, К -АТФазы и понижением уров­
ня Ыа+. Если мощности Ыа, К -АТФ азы о к а зы в ае тся недостаточ­
но, гидроф обная м одификация хромосомного м а тери ал а будет
или способствовать р азв ерты в ан и ю двойной спирали и экспре-
сии собственных онкогенов клетки, или облегчать встраивание
вирусных онкогенов в состав клеточной Д Н К . По этой ж е при­
чине н аб л ю д ае м ая в злокачественны х ткан я х активация тирози-
новых киназ, одной из мишеней действия которых яв л яе т ся
Ыа, К -А ТФ аза, а результатом ее ф о сф о р и л и р о в а н и я— р азо б щ е­
ние гидролитической и транспортной реакции (Е. Каскег, 1983),
тормозит переход клетки к делению, стимулируя бесконтроль­
ный рост.
Среди многих особенностей, отличаю щ их злокачественны е
клетки от нормальны х, — перераспределение функций отдель­
ных белков, н ар у ш а ю щ е е синхронизацию отдельных стади й ме­
таболи зм а. Видимо, это происходит вследствие нарушения в а к ­
тивности различны х протеинкиназ. Р аспространенны м су б стра­
том цАМ Ф-зависимой протеинкиназы являю тся гистоны, а
цАМ Ф -независимой протеинкиназы — казеин. Сравнение актив­
ности киназ любого из этих типов в злокачественных и н о р м а л ь ­
ных клетках яв л яется непоказательны м или мало демонстратив­
ным. Однако их соотношение, оп ределяем ое как отношение уров­
ня фосф орилирования гистонов к уровню фосф орилирования
казеина, характер и зу ет «сбалансированность» метаболизм а
клетки с высокой степенью достоверности: д л я нормальной клет­
ки это соотношение больше единицы, для злокачественной кл ет­
ки — меньше. С табильное понижение активности гистонкиназ по
отношению к активности казеи нкин аз является признаком нару­
шения «обратных связей», п оддерж иваю щ их нормальное течение
м етаб о ли зм а (Е. С. Северин, М. Н. Кочеткова, 1985).
Описанная картина, по-видимому, действительно верна. К ак
п оказали систематические исследования специалистов в о б л а ­
сти экспериментальной онкологии, сод ерж ан ие Ыа+ в злокачест­
венных клетках существенно возрастает, а активности Ыа,
К -АТФазы недостаточно для устранения этого натрия из клетки,
т ак ка к клеточные мембраны становятся высоко проницаемы для
него (С. Д . Кузьмин, И. М. Д ан ьк о , 1984). Э. Рэкером (1983)
показано, что активность Ыа, К -АТФ азы в злокачественны х к л ет­
ках фактически д а ж е выше, чем в нормальны х ткан я х или в
клетках доброкачественной опухоли. О днако Ыа-насос работает
в «разобщенном» режиме, гидролизуя АТФ без активного пере­
90
носа ионов через мембрану. С. Д . Кузьмин считает, что в зл о к а ­
чественных клетках Ыа, К -А ТФ аза не в состоянии справиться со
своей ролью, потому что ее работа протекает на фоне активиро­
ванного гликолиза (что типично д л я злокачественной ткани).
Избыточное количество м олочной кислоты — основного продук­
та гликолиза — закисляет внутриклеточную среду и застав л яет
клетку обменивать Н+ на внеклеточный Ыа+. Вследствие работы
Ы а/Н-антипортера кл етка постоянно обогащ ается натрием.
Интересным является тот факт, что многие цитостатики, при­
меняемы е для тормож ения роста опухолевых клеток, обладаю т
способностью активировать Ыа, К-насос. Таков, например, новый
перспективный антибиотик б лео м и ц и н (Р. УузкосП е! а1., 1983).
Д ру гим возможным объяснением того, что активация Ыа,
К -АТФазы тормозит белковый синтез, является признание кон­
куренции за клеточный фонд АТФ со стороны этих двух, весьма
энергоемких процессов. Это представление было подтверж дено
при содерж ании животных в условиях белковой недостаточности
(5. Кар1ау, 1984). П о к а за н а п р ям а я корреляция меж ду реакци­
ями синтеза белка и внутриклеточным содерж анием Ыа+.
С тим уляция общего роста организма, осущ ествляем ая при
действии гормональных факторов, например, тиреоидных гормо­
нов, в нормальных условиях всегда сопровождается активацией
Ыа, К-АТФазы. М еж ду этими процессами наблю дается своего
рода динамическое равновесие. Если по каким-либо причинам
это равновесие оказы вается нарушенным, наблю дается чрезм ер­
ная тучность, которая сопровож дается понижением активности
рассматриваемого фермента. П ри этом об наруж и вается отчетли­
вая отрицательная корреляция м еж д у массой тела человека и
активностью Ыа, К -АТФазы его эритроцитов.
В нормальной ткани предусмотрены механизмы обратной
связи, способствующие тушению возникаю щ их «неблагоприят­
ных» сигналов. Так, фосфорилирование белков киназам и иници­
ирует глубокие изменения, которые, однако, могут быть устране­
ны много раньше, чем модифицированные белки будут инакти­
вированы (разруш ены ) протеолизом: существуют специфические
протеинфосфатазы, сб расы ваю щ ие фосфатную группу и восста­
навливаю щ ие первоначальную конформацию и активность бел­
ка. В ряд е случев активирую щий стимул одновременно «запу­
скает» и активацию этих ф осф атаз, чтобы в недалеком будущем
приостановить произош едшие изменения и вернуть систему в
исходное состояние. Так, известны протеинфосфатазы, активиру­
емые циклическими нуклеотидами или кальмодулином.
Учитывая, что все регуляторны е процессы способны перекре­
щ и ваться и сущ ествовать в одной и той ж е клетке, следует при­
знать, что деление регуляторов на д ва типа является условным.
Так, кальмодулин представляет собой регулятор 1-го типа, ког­
да активирует Са-насос сокращ аю щ егося миоцита, и 2-го — ког­
д а активирует систему удаления С а2+ из клетки и способствует
ее переходу от роста к дифференцировке.
91
Мембранный
транспорт
и поддержание
ионного
гомеостаза

Характеристика различных транспортных


процессов
О дна из существенных функций биологических м ем бран —
обеспечение избират ельной проницаемости д л я веществ, т р ан с­
портируемых в процессе ж изнедеятельности из клетки в среду и
из среды в клетку. Отдельные части живой системы, р азд ел ен ­
ные мембраной, функционируют ка к открытые системы. Р оль

•Д О »
•Д о р

Бислой

<7
• •

Рис. 27. Виды активного и пассивного транспорта ве­


ществ через мембрану:
1 , 2 — п р ост ая д и ф ф у зи я ч е р е з би сл ой и к а и а л со о т в ет ст в ен ­
н о. 3 — о б л е гч ен н а я д и ф ф у з и я , 4 — активны й тр ан сп о р т ; 1, 2.
3 в сов ок уп н ост и о т р а ж а ю т п ассивны й т р ан сп ор т

