Escuela de Ciencias Químicas Ingeniería en Biotecnología Ambiental

Manual de Laboratorio de Bioquímica Dra. M. Sc. Mayra J. Espinoza M.

PRÁCTICA No 4
TEMA: REACCIONES DE CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS.

OBJETIVOS.-

Objetivos Generales.-
 Identificar proteínas por medio de reacciones de caracterización

Objetivos Específicos.-
1. Establecer la presencia de carbono, hidrógeno, oxígeno, azufre y nitrógeno
utilizando pruebas sencillas.
2. Verificar la solubilidad de las proteínas utilizando diferentes soluciones.
3. Evidenciar la presencia de determinados aminoácidos en las proteínas utilizando
reacciones específicas de coloración.

TEORÍA

Las proteínas son identificadas por medio de reacciones de coagulación (desnaturación),

de precipitación y de coloración.

1. PROPIEDAD DE SOLUBILIDAD DE LAS PROTEÍNAS

La solubilidad de las proteínas depende, no solo de la variedad de grupos
residuales de ácidos aminados y de la manera en que se pliega la cadena peptídica, sino
también de las propiedades del sistema solvente en el cual se encuentra la proteína. Los
cuatros factores principales que afectan la solubilidad se relacionan todos con las
estructuras secundaria y terciaria de las proteínas.
Estos factores son: a) la fuerza iónica, b) el pH, c) la temperatura, y d) la
constante dieléctrica del solvente. Naturalmente, la hidrólisis de los enlaces peptídicos
para valores extremos de pH también modifica la estructura primaria.

2. REACCIONES DE COLORACIÓN
Las reacciones de coloración se deben a la presencia de determinados
aminoácidos o de ciertos grupos amínicos en la molécula proteica. Por este motivo son
también llamadas reacciones estructurales

2.1 REACCIÓN XANTOPROTEICA

El ensayo recibe el nombre del griego xanthos (amarillo). Tratando una
disolución de proteína con ácido nítrico concentrado, la proteína precipita (color blanco)
y al calentar se disuelve dando color amarillo. El color amarillo se debe a la formación
de nitrocompuestos aromáticos; por tanto, se forma debido a la presencia de anillos
aromáticos en la molécula proteica. Si se neutraliza con un álcali el color pasa a

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anaranjado oscuro En las proteínas los constituyentes responsables para la reacción son
la tirosina, el triptófano y la fenilalanina.
2.2 REACCIÓN DE MILLON
El reactivo Millon es una mezcla de nitrato y nitrito mercúrico, obtenido
disolviendo mercurio metálico en ácido nítrico. Añadido a una disolución de proteína,
ésta precipita y al calentar el precipitado toma color rojo ladrillo.
La característica de la reacción es el cambio de color del precipitado. El
precipitado blanco inicial es debido a la sal de mercurio (metal pesado) del reactivo. La
reacción se da con substancias aromáticas portadoras de grupos fenólicos. En las
proteínas, el constituyente responsable es la tirosina (debido al grupo hidroxifenilo). El
pigmento formado parece ser una mezcla de sales complejas de mercurio con derivados
3- nitroso-o-benzoquinónicos.
2.3 REACCIÓN HOPKINS – COLE (REACCIÓN GLIOXILICA)
Si se añade a una disolución de proteína unas gotas de disolución de ácido
glioxílico, seguidamente se lleva al fondo una capa de ácido sulfúrico concentrado, se
forma un anillo violeta en la unión de los dos líquidos, si existe triptófano en la proteína
investigada puesto que el grupo indol es el determinante del resultado positivo del
ensayo al condensarse al ácido glioxílico.
2.4 REACCIÓN DEL AZUFRE
El azufre de la molécula proteica, por la acción del álcali y del calor, se
convierte en sulfuro, que, por la presencia de la sal de plomo, da como resultado el
sulfuro de plomo (precipitado de color negro). Los aminoácidos responsables son
cisteina, cistina, metionina.

R-SH + 2 NaOH ROH + Na2S+ H2O

Na2S+ Pb(CH3-COO)2 2 CH3-COONa + PbS

2.5 REACCIÓN DE BIURET
Esta reacción la producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos
ya que se debe a la presencia del enlace peptídico -CO-NH-.
El reactivo del Biuret (sulfato de cobre(II) + NaOH), se coordina con los enlaces
peptídicos formando un complejo de color violeta (Biuret), cuya intensidad de color
depende de la concentración de proteínas. Cuando una proteína se pone en contacto con
el álcali concentrado, se forma una sustancia compleja denominada Biuret, que en
contacto con una solución de sulfato cúprico diluido, da una coloración violeta
característica.
La reacción debe su nombre por el hecho de haber sido verificada, inicialmente,
con Biuret, producto de condensación de la urea. El pigmento responsable por el color
producido en la reacción es un complejo de cobre.

3. TERMOCOAGULACIÓN
La termocoagulación de las proteínas es tanto más rápida e intensa, cuanto más
próximos estuviesen de su punto isoeléctrico. Para la mayoría de las proteínas animales

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el punto isoeléctrico es aproximadamente 5. Cuando el pH del medio está muy alejado

del punto isoeléctrico (escala ácida o alcalina), no habrá coagulación.