м ембран в транспортной функции зак л ю ч ается в сопряж ении и


регуляции потоков энергии, вы зы ваю щ их и сопровождаю щ их
процессы транспорта. Если транспорт сопровож дается уменьш е­
нием свободной энергии, он протекает самопроизвольно и н азы ­
вается пассивны м . Перенос веществ через мембрану, связанны й
с увеличением парциальной свободной энергии, является актив­
ным. Р азли чи е видов переноса иллюстрирует рис. 27.
92
М олекулы транспортируемы х веществ или ионы металлов
могут переноситься через м ем брану независимо от наличия и
переноса других соединений — юнипорт, их перенос мож ет осу­
щ ествляться одновременно и однонаправленно с другими соеди­
нениями — симпорт, и, наконец, транспорт соединений мож ет
быть обусловлен одновременным и противоположно н ап рав л ен ­
ным транспортом другого соединения — антипорт. Симпорт и ан ­
типорт представляю т собой ви­
ды котранспорта, при котором
скорость сум марного процесса
контролируется наличием и д о ­
ступностью для систем перено­
са обоих партнеров тран сп орт­
ного процесса (рис. 28).
Кроме этих основных видов
переноса сущ ествую т сп ец и аль­ Юнипоргп Симпорт Антипорт
'---------------- I
ные механизмы перем ещ ения Котранспорт
веществ, вы деляемы е в особую
группу. Их осуществление с в я ­ Рис. 28. К лассификация способов пе­
зан о с нарушением структур­ реноса через мембрану
ной целостности мембраны.
К ним относится высвобождение медиаторов в синапсах при воз­
буждении, перенос генетического м а тер и ал а через ядерную мем­
брану, пиноцитоз и экзоцитоз, деятельность б актериальны х пер-
меаз, обеспечивающих перемещение олигопептидов через клеточ­
ную стенку.
Л и ш ь неспецифическая д иф ф узия не использует специаль­
ных механизмов д ля своего осуществления: вещества проникают
через м ембрану б ла го д а р я наличию кинков или в области мем­
бран ны х дефектов. К ак пассивный, т а к и активный транспорт
обеспечиваются специальными структурами. В их числе каналы ,
переносчики, ферменты, обеспечивающие перемещение специфи­
ческих ионов против их концентрационного градиента за счет
энергии АТФ.
К ак пассивный, так и активный транспорт подчиняются в
общ ем виде кинетике насыщения. Р азн и ц а зак л ю ч ается лишь в
том, что в случае активного транспорта существует дополнитель­
н ая стадия, соп ряж ен ная с за тр а та м и энергии. В случае ионного
транспорта, осуществляемого транспортными А Т Ф азам и (их н а­
зы ва ю т т а к ж е ионными насосами), энергодающ ей стадией я в л я ­
ется гидролиз АТФ. Такой процесс н азы вается первично-акт ив­
ны м транспортом. В случае, если энергия обусловлена гради ен ­
том ионов, созданным независимо, например в процессе первич­
но-активного транспорта, этот процесс н азы вается вт орично-ак­
тивным транспортом.
Вторично-активный транспорт обеспечивает перенос в клетку
аминокислот и моносахаридов, поступающих за счет энергии,
обусловленной градиентом ионов, чащ е всего Ыа+. В клетках
низш их эукариот кроме градиента Ыа+ д л я этой цели мож ет ис­
93
пользоваться градиент протонов, у некоторых грибов его с о зд а­
ют высокомолекулярные полифосфаты. Перенос осущ ествляется
с помощью белков-переносчиков, имеющих молекулярную массу
25— 40 кД . Некоторы е переносчики сахаров выделены из п л а з м а ­
тических мембран слизистой кишечника, эритроцитов, бактерий.
Они имеют самое разное сродство (Ка д л я переносимых ве­
ществ варьирует от 10~7 д о 10-4 моль/л) и специфичность. О б н а ­
руж и в аю тся случаи переноса одной и той ж е аминокислоты тре-
мя-четырьмя разны ми переносчиками или, наоборот, специфич­
ность одного переносчика к двум-трем разны м соединениям.
Удобным объектом д л я изучения транспорта метаболитов я в л я ­
ются микроорганизмы, дефицитные по конкретным переносчи­
кам. Соответствующие субстраты не попадают внутрь клетки и
поэтому не могут утилизироваться.
Ко вторично-активному транспорту относятся и процессы пе­
реноса, связанны е с деятельностью ферментов. Например, фос-
ф отран сф еразн ая система бактерий, отсутствующ ая у эукариот,
фосфорилирует са х ар а в процессе их проникновения через мем­
брану, тем самы м у ж е вовлекая их в метаболизм углеводов.
У грам отрицательны х бактерий т а к переносятся Б -гл ю коза, Б -
ф руктоза и Б -глю козам ин. У грам полож ительны х бактерий на­
бор переносимых веществ шире; сюда относятся так ж е пентозы,
сахароза, трегалоза, лактоза, глицерин. П ри этом лактоза и
ф руктоза фосфорилируются по С ь остальные вещества — по
концевому углероду.
И з краткой характеристики видно, что процессы первично­
активного транспорта в регуляции клеточных функций з а н и м а ­
ют ведущее место. В результате работы систем первично-актив­
ного транспорта в клетке создается ионный состав, резко отли­
чающий ее от окру ж аю щ ей среды. Основные проявления ж и зн е ­
деятельности клетки оказы ваю тся возможными до тех пор, пока
эти различия в распределении ионов по обе стороны мембраны
сохраняются. Отсюда видна в а ж н а я роль ионов м еталлов в-
п роявлениях жизнедеятельности клетки.

Ионы металлов в биологических системах


Среди неорганических компонентов, в той или иной степени
участвующих в метаболизме клеток и тканей, первое по в а ж н о ­
сти место принадлеж ит ионам металлов. Н акап л и в аем ы е к л е т к а ­
ми в определенных соотношениях или выбрасы ваемы е из клеток
в о кр уж аю щ ую среду, ионы м еталлов играют роль необходимых
компонентов ферментных систем, будучи участниками электро­
химических явлений, протекаю щих на клеточных мембранах,
регуляторам и водного обмена и т. д. В табл. 14 д ан а к р а т к а я
характери сти ка основных жизненно важ н ы х металлов, участву­
ющих в обмене веществ.
Д л я всех перечисленных элементов, по-видимому, сущ еству­
ют способы, б ла го д а р я которым клетки регулируют их с о д ер ж а-
94
Т абли ца 14. Основные свойства жизненно важ ны х элементов
Н аи м ен ова­
н и е эл ем ен т а Х и м и ч еск ая ха р а к т ер и ст и к а Б и о х и м и ч ес к а я р оль

Высокоподвижные однова­ Концентрационные градиен­


лентные катионы, образующие ты Н а+ и К +, создаваемы е за
различные растворимые соли, счет активного транспорта,
а так ж е слабы е комплексы с обеспечивают клетке осмотиче­
лигандами (за исключением ский н электрохимический по­
циклических полидентатов ти­ тенциалы; оба иона являю тся
па валиномицина «ли монен- так ж е промоторами структуры
сина) нуклеиновых кислот и белков;
этим ж е путем К + специфиче­
ски активирует ряд ферментов

М е , Са, 2п М д 2+ и С а2+ легко связы ва­ Я вляю тся активаторами р аз­


ются с анионными лигандами личных ферментов, а такж е
типа ф осфата; 2 п2+ охотнее промоторами структуры бел­
взаимодействует с донорами ков, но не участвую т в окисли­
азота и серы, особенно гисти­ тельно-восстановительных про­
дином и цистеином цессах.
М й2+ представляет собой ин­
тегральную часть молекулы
хлорофилла, фотосинтетиче-
ского пигмента растений и фо­
тосинтезирующих бактерий.
Нерастворимые соли и комп­
лексы С а2+ — основа формооб­
разую щ его скелета растений и
животных; С а2+ — агент, зап у­
скающий сокращ ение мышеч­
ных клеток и участник про­
цессов возбуж дения; д л я це­
лого р яд а белков, имеющих
специфические центры связы ­
вания, С а2+ — индуктор кон-
формационного сигнала

Н аиболее важны поливана- А ккумулируется специальны­


даты (аналогичные полифосфа- ми клетками асцидий н неко­
там ), а так ж е система: вана- торых червей (ванадоцитам и);
дат (V 42 ) — ванадил (УОг+) функция ванадоцитов неизвест­
на. У животных ванадий уча­
ствует в биосинтезе холестери­
на, п ара ванадат — ванадил ре­
гулирует активность ряда фер­
ментов, в том числе адено-
зннтриф осфатаз (см. ниже)
Сг3+ является сильным окис­ Участвует в метаболизме
Сг
лителем глюкозы у млекопитающих

Мо Конгенер хрома, но с опреде­ Точная функция М о еще ие


ленными отличиями; имеет вы­ ясна, но известно, что он ва­
сокое сродство к лигандам, жен д л я жизнедеятельности
связываю щ им я-электроны азотфиксирующ их организмов,
является кофактором нитроге-
назы

95
П р о д о л ж е н и е табл. 14

Н аим ен ова­ /
ние э л е м е н т а Х и м и ч еск ая х а р а к т ер и ст и к а Б и охи м и ч еск а я роль

Ре О бразует два иоиа: Р е2+ и Соединения ж елеза обоих


Ре3+; первый связы вается пре­ типов, же^езосульфид и желе-
имущественно с азотсодерж а­ зопорфирйны — важные пере­
щими группами лигаидов, вто­ носчики электронов в биоло­
рой — с кислородом. П ереход гических реакциях; железопор-
между двумя состояниями до-, фириновый белок гемогло­
статочно легок и играет в а ж ­ бин — переносчик кислорода в
ную роль в процессах биоло­ крови млекопитающих
гического окисления

Со Существует два основных Со+ входит в состав вита­


состояния кобальта — С о2+ и мина В 12; Со2+ играет роль
Со3+. Первый кинетически л а ­ кофактора в некоторых гидро­
билен, второй — инертен. Со+ литических ферментах
такж е мож ет быть важен для
метаболизма

Си Н аиболее существенные со­ Участник многих оксидаз.


стояния Си+ и Си2+; переход В процессе функциоиироваиия,
меж ду ними достаточно легок. вероятно, меняет свою валент­
Си2+ играет важ ную роль в ность; входит в состав бел­
метаболизме ков — переносчиков кислорода
у низших животных; широко
комплсксирустся с белками

ние. Д л я некоторых элементов системы аккумуляции или вы бро­


са из клетки так мощны, что об наруж и вается я р к а я н еравномер­
ность в распределении ионов по обе стороны клеточной м е м б р а ­
ны (табл. 15). Так, клетки всех тканей животных х ар а к тер и зу ­
ются электрохимическим градиентом ионов Ыа, К и Са — ионы
Ыа в ы брасы ваю тся из клетки, а ионы К н акапл и ваю тся там.
Ионы Са способны к а к вы б расы ваться из клеток, так и ак ку м у ­
лироваться во внутриклеточных депо, б л а го д а р я чему концент­
рац и я ионизированного С а2+ в «покоящейся» клетке составляет
~ 10-7 моль/л.
Натрий и калий. Причина, по которой ж и в ы е системы «вы­
брали» одновалентны е ионы д л я создания ионной асимметрии,
проста: это наиболее распространенны е ионы в неживой приро­
де. К роме того, эти ионы отличаются особенностями, использо­
вание которых в регуляции метаболизм а оказал о сь столь у д ач ­
ным. О б а указан ны х элем ента имеют низкий потенциал и они за­
ции внешнего электрона (так назы ваемы й первы й потенциал
и о н и за ц и и ), а образую щ ийся ион о б ладает конфигурацией ато­
ма инертного газа, т. е. яв л яется сферическим и слабо поляр и зу ­
емым.
Второй потенциал ионизации д л я этих элементов достаточно
высок. По этой причине трудно предположить сущ ествование
других окисленных форм этих металлов; в действительности они
неизвестны.
96
Таблица 15. С одерж ание ионов в тканях и ж идкостях тела животных
и в морской воде, ммоль/л

Объект ч И а+ К+ С а2+ М ^+ С 1-

Крыса
плазм а крови 143 6,2 3,1 1,6 116
мышца 27 101 1,5 11 16
Л ягуш ка
плазм а крови 104 2,5 2,0 1,2 74
мышца 24 85 2,5 11,3 10
Б еззубка
плазма крови 15 0,4 5,3 0,4 10
мышца 5 10,5 5,4 2,5 10
Осьминог
плазма крови 525 12,2 11,6 57,2 480
мышца 81 101 3,7 12,7 93
Голотурия
ж идкость тела 460 11,8 10,7 50 523
мышца 191 139 89 39 277
М орская вода 440 9,5 0,4 1,3 535

В биологических ж и дкостях натрий и калий представлены


преимущественно в ионной форме. В водной ф азе р ас см а тр и в а­
емые вещ ества бурно ионизируются с восстановлением водоро­
да воды, а образую щ иеся ионы легко гидратируются.
Н атрий и калий входят в состав I группы элементов таблицы
М енделеева вместе с Н, Ы, Кб, Сз и Рг. Все они, кроме газооб­
разного водорода, являю тся м еталлам и и относятся к группе
щелочных металлов. Общим д л я них является наличие избыточ­
ного (сверх конфигурации инертных газов) з-электрона.
Н есмотря на высокую подвижность Иа+ и К+ они не распре­
делены в ж и вы х системах равномерно. Напротив, к а к уж е отме­
чалось, существует определенная избирательность в распределе­
нии этих ионов м е ж д у клетками и внеклеточной средой (см.
табл. 15).
Н атрий в интерстициальной жидкости регулирует осмотиче­
ский баланс организма и содерж ание воды в тканях. Ионы N3
участвуют так ж е в поддерж ании кислотно-щелочного равновесия
в организме, а в возбудимых т кан я х (нервная и мышечная) —
участвуют в формировании электрического потенциала.
В последнее врем я установлено, что существуют и другие
в аж н ы е д л я организм а функции Ыа+, связанны е с состоянием и
свойствами нуклеиновых кислот и белков, поскольку связы вание
анионных центров макромолекул мож ет стабилизировать их в оп­
ределенных конформациях. О казалось, что способность К + ста­
билизировать структуру м акромолекул резко отличается от по­
добной способности Йа+.
Калий так ж е яв л яется существенным ионом д л я растений и
животных. Р я д его функций аналогичен таковы м у Ыа+; до неко­
торой степени эти ионы взаимозаменяемы. О днако в болыпин-
97
стве случаев действие К+ оказы вается противоположным дейст­
вию Ыа+. Так, при возбуж дении Ыа+ обеспечивает ф азу д еп оля­
ризации клетки, а К+ восстанавливает исходный /Потенциал на
мембране. Д л я ряд а ферментов гликолиза К+ является ак ти в а­
тором, в то врем я как Йа+ ингибирует их. По-р&зному влияю т
э ти ионы и на конформационное состояние м акромолекул. В ос­
нове их действия, видимо, л еж и т множественное связы вание с
анионными центрами крупных молекул, т а к к а к оптимальные а к ­
тивирую щ ие концентрации одновалентных катионов очень высо­
ки, они составляю т 50— 100 ммоль/л.
Р езул ьтаты многих экспериментов показывают, что молекулы
бел ков или нуклеиновых кислот могут «различать» Иа+ и К+,
несм отря на большое сходство м е ж д у ними. М еханизм разл и че­
ния остается неясным. П редполагаю т, что оно основано на оцен­
ке величины з а р я д а и энергии гидратации ионов. Везикулы, при­
готовленные из природных фосфолипидов (например, фосфати-
д и л се р и н а ), способны со зд ав ать на своей м ем бране пяти, семи­
кратны й градиент К+ и Ыа+ за счет своей различной проница­
емости д л я этих ионов. Чем объяснить эти различия в проница­
емости? Вероятно, различиями в связы вании с переносящими
ионы группами.
В общем случае катион I будет лучше связы ваться с р ас­
см атри ваем ы м центром связы вания, чем катион II, если свобод­
ная энергия перехода его из водной фазы к центру будет более
отрицательной, чем д л я его конкурента. Тогда селективность мо­
ж е т быть описана соотношением

^ ^ц еитр а / Д еги др атац и и / ^ Л ген тр а ц — Д еги дратац и и ц ИЛИ Дб?цеиТра ^ —

Д 0 центра„ “'С д е гилратации/ д< згидратации/ / .

Главны м фактором, контролирующим специфичность, будет


поле за р я д а анионного центра связы вания. Если оно велико
(т. е. центр м а л по р а з м е р а м ), то не только сила связы вания к а ­
ти о н а будет велика, но и селективность в выборе катиона д ля
св я зы в а н и я будет существенна. Тогда энергией гидратации
м о ж н о пренебречь и написать условие селективности следующим
об разо м :
^ ц ен т р а / д е центра I I <С О’
Следовательно, наименьший катион — 1л+ будет связы ваться
наиболее сильно. С вязы вание других ионов будет затруднено не­
обходимостью дегидратации. Наоборот, в случае больших р а з ­
меров связы ваю щ его центра, когда существует возможность
св язы в ан и я ионов в гидратируемой форме, наилучшим д ля св я­
зы в а н и я будет ион Сз+. Следовательно, в большом по разм ер ам
центре поле з а р я д а мало н силами взаимодействий м еж д у з а р я ­
женны ми частицами можно пренебречь. Поэтому