MATERIALES.- REACTIVOS.-

- Tubos de ensayo (5) - Caseína

- Gradilla - Sosa – cal (mezcla fundente)
- Reverbero - Sol. HCl 6 N
- Pinza para tubo - Sol. Acetato de plomo 0.1 M
- Pipeta de 10 mL - Sol. NaOH 6 N
- Espátula - Sol. de caseína al 1%
- Pera de succión - Sol. Na2CO3 al 0.5 %
- Varilla de agitación - Sol. HCl 0.2%
- Vaso de precipitación - HNO3
- H2SO4 1N
- Sol. NaOH 1%
- Sol. CH3COOH 1,5%
- Sol. NaOH 10%
- Agua
- Reactivo de Millon
- Reactivo Glioxílico
- H2SO4
- Sol. Acetato de plomo al 10%
- Sol. Sulfato de cobre al 1%
GRÁFICOS.-

Reacción Xantoprotéica.-

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Reacción de Biuret.-

Reacción de los aminoácidos azufrados.-

PROCEDIMIENTO.-

A. ANÁLISIS

1. PRESENCIA DE CARBONO, HIDRÓGENO, OXÍGENO

Se coloca 0,2 g de caseína en polvo en un tubo limpio y seco, se calienta
gradualmente hasta carbonizar la muestra. La carbonización indica la presencia de
oxígeno e hidrógeno.

2. PRESENCIA DE AZUFRE
Se calienta 0.2 g de caseína con 1 g de sosa – cal (mezcla fundente) en un tubo
de ensayo. Se deja enfriar el tubo, luego se añade de 5 mL de HCl 6N al residuo. Se
coloca un papel filtro impregnado de acetato de plomo 0.1 M sobre la boca del tubo. Si

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hay aparición de una mancha café obscura de PbS formado, se determina la presencia de
azufre.
3. PRESENCIA DE NITRÓGENO
Se coloca 0.2 g de caseína en polvo en un tubo de ensayo y se añade 2 mL
NaOH 6 N, calentar cuidadosamente. Note el olor de amoníaco y el efecto que sus
vapores sobre el papel tornasol rojo.

B. SOLUBILIDAD DE LAS PROTEÍNAS

Se rotulan cuatro tubos de ensayo y se colocan en cada tubo 1 mL de solución de

caseína al 1%, se añade en orden respectivo 2 mL de: NaOH al 10%, Na2CO3 al 0.5%,
HCl al 0.2% y agua. Observe y anote. La mayor solubilidad de las muestras se señalan
con: (-) insoluble; (±) parcialmente insoluble y (+) soluble.

C. REACCIONES DE COAGULACIÓN (DESNATURALIZACIÓN)

Se coloca en un tubo de ensayo, cerca de 2 mL de ácido nítrico concentrado y

añadir lentamente y con cuidado por las paredes, 2 mL de la solución de proteína, sin
mezclar. En la interfase aparece un anillo blanco. Esta es la reacción de Heller.

D. TERMO COAGULACIÓN

Se añade a un tubo de ensayo conteniendo 5 mL de solución proteica, 3 gotas de

solución de ácido sulfúrico 1 N y se calienta a ebullición. Se adiciona al líquido todavía
caliente, gota a gota, y agitando, hidróxido de sodio al 1%. En un momento dado se dará
la coagulación de las proteínas. Se continúa la adición de la solución de hidróxido de
sodio, gota a gota y agitando hasta disolución completa del precipitado. Se calienta
nuevamente hasta ebullición, no habrá coagulación. Se añade al líquido todavía caliente,
gota a gota y agitando ácido acético al 1,5%. En un momento dado aparecen coágulos
de proteína.

E. REACCIONES DE COLORACIÓN

REACCIÓN XANTOPROTEICA
Se coloca en un tubo de ensayo 2 mL de solución proteíca y 10 gotas de ácido
nítrico concentrado. Se forma un precipitado blanco. Se hierve por 1 o 2 minutos; el
precipitado se vuelve amarillo o se disuelve, dando una solución amarilla. Adicionando
solución de NaOH al 10% gota a gota, y agitando hasta alcalinizar, el color cambia para
anaranjado.

REACCIÓN DE MILLON

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Se coloca en un tubo de ensayo 2 mL de solución de proteína, y se añade 5 gotas

del reactivo de Millon. Se forma un precipitado blanco que al calentar se vuelve rojizo.
Evite realizar la reacción en medio fuertemente alcalino (hay la precipitación de óxido
mercúrico) o con exceso de reactivo (hay decoloración).

REACCIÓN GLIOXILICA
Se mezcla en un tubo de ensayo 1 mL de reactivo glioxílico y 2 mL de solución
de proteína; añadir cuidadosamente por las paredes, ácido sulfúrico concentrado, sin
mezclar. En el límite de separación de los líquidos, aparece un anillo violeta. La
reacción en general es muy lenta. La reacción no se da en presencia de nitratos, nitritos,
cloratos y exceso de cloruros. El ácido sulfúrico debe ser muy puro.

REACCIÓN DE BIURET
Se coloca en un tubo de ensayo 2 mL de una solución de proteína, añadir 5 gotas
de NaOH al 10% y 3 gotas de sulfato de cobre al 1%. La reacción es positiva cuando
aparece una coloración rosa, o, más, frecuentemente, violeta o lila.

CUESTIONARIO

1. Describa la caseína
2. Indique cuales son las propiedades físicas y química de las proteínas.
3. Explique la desnaturalización de las proteínas.
4. A que se debe las reacciones de coloración
5. Explique el principio de la reacción de Millon
6. ¿Cómo identificar azufre en los aminoácidos azufrados?