^^гидратации/ ^^гидратации// 0*
98
Используя табличные данные д ля разм еров и свойств одно­
валентных катионов, мож но определить порядок сродства ги д р а­
тированны х ионов, т а к назы ваем ую лиотропную с е р и ю • С з + >
> К Ъ + > К +> № *+ > У + . * н
Х арактер селективности любого связы ваю щ его центра м о ж ­
но предсказать зн ая рКа групп, входящ их в его состав. Если
значения р К а высоки, участок будет удерж и вать протоны при
физиологических рН.
М агний и кальций. Ионы М д и Са входят в состав II группы
элементов таблицы М енделеева; эта группа откры вается берил­
лием Ве. Бериллий обладает совершенно особыми свойствами,
обусловленными малы м металлическим радиусом (0,089 нм) и
потенциалами ионизации (9,32 и 18,21 э В ), т. е. Ве значительно
менее электроположителен, чем 1л+. П о этим причинам ионных
форм Ве в р аствор ах не существует.
Хотя электронное строение элементов группы щелочно-зе­
мельных м еталлов подобно электронному строению Ве, больший
разм ер их атомов уменьш ает влияние за р я д а яд р а на вал ен т­
ные электроны. И онная природа их соединений возрастает в р я ­
ду: М д 2+, С а2+, 8 г 2+; и хотя некоторые соединения М д 2+ еще
имеют ковалентный характер, все соединения С а2+ обладаю т, по
существу, ионными свойствами. К ак и в случае элементов I груп­
пы, радиусы гидратированных ионов элементов II группы зн ач и ­
тельно больше их кристаллографических радиусов. М § 2+, С а2+,
8 г 2+ и другие образую т ряд, в котором н аблю дается системати­
ческое изменение свойств в соответствии с изменением ионной и
электроположительной природы элементов. Некоторые прим е­
ры этих систематических изменений таковы: изменение тенден­
ции к гидратации кристаллических солей; уменьшение раствори ­
мости сульфатов, нитратов, хлоридов (но не ф торидов); увели­
чение способности реагировать с водородом; способность стаби ­
лизировать перекисные и надперекисные анионы.
И з всех элементов группы щелочно-земельных металлов лишь
М § 2+ и Са2+ широко используются в ж и в ы х организмах; остал ь­
ные в большей или меньшей степени токсичны. Г л ав н а я причина
токсичности этих элементов заклю чается, видимо, в их высокой
склонности о бразовы вать ковалентные связи, вытеснении ионов
М д и Са из биологических структур и необратимом связы вании
с этими структурами. Именно по этой причине особенно токси­
чен Ве. Стронций мало распространен в биологических систе­
мах. О днако его радиоактивны й изотоп 905 г2+ достаточно опасен:
он н акапливается в костях, в результате чего возможно возник­
новение лейкемии. Б ари й встречается ч ащ е стронция, его дей­
ствие на организм не изучено, известно лишь, что соли Ва в л и я ­
ют на обмен С а 2+ в тканях; эго не относится лишь к В а 8 0 4,
имеющему незначительную растворимость.
П р и обычной диете у людей не бывает дефицита по М д 2+,
за исключением случаев понижения содерж ан ия белка в пище
или хронического алкоголизма. Суточная потребность человека
99
в М ^ + составляет 200— 300 мг, а общее количество М § 2+ в о рга­
низме взрослого человека составляет около 20 г. Более полови­
ны этого количества оседает в костях в виде фосфорных солей.
В некоторых случаях фосфат магния мож ет оседать в мочевы­
водящ их канальц ах. Почти весь остальной №%*+/ является внут­
риклеточным.
С одерж ание С а2+ в организме человека и Животных опреде­
ляется соотношением эффективности систем аккумуляции и вы ­
броса С а2+ из организма. Д еф и ц и т С а 2+ возникает весьма редко
вследствие его широкого распространения. Он чаще всего мож ет
быть вызван дефектом в системе аккумуляции, использующим
склонность С а2+ образовы вать нерастворимые соли с анионами,
широко распространенными в пище, — оксалатом и фосфатом.
Ч а щ е всего встречается гиперкальциемия. Н аруш ения обмена
С а 2+, приводящие к колебаниям его уровня в кровяном русле,
вызы ваю т наруш ения многих процессов жизнедеятельности, в
том числе возбудимости нервной и мышечной тканей.
А ккумуляция М ^ 2+ клетками о т раж ает его важ н ую роль в
метаболизме, которая мож ет проявляться в одном из следующих
направлений: ка к промотор структуры макромолекул, как суб-
страт-связы ваю щ ий ион (кислота Л ью и са) и как переносчик
электронов. Последнее качество д ля М ^ 2+ не существенно, так
ка к он не имеет переменной валентности. Первое свойство т а к ­
ж е не особенно широко распространено, но известен ряд приме­
ров, связанных с контролем за состоянием Д Н К . Н аиболее ши­
роко известна роль М ^ 2+ в комплексировании с субстратом аде-
н озинтрифосфатазных реакций, где он является незаменимым.
П олагаю т, что М § 2+ вступает во взаимодействие с фосфатными
заряж ен н ы м и группами АТФ, поляризуя их и выступая в каче­
стве кислоты Л ью иса, поскольку повышает реакционную способ­
ность системы, облегчая нуклеофильную ата ку на терминальный
ф осф ат АТФ. Наконец, есть длинный список М ^-зависим ы х ф ер ­
ментов, начиная от п ируватдекарбокси лазы и кончая Д Н К а зо й ,
где роль М ^ 2+ не ограничивается «активацией» субстрата, но
с в я за н а с формированием активного (каталитического) центра
фермента.
Клетки преимущественного большинства тканей имеют два
вида Са-насосов, один из которых локали зован в наружной к л е­
точной мембране и выбрасы вает С а2+ из клетки в среду, д ру­
гой — в эндоплазматическом ретикулуме — аккумулирует С а 2+
во внутреннее депо, б лагодар я чему уровень ионизированного
С а 2+ в цитоплазме очень низок в состоянии метаболического по­
коя. Однако этот ф акт не означает, что С а2+ ингибирует м етаб о ­
лические процессы. Наоборот, это объясняется наличием в кл ет­
ке высокочувствительных к С а2+ белковых систем, способных
реагировать на «следовые», микромолярные, концентрации это­
го иона.
Д л я регуляции этих систем, в числе которых находятся Са-
чувствительные протеинкиназы, белки-регуляторы сокращ ения,
100
Таблица 16. Ионный антагонизм в действии на некоторые
ферменты

Ф ер м ен т И он ы -ак ти в атор ы И он ы -и и ги бн тор ы

М етионнн-аденозилтрансфе- М в или Мп + Са или 2п


раза + К, И Н 4 , РЪ
5'-Н уклеотидаза м§ Са
Аргининосукцинат-синтаза Мв Са или М в
Глутаминсннтаза М § или Мп Са
Рибофлавинкиназа М в, 2 п, Со Са
или Мп
Н еорганическая пирофосфа- М § Са или 2п
таза
Фосфофруктокиназа N3
Ф осфопируват-гидратаза М в, 2п, Мп Са или 2п
или Сй
Глициллейцин-пептидаза 2п или Мп Са
П ируваткиназа М в+К , ЫН4) С а + П N3
РЪ
Тирозил-тРН К -сиитаза Мв + К N3
Ацетил-КоАсинтаза М § или М п + N3
+ К, РЬ, ЪШ4 Са или 2п +
П антотенатсиитаза М § или Мп + + N3
+ К, и н 4
у-Глутамилцистеинсинтаза м в+к N3
Ф ормилтетрагидрофолят- Мв + К N3
синтаза
А льдегнд-дсгидрогеназа К, 1Ш4, РЬ 1 л, N3
А цилтрансфераза К, NН4 1л, N8
Ф осфодиэстераза Мв + К N3
К арбамоилфосфатсинтаза к N3

м одуляторы типа кальм од ули на и т. п., к л етк а контролирует ко­


личество ионов С а2+ в своем цитоплазматическом содержимом.
В действии на метаболизм С а2+ и М ^ 2+ вы является определен­
ный антагонизм. Ион Са крупнее и менее поляризован, чем
М § 2+. Более того, скорость обмена С а2+ м е ж д у его ионизирован­
ным фондом и ионами, связанны ми с лигандами, более чем в
100 р аз выше, чем д л я М ^ 2+. Это существенно укорачивает вре­
мя, в течение которого субстрат (например, комплекс АТФ и
двухвалентного иона) будет доступен д ля ка та л и з а т о р а в случае
С а2+ по сравнению с М ^ 2+. Наконец, стереоспецифичность Са- и
М § -связы ваю щ их центров белков т а к ж е м ож ет существенно р а з ­
личаться.
В ряде случаев антагонизм м е ж д у С а 2+ и М ^ 2+ не имеет из­
вестного физиологического объяснения. Так, д л я гладки х мышц,
активатором сократительного ответа которых является внекле­
точный С а2+, повышение уровня во внешней среде немед­
ленно индуцирует расслабление, препятствуя действию С а 2+.
Кроме регуляции мышечного сокращ ения С а 2+ индуцирует
секрецию гистамина из хромафинных гранул, а в качестве триг­
гера служ ит сигналом д л я выброса массированны х количеств
101
С а2+ из саркоплазматического ретикулума, инициирующего со­
кращ ение мышечных волокон.
М агний как наиболее широко распространенный катион во1
внутриклеточном пространстве — природный активатор боль­
шинства ферментов, которые действуют на ф осф орилированны е
субстраты, гидролизуя ангидриды фосфорной кислоты. С ущ ест­
вует более 100 ферментов, д л я которых необходимы ионы М§:
как кофактор катализируем ы х ими реакций. В большинстве слу­
чаев С а 2+ является антагонистом М.§2+. М ож но видеть на р я д е
примеров, что соотношение М § 2+/Са2+ в клетке управляет к л е­
точным метаболизмом. Влияние ионов М §, Са, Йа и К на неко­
торые ферментативные реакции иллюстрирует табл. 16.

Биологическая роль первично-активного


транспорта

К первично-активному транспорту относят систему активн о­


го переноса одновалентных и двухвалентных ионов, обеспечива­
ющую специфику ионного состава внутриклеточного со д ерж и ­
мого.
К ак видно из табл. 15, по содерж анию ионов Ыа, К, Са и М§;
цитоплазм а клеток отличается от интерстициальной жидкости,,
которая, особенно в случае морских животных, п рибли ж ается к
составу морской воды. Чему служ и т такое селективное р ас п р е­
деление ионов? Перечисленные здесь ионы в большинстве своем
участвуют в осуществлении в аж н ы х пусковых или контрольных
механизмов клетки. Так, С а2+ зап ускает работу кальмодулин-
зависимы х систем, а так ж е сократительный ап п арат; Ыа+ м о ж ет
регулировать интенсивность белкового синтеза; градиент одно­
валентных ионов яв л яется источником энергии д л я процессов
возбуж дения, а т а к ж е вторично-активного транспорта суб стр а­
тов в клетку; вход М.§2+ в яд р о нейтрализует за р я д ф о сф ат а
Д Н К и стабилизирует двойную спираль. Эти данные означаю т,
что изменение ионного гомеостаза может вызы вать определен­
ные биохимические последствия.
Ч асто в эксперименте, изучая роль ионов в той или иной ф ер ­
ментативной реакции, исследователи пытаю тся подменить одни
ионы другими. Ферменты «замечают» подмену, но характер и з­
менения их свойств, которые регистрируются экспериментато­
ром, мож ет дать важ н у ю информацию. Так, ионы М §, которы е
необходимы д ля всех ферментативных реакций, вклю чаю щ их
перенос фосфатной группы (фосфатазы, киназы, п о л и м е р азы ),
можно заменить ионами М п2+ более эффективно, чем ионами
№ 2+, хотя у последнего ионный радиус ближ е к радиусу М § 2+.
В ряде случаев л ан тан может зам ен ять кальций, несмотря на
разницу в их зар я д а х . Таллий обладает д а ж е большим срод­
ством к Ка, К-АТФазе, чем калий. Ж е л е з о в дыхательной цепи
частично можно зам енить на гадолиний. Такой подход перспек-
102
ти ве н д л я исследования вза- Таблица 17. Характеристика некоторых
и м одей ствия м еж белковых биологически важных ионов
комплексов, поскольку м а р ­
П отен­
га н е ц яв л яется п а р ам агн и т­ И онны й циал К оорди на­
И он р ади ус, и он и за­ ц ионное
ным ионом — тушителем нм ци и число
спинового си гн ала, гадоли­
ний эффективно тушит бел ­
ко ву ю флуоресценцию. С в я ­ N3 0,095 5,14 6
К 0,133 4,34 6 8
зы в а н и е М ^ 2+ с з а р я ж е н н ы ­ къ 0,148 4,18 8
ми группами нуклеиновых м 8 0,065 7,64 6
кислот хорошо имитирует Са 0,0199 6,11 6 8

С и 2+, но с отличным от М § 2+ 5г 0,110 5,69 6 8


Ва 0,129 5,21 6 8
результатом: медь дестаби ­
л и зи р ует двойную спираль,
способствуя ее раскручиванию , т а к к а к с в язы в ае тся не только
с фосф атными группами, « о и с азотистыми основаниями.
С равни тельн ая характери сти ка некоторых биологически в а ж ­
н ы х ионов приведена в табл. 17. Создание ионной асимметрии
клетки обеспечивается активным транспортом Ыа+, К+, С а2+ и
Н+. Этот процесс осущ ествляется при непосредственном участии
тр ан сп ортн ы х АТФ аз.

Транспортные АТФазы

К-АТФаза. В 1957 г. И. Скоу о б наруж и л в гомогенате


периферических нервов к р а б а АТФазу, активируемую ионами
ЭДа и К и ингибируемую блокатором активного транспорта од­
н о валентны х катионов уабаином . Б ы ло сделано предположение,
что д а н н а я А Т Ф а за — фермент, который энергетически обеспечи­
в а е т транспорт Ыа+ и К+ против их градиентов. В 70-е годы
Л . Хокином было продемонстрировано, что N8, К -АТФ аза, очи­
щ е н н а я до гомогенного состояния, при встраивании в лецити-
новые липосомы способна обеспечить сопряж ение гидролиза
А Т Ф с антипортом ионов N8 и К при стехиометрии Ы а/К/АТФ-
3/2/1, т. е. той же, что обнаруж ен а д л я нативных мембран (эри­
тр оц и тов ). Таким образом, д оказательство идентичности т ран с­
п ортны х А ТФ аз и соответствующих ионных насосов было прове­
д е н о впервые на примере Ыа, К-АТФазы.
Ыа, К -А ТФ аза обнар уж ен а во многих органах; особенно ве­
л и к о ее содерж ание в органах, осущ ествляю щ их выделительную
ф у н кц и ю (почки, солевые ж елезы ) или выполняющих электри­
ческую работу (мозг, электрический орган ). Во всех случаях она
л о к а л и з о в а н а в н аруж н ы х п лазматических м ем бранах клеток.
З т о т фермент яв л яется м аркером плазмат ической мембраны.
Гидролиз АТФ представляет собой сложную реакцию, в ко ­
т о р о й участвуют ионы Ыа, К и М§[. Все стадии, по-видимому, об­
рати м ы . Об этом свидетельствует способность фермента фосфо-
ри ли ро ваться в присутствии Фн с последующим переносом (в оп­
103
ределенных условиях) ф осф ата на адениловую систему:
я + атф ^ 5!!_ ях.р адф ^ +_^ 2.радф ^ е2алф+
+ Р ^+ А Д Ф .
Кроме АТФ фермент мож ет гидролизовать все нуклеотиды и
фосфорные эфиры многих соединений (ацетилфосфат, р -Н Ф Ф ,
карбамоилф осф ат, умбеллиферонфосфат, д ин и троф ен и лф осф ат),
но активные потоки ионов в измеримых количествах об н а р уж и ­
ваю тся лишь при гидролизе АТФ и Ц ТФ .
Протомер Ыа, К -А Т Ф азы состоит из двух с у б ъ е д и н и ц — а-ли -
попротеина (100 кД ) и |3-гликопротеина (40 к Д ) , плотно у п ако ­
ванных в удлиненную глобулу, которая пронизывает м ем бр ану
насквозь. Гидролитический центр находится на а-субъединице,
он обращ ен во внутриклеточную среду. В связы вании уаб аи н а,
действующего на фермент с противоположной стороны мембраг
ны, видимо, участвуют обе субъединицы. Способен ли отдельно
взяты й протомер к активному транспорту ионов, до сих пор не­
известно, но разными методами обнаружено, что эти протомеры
сближ ены в мембране и образую т олигомерные комплексы р а з ­
ной величины (от димеров до, возможно, октамеров).
Будучи гидрофобным белком, интегральным компонентом
мембраны, N8, К -А ТФ аза образует комплекс с липидами би­
слоя. Ее активность зависит от физико-химического состояния
мембраны. О днако она, видимо, не требует специфического н а ­
бора липидов д л я нормального функционирования. После солю ­
билизации мембран детергентами активность Ыа, К-АТФазы мо­
ж е т быть восстановлена различны ми комбинациями кислых и
нейтральны х фосфолипидов и холестерина. В то ж е время в р я ­
де случаев отмечено, что процесс очистки ферм ента способству­
ет накоплению в его липидном окружении сульфатидов или фос-
фатидилсерина. Очищенный фермент обладает в оптимальных
условиях (37°С) активностью до 30— 35 мкмоль Фн на 1 мг б е л ­
ка в 1 мин. Это н аи больш ая активность из всех ион-транспорти-
рую щ их систем.
В аж н ость Ыа-насоса д ля клетки зак л ю ч ается не только в
создании градиента ионов Ыа на мембране, который мож ет вы ­
ступать в роли движ ущ ей силы в процессах возбуж дения или
вторично-активного транспорта. Ыа-насос выбрасы вает из ор га­
низма избыток Ы а+ — по этой причине морские птицы а л ь б а т р о ­
сы не н уж д аю тся в пресной воде, они могут пить морскую воду*
опресняя ее. Одновременно Ыа-насос может участвовать в регу­
ляции состояния воды в цитоплазме (А. Б. Четверин, А. С. Спи­
рин, 1983), что объясняется меньшей гидрофобностью Ыа+ по
сравнению с К+- Гидратное число К+ равно 10,5, в то время как
д л я Ыа+ оно составляет 16,6 молекул воды на 1 ион. Это мож ет
означать, что в процессе переноса трех ионов Ыа в обмен на д в а
иона К (в элементарном акте Ыа-насоса) в клетке уменьшится
количество связанной воды из-за создания асимметричного р ас­
104
пределения ионов. Наоборот, изменение агрегатного состояния
воды в клетке мож ет служить движущ ей силой д ля транспорта
ионов.
С а-А ТФ аза. Существуют д в а типа С а-А ТФ аз. Одна фермент­
н а я система обеспечивает выброс С а2+ из клетки в м еж кл еточ ­
ную среду ( Са-насос плазм ат ических м ем б р а н), д ру гая — ак ку ­
муляцию С а2+ из клеточного содержимого во внутриклеточное
депо ( Са-насос внутриклеточных м ем б р а н ). Примером первого
м ож ет служить Са-насос эритроцитов, второго — Са-насос сар-
коплазматического ретикулума. Оба они способны создавать бо­
лее чем 1000-кратный градиент С а2+ на своих мембранах, конт­
ролируя в клетке уровень С а2+ — иона, регулирующего многие
стороны жизнедеятельности клетки. С а-А Т Ф аза активируется
низкими концентрациями С а 2+ с /Са ~ 1 0 ~ 7 ммоль/л; высокие
концентрации С а2+ (1— 5 м моль/л) тормозят ее активность.
Фермент, очищенный до гомогенного состояния, не теряет
своей активности в среде с фосфолипидами или детергентами,
об ладаю щ и м и сходной величиной гидрофильно-липофильного ко­
эффициента. Структурной единицей является мономер с м олеку­
лярной массой 100— 150 кД, способный объединяться в олиго­
мерные комплексы в мембране. К аж д ы й мономер содерж ит два
С а-связы ваю щ их центра и один А ТФ -евязы ваю щ ий центр, кото­
рый способен к обратимому фосфорилированию от АТФ в среде
с С а2+ и М § 2+ и от Фн в среде с М д 2+. О бнаруж ено д ва вида
фосфофермента, превращение которых сопровождается перено­
сом С а2+ с одной стороны мембраны на противоположную ей
сторону:
2С а2 +
Е + Мд • А ТФ — — —*Е1•Р • Са 2+— • Р . Са2+ ,Е + Р „

где индексы «нар» и «вн» обозначают наруж ную и внутреннюю


сторону клетки.
К а к видно из схемы и как показано в экспериментах, стехио­
метрия транспорта Са/АТФ = 2, причем С а-насос может использо­
вать энергию многих других субстратов д ля транспорта С а2+,
хотя и с разной молекулярной активностью.
У абаин и олигомицин, специфические ингибиторы Ыа,
К -АТФ азы и А ТФ азы митохондрий, не влияют на Са-АТФазу;
она ингибируется рутенивым красным, ванадатом , 5Н -реаген та-
ми (м ерсалил, М -этилмалеимид и т. д.).
Д р уги е АТФазы, имеющие отношение к транспортным про­
цессам. К таким А Т Ф азам относится К, Н -А Т Ф аза слизистой
оболочки ж е л у д к а и кишечника. Она нечувствительна к уабаину,
К’а+, бикарбонату, но ингибируется фторидом, дициклогексил-
карбодиимидом, Й-этилмалеимидом, 2 п 2+ и В а 2+; оптимум дей­
ствия р Н ~ 7 , 5 . В процессе гидролитического цикла фермент об­
разует фосфорилированный интермедиат, который быстро р а с ­
105
п ад аетс я под влиянием К+, но г о разд о более стабилен в его от­
сутствие.
В мем бранны х п р еп ар ат а х наблю дается активация К. Н -
А ТФ азы валиномицином, что свидетельствует о наличии з а м а с ­
кированны х (не доступных д л я К+) центров. Количество з а м к ­
нутых везикул, ориентированных К -центрами внутрь, мож ет д о ­
стигать 30— 100%. С. Бонтингом была предлож ена д л я К, Н -
А ТФ азы следую щ ая схема:
М едл ен н о
Е + АТ Ф— • АТФ >ЕХ- Р ---------- »ЕХ+ Р,
Быстро
Р~ ► Я а -Р Р /•
Фермент К, Н -А Т Ф аза специфичен по отношению к субстрату.
Он гидролизует АТФ с высокой скоростью: очищенные п р е п а р а ­
ты о б ладаю т активностью до 110 мкмоль А ТФ /мг белка/ч (при
37°С); ГТФ и Ц Т Ф гидролизуются со скоростью, в 7— 9 р а з
меньшей, а ИТФ не гидролизуется вообще. К, Н -А ТФ аза — оли­
гомерный белок; в очищенных п реп аратах ферм ента в ы я вл я ю т­
ся д ва пептида с молекулярной массой 100 и 84 кД , а т а к ж е ми­
норные белковые компоненты неясной природы. Активность
ф ерм ен та зависит от липидного окруж ения и физико-химическо­
го состояния бислоя.
К, Н-АТФазой фермент н азв ан потому, что обнару ж ен а его
способность транспортировать Н+ через мембрану везикул сли­
зистой при гидролизе АТФ. Стехиометрия транспорта составля­
ет 4Н+/1 АТФ. Д р у г и е гидролизуемы е субстраты не обеспечива­
ют транспорта Н+. С. Бонтинг предполагает участие этой ф ер ­
ментной системы в создании высокой кислотности ж елудочного
сока. Вероятно, аналогичные А ТФ азы функционируют в м е м б р а­
нах бактерий.
В 1965 г. было показано наличие анион-чу ествит альной
А Т Ф азы в микросомах слизистой ж е лу д ка лягушки. Г и др ол и з
АТФ этой системой активи ровался двум я анионами — б и к арб о­
натом и хлоридом и соп ровож дался обменом этих анионов через
мембрану. Тиоцианат, ингибирующий транспорт анионов, п о дав­
л я л А ТФ азную активность. Б ы л о предположено, что о бнару­
ж е н н ая активность представляет собой часть процесса, которы й
протекает в клетках, секретирующих соляную кислоту:

Изнутри к л е т к и Н 20 - | - С 0 2 Карбоа^ дра,3_ >н + -)- Н С О ~

В мембране С1“ р+ Н С 0 3- -+-АТФ Анионная А Т Ф аза ^

+ НСОГ + А Д Ф + Р ,.
нар

Таким образом, в секретирующих клетк ах мож ет н ак а п л и в ать ся


со л я н ая кислота, а вне и х — бикарбонат-ион, обеспечиваю щий
буферные свойства среды.
106
Анион-чувствительные АТФ азы найдены в выделительной
тка н и , поджелудочной железе, мозгу, асцитным клетк ах
(А. Т. Иващ енко, 1983). Они обнаружены при анализе субкле­
точного содержимого в митохондриальной ф ракции и п л а зм ат и ­
ческих мембранах. Анионные А ТФ азы этих двух фракций р а зл и ­
чаю тся по чувствительности к олигомицину, кверцитину, ауро-
вертину Б . Однако обе фракции трудно получить в незагрязнен ­
ном виде, поэтому долгое время дискутировался вопрос — при­
н а д л е ж и т ли анионная А Т Ф аза митохондриальной фракции з а ­
грязняю щ им ее плазматическим мем бранам или, наоборот, не
с в я з а н а ли эта активность во ф ракции плазматических мембран
с присутствующими в ней митохондриями?
Д л я выяснения этого вопроса оказалось удобно использовать
такой источник п лазматических мембран, который заведомо не
за г р я зн е н митохондриями, — тени эритроцитов. Изучение
свойств анионной АТФ азы этого объекта позволило установить,
что исследуемая ферм ентативная активность отличается от ми­
тохондриальной. Она не ингибируется тиоцианатом и почти не
чувствительна к олигомицину. Кроме того, переносчик анионов
через мембрану эритроцитов, так назы ваемы й белок полосы III,
с молекулярной массой 92 кД , не имеет никакой связи с анион­
ной АТФазой. П оказано, что анионная А Т Ф аза тождественна
■Са-АТФазе эритроцитов.
С другой стороны, использование специфических ингибиторов
позволило обнаружить, что анионная А Т Ф аза митохондрий иден­
т и чн а с АТФазой, принимающей участие в окислительном фос-
■форилировании. Таким образом, существуют две АТФ азны е си­
стемы, чувствительные к анионам, — митохондриальная
А Т Ф а з а и С а-А Т Ф аза наруж ны х плазматических мембран.
Заключение

П о мере р азви тия сведений о строении, состоянии и в о зм о ж ­


ностях биологических мембран углубляю тся и наши пред ставл е­
ния о их биологической роли. В ранний (пионерский) период ис­
следования мембран была очевидна их функция отграничивать
ж ивое от неживого, сберегать и поддерж ивать асимметричное
распределение органических и м инеральны х компонентов по обе
стороны мембранной структуры. Б ы л а ясна роль мембраны в
контроле за внутриклеточным содержимым, в кл ю чаю щ ая ак ти в ­
ный транспорт одних веществ внутрь клетки, а так ж е активный
выброс других веществ из нее наружу.
П онятна роль мембран в р азд ел е клетки на отдельные отсе­
ки, образовании внутриклеточных органелл: ком партментализа-
ция клеточного о бъем а — важ н о е свойство клетки, определяемое
мембранами. П озднее стала ясна роль мембран в восприятии
сигналов из внешней среды и р еакц и я на них, позво л яю щ ая
клетке приводить характер и интенсивность метаболизм а в соот­
ветствие с условиями среды.
Одновременно выступили на передний план активно исследу­
емые сейчас м ембранны е механизмы обеспечения иммунного
статуса организма. И сследую тся механизмы межклеточных в з а ­
имодействий, способность клеток отличать свои белки от чужих
и т. д. Р азв и в ае т ся представление о том, что мембранные струк­
туры предоставляю т белкам специфическое окружение, п овы ш а­
ющее их стабильность, а т а к ж е обеспечивающее возможность
функционировать в особых условиях. Н а кап л и в аю тся
дан ны е о том, что целый р яд ферментов, адсорбируясь на
мембране, приобретает способность к согласованной работе, к
взаимодействию друг с другом. Н а этой основе возникают внут-
римембранные надмолекулярны е комплексы типа дыхательной
цепи. Количество компонентов в них коррелирует с м ол ек у л яр ­
ной активностью каж д ого компонента, т а к что соотношение
субъединиц позволяет устранить ограничения, вызванные разной
скоростью отдельных стадий метаболического пути.
Выяснено, что кинетические свойства фермента зави сят от
того, в свободном или связанном с мембраной виде он функцио­
108
нирует. Так, гексокиназа, которая работает как растворимый
цитоплазматический фермент, так и в адсорбированном на мито­
хондриальной мембране виде, имеет величины К т д ля суб стра­
тов и значения максимальной скорости, резко различные для
каж дого состояния. П оскольку целый ряд природных факторов
влияет на прочность связи гексокиназы с митохондриями, в и д ­
но, что эти изменения в кинетических константах есть реальный
путь регуляции ферм ента (Н. Ю. Гончарова, 1983).
Транспортные АТФ азы в м ем бранах организованы в олиго­
мерные ансамбли. Хотя еще не понятно, как эта олигомеризация
в л и яет на эффективность работы ансамблей, ясно, что в заи м о ­
действие м еж д у субъединицами в этих ком плексах регулирует­
ся липидным окружением. К онтролируя контакт м еж д у белко­
выми молекулами в таких ассоциатах, мембраны одновременно
контролируют и процессы, осущ ествляемые этими системами.
О б ращ ает на себя внимание, что целый р яд процессов, кото­
рый термодинамически невозможен или маловероятен в гидро­
фильной фазе, с высокой скоростью протекает в мембранном
бислое. Д емонстративный пример этого типа связан с о б р азо в а­
нием АТФ в ходе окислительного фосфорилирования. П оказан о,
что «макроэргичность» молекулы АТФ в значительной степени
зависит от гидрофильности среды. Величина свободной энергии
гидролиза (и, соответственно, образования) АТФ в гидрофобной
ф азе т а к мала, что реакц ия этого типа протекает в мембранном
окружении почти ка к равновесная. Энергия потенциала, возни­
каю щ его при переносе электронов, д о л ж н а быть затрачена в ос­
новном на конформационный сдвиг, обеспечивающий переход
АТФ из гидрофобной зоны в гидрофильную.
П о этой причине ка ж етс я весьма вероятным, что в эволюции
биоэнергетических механизмов зам ен а молекул типа пироф осф а­
та аденозинтрифосфатом как распространенным видом « р а з­
менной энергетической валю ты» смогла осуществиться только
при условии повышения тем пературы тела, обеспечившем увели­
чение гидрофобного объема клеточных мембран и возрастании
подвижности белков в бислое (И. С. Кулаев, 1984).
П одводя итог разнообразны м фактам, описывающим свой­
ства и особенности функционирования биологических мембран,
следует подчеркнуть, что они имеют в своем распоряжении у н и ­
вер са льн ы й м еха ни зм р е гу л я ц и и б елк о вы х м о л е к у ля р н ы х м а ­
ш ин, функционирующих в их составе. Этот механизм связан с
изменением микровязкости и гидрофобного объема бислоя, ко­
торое способно контролировать меж белковы е взаимодействия в
мембранны х структурах. Способы модификации бислоя, достига­
ющие этой цели, исключительно разнообразны. Понимание осо­
бенностей биологических мембран откры вает новые перспекти­
вы к а к в изучении клеточного метаболизма, так и в использо­
вании этой информации д ля нуж д практической деятельности че­
ловека.

109
Рекомендуемая литература

Антонов В. Ф. Л ипиды и ионная проницаемость мембран. М. 1982.


Бергельсон Л . Д . Мембраны, молекулы, клетки. М. 1982.
Биологические мембраны и мембраноактивные соединения/П од ред.
Б . А. Таш мухамедова. Ташкент. 1985.
Блю м енф ельд Л . А. Проблемы биологической физики. М. 1977.
Б олды рев А. А. Биологические мембраны и транспорт нонов. М. 1985.
Б олды рев А. А., М ельгунов В. И. Транспортные А ТФ азы//И тоги науки
и техники. Сер. биохимия. — 1985. — Т. 17.
И вков В. Г., Берестовский Г. Н. Динамическая структура липидного
бислоя. М. 1981.
К агава Я . Бномембраны. М. 1985.
Кейтс М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация ли­
пидов. М. 1975.
К озлов Ю. П., Каган В. Е., А рхипенко Ю. В. М олекулярные механизмы
повреж дения кислородом системы транспорта кальция в саркоплазматическом
ретикулуме мышц. Иркутск. 1983.
К орниш -Боудэн Э. Основы ферментативной кинетики. М. 1980.
К оролев Н. П. Функции лектинов в клетке//И тоги науки и техники. Сер.
О бщие проблемы физико-химической биологии. 1984. Т. 1.
М арш ел Э. Биофизическая химия. М. 1981.
О вчинников Ю. А., И ванов В. Т. Ш кроб А. М. М ембрано-активные комп­
лексоны. М. 1974.
Петров Р. В. Иммунология. М. 1982.
Северин Е. С., Кочеткова М. Н. Роль фосфорилирования в регуляции
клеточной активности. М. 1985.
Ф изические и химические зонды в исследованиях биологических мем-
бран/П од ред. Ю. А. В ладимирова//И тоги науки и техники. Сер. биофизика.
1979. Т. И .
Ф райфелдер Д . Ф изическая биохимия. М. 1980.
Х ью з Р. Гликопротенны. М. 1985.
ВШо§1са1 М етЬ гап ез/Е б . Ьу Б . С Ь а р т ап . Ьопбоп. 1980— 1984.
Сага}оЫ Е. М етЬ гап е Тгапзрог! о! С а1сш т. Ме\у-Уогк — Ьопбоп. 1982.
} 0 Г§епзеп Р. Ь. М есЬ аш зт о! 1Ье N8. К -Р и т р //В ю с Ы т . ВюрЬуз. Ас1а.
1982. Уо1. 694. Р. 27—68.
Ы п д С. ТЬе ЗеагсЬ о! 1Ье РЬуз1са1 Зепсе о! Ы {е//Р1епит Ргезз. 1984.
Боскш оой А., Ьее А. С. ТЬе М етЬ гап ез о{ А ш та1 Се11з. — Ые\у-Уогк —
Ьопбоп. 1984.
М ет Ьгапе 51гис1иге апб РипсИоп/Еб. Ьу Е. ВШ аг. Ме\у-Уогк а. о. 1981.
М ет Ьгапе РЬуз1о1од;у/Еб. Ьу Т. АпбгеоН е ! а1//Р1епит РиЫ. Согр. Ке\у-
Уогк, Еопбоп. 1980.
ОШпп Р. }. ТЬе Р1шсЫу о{ Се11 М етЬ гап ез апб Из Кед;и1а1юп//Ргой.
ВюрЬуз. Мо1ес. Вю1. 1981. Уо1. 38. Р. 1— 104.
Тап}огд СН. ТЬе НубгорЬоЫс ЕНесЕ Ые\у-Уогк. 1973.
Тап}огй СИ.. С рС СгШса! Кеу. ВюсЬ. 1984. Уо1. 17. Р. 123— 151.
Предметный указатель

А л а м ет и ц и н 35, 50, 69 Ж ел ч н ы е кислоты 19 —. л и п и до в 29


А н ест е ти к и 71, 72 Ж и р н ы е кислоты 13, 14, 18 П о л н ф о сф о н я о зи тн дЫ 83
1-А н н л н и -8-и а ф т а л и н су л ь ф о - П о л я р и за ц и я ф л у о р ес ц ен ц и и
я а т 45 И м н д а зо л 49 46, 62
А я к ер и н 24 И н т е р ф е р о н 87 П р о т еи и к и н а зы 85—6 7
А н т и б и о т и к и 67 И он ом и ц и н 69 П р от ео гл и к а н ы 26
А р гн н и и к н н а за 75 И он оф ор ы 50, 67—16 9 П р о ц ес си н г 2 6
А р р ен и у са гр аф и к 52, 77
— у р а в н ен и е 51 К ал ор и м ет р и я ск а н и р у ю щ а я Р о т а м ер ы (к о н ф о р м а р ы )
А р х е б а к т ер и и 10 41 ж и р н ы х к и сл о т 55, 57
А т ер о ск л е р о з 65 К а л ь м о д у л н н 47, 78, 83. 91
А Т Ф азы тр а н сп ор т н ы е 22, 24, К ал ь ц н д ук т н н 85 С ар к о л ем м а 61, 79, 85
76, 103 К аналы и он н ы е 79 С п ектр нн 24
— Ыа, К -за в н сн м а я 35, 64, Квин-2 46, 69 С п ек тр о ск о п и я ф л у о р е с ц е н т ­
77, 82, 88, 104 К инки 55, 56 н а я 43', 46
— С а -за в н с и м а я 76, 105 К ластер ы л н п н д н ы е 29, 55 С т ер о и ды 12, 19
— К , Н е за в и си м а я 106 К латр ин 25 С ул ь ф а т и ды 19
К ом плек соны к ати он ов 46, С ф н н гом и ел и н 18, 21
67
Б ак т ер и и гр ам от р и ц ат ел ь н ы е
К р аун ы 67 Т ем п ер а т у р а кри ти ч еск ая
15
— гр а м п о л о ж н т ел ь н ы е 16 К р уговой д и х р о и зм , К Д 40 21, 58, 65, 73
Б а к т е р и о р о д о п сн н 22, 62 Т еоф и л л и н 86
Б ел к и и н т егр ал ь н ы е 21 Л ек тн н ы 28 Т р а н сп о р т в ещ еств ч ерез
— 1 м ем б р а н н ы е 21, 74, 78 Л и п и д ы а н н ул я р н ы е 22, 29, м ем б р а н ы 9 2 —94
— конф орм апнонная п од в и ж ­ 61, 614 Т р н с -б у ф е р 49
— л а т е р а л ь н а я п о д в и ж н о ст ь Т ун н к ам н ц н и 27
н о ст ь 22, 47
29
=— р егу л я т о р н ы е 81
Б ислой, ф и зи к о -х и м и ч е ск а я — м ем б р а н н ы е 11, 18, 21 У а б а н н 89, 103— 105
х а р а к т ер и ст и к а 23 —I ф а з о в о е с о с т о я н и е 29
Ф ер м ен ты м а р к ер н ы е 34
М а г м о д у л н н 85 — л а т е н т н а я а к ти в н ость 50
В а л и н о м и ц и н 5 0 , 67, 106 М е зо м о р ф и зм лнотр опиы й 58 Ф н бр о н ек тн н 28
— тер м отроп н ы й 58 Ф илипин 68
Г а н гл и о зн д ы 19. 20 М ем бр ан ы к л еточ н ы е 12 Ф о сф а т н д и л х о л н н Ц , 39
ГнстнднН 49 — ж и д к о к р и ст а л л и ч еск о е Ф о сф о л а м б а н 8 4 —85
Г л н к ок ал н к с 24 с о с т о я н и е 28 Ф осф о л и п и д ы 9, 20
Гл н к ок он ъ ю гаты 27 — м ет од ы и сс л ед о в а н и я 37 — ф н тан н л ьн ы е 18
Г л и к ол н п и ды 9, 12, 27 — ф а зо в о е р а з д е л е н и е 59, 78
Г л н к оп р отеи н ы 27 — ф а зо в ы е п ер ех о д ы 41, 42, Х л ор п р о м а зн н 71
Г л н к оф ор н н 26 58 Х л ор т ет р а ц н к л н н 46
Г р а м и ц и д и н 23, 69 М етил т р а н сф ер а зы (д ем ет н - Х ол естер и н I I, 13, 19, 20, 65
л а зы ) 60, 65
М онен сн н 67, 68 Ц ен т р и ф у ги р о в а н и е 32, 33'
Д а н с н л х л о р н д 46
Д еС а т у р а ц н я 14 Ц е р е б р о з н д ы 9, 19
Н акти ны 67 Ц н т о с к ел е т 24. 81
Д е т ер ге н т ы 50, 69-—71
Н и гер н ц н н 67
Д и гн д р о п н р и д и н ы 80
Н н т р ен дн п н и 80 Ш о у д о м н ц и н 53
Д н л т и а з е м 80
Д и с п е р с и я о п т и ч еск о го вра­
О л и го а д еи и л а т 87 Э к сн м ер 44
щ ен и я , Д О В 45 О л и гом и ц н н 107
Д н ф ен и л г ек с а т р и ен 62 Э П Р -сп е к т р о с к о п н я 36
Э р н т р о зн н 46
Д н ф е н н л г н д а н т о и н 71
П н р ен 45 Э у б а к т е р н н 18
Д о л и х о л п н р о ф о с ф а т 27
П одви ж н ость латеральная
б ел к ов 47 Я М Р 38
Оглавление

О т а в т о р а .........................................................................................................................
Г лава .1. К раткая характеристика биологических мембран . . . . . . . 9
Классификация и характеристика мембранных липидов . . . 9
М ембранные б е л к и ..................................................................................... 21
Углеводные компоненты м е м б р а н ............................ 26
Современная концепция структуры биологических мембран 28
Г лава 2. Выделение и методы исследования мембранных препаратов 31
Получение мембранных ф р а к ц и й ....................................................... 31
Распространенные методы исследования мембранных структур 35
Г лава 3. Функции мембранных л и п и д о в .............................................. . . . 55
Состояние липидов в м е м б р а н е ........................................................... 55
Ф азовы е п е р е х о д ы ..................................................................................... 58
Асимметрия б и с л о я .................................................................................... 60
М одификация бислоя белками (проблема аннулярных липи­
дов) .............................................................................................................. 61
М одификация бислоя как способ регуляции мембранных про­
цессов ............................................................................................................... 65
Липиды к ак мишень д л я а д а п т а ц и и ......................................... 71
Г лава 4. М ембранные б е л к и .................................................................................. 74
Олигомерная о р г а н и з а ц и я ........................................................................ 74
Функции мембранных б е л к о в ...................................................... 78
Г лава 5. Мембранный транспорт и поддерж ание ионного гомеостаза 92
Х арактеристика различных транспортных п р о ц е с с о в ................. 92
Ионы металлов в биологических с и с т е м а х ...................................... 94
Биологическая роль первично-активного транспорта ................. 102
Транспортные А Т Ф а з ы ............................................................................. 103
З а к л ю ч е н и е ........................................................................................................................... 108
Рекомендуемая литература ............................................................................... 110
Предметный у к а з а т е л ь ......................................................................... ! ................... 111

Оценить