P2: PARAMETROS SANGUINEOS: VELOCIDAD DE SEDIMENTACION, VALOR

HEMATOCRITO, CONCENTRACION DE HEMOGLOBINA Y CONCENTRACION DE

PROTEINAS PLASMATICAS TOTALES

1.- VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN

 Introducción

En una muestra de sangre incoagulable los elementos formes se van sedimentando poco
a poco en relación con la densidad de cada tipo celular. La velocidad con que sedimentan los
eritrocitos está determinada por características peculiares de cada muestra de sangre, por lo
que constituye un parámetro de gran utilidad clínica: "velocidad de sedimentación globular",
en la influyen diversos factores (tamaño del glóbulo, grado de agregación entre glóbulos,
diferencias de densidad entre células y plasma…).
La velocidad de sedimentación tiene interés clínico puesto que su valor cambia
notoriamente en estados patológicos (infecciosos, en procesos tumorales, hipotiroidismo…)

 Material

- Tubos de Westergren
- Soporte para tubos de Westergren

 Método

Usamos una pipeta especial (Westergren) graduada en milímetros, junto con un porta
pipetas ajustado a ella. Empezamos por aspirar sangre por la pipeta enrasada a cero,
cuidando de no dejar burbujas de aire y colocándola perfectamente vertical en el soporte,
anotándose la hora.
Pusimos la pipeta a las 17:50 y la sangre estaba a 25mm. Al cabo de dos horas se
encontraba en el 30. La velocidad de sedimentación ha sido de 2.5mm/h. Al comparar con
los datos provisionados por el guion, este valor se asemeja al de la vaca.

2.- CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS TOTALES

 Introducción

La concentración total de proteínas plasmáticas se puede determinar mediante el

Método Biuret, una técnica espectrofotométrica. En solución alcalina y en presencia de
reactivo Biuret, las proteínas forman un complejo coloreado que se detecta
colorimétricamente a una longitud de onda de 540 nm.

 Material

- Reactivo Biuret
- Agua destilada
- Albúmina Bovina al 10% (10g/100 ml) o 10 g/dl
 - Muestra de sangre
- Tubos de ensayo
- Pipetas
- Colorímetro o espectrofotómetro

 Método

Recta patrón: Preparamos patrones de proteína a partir de la solución madre de albúmina

bovina 100 mg/ml, a las concentraciones indicadas por el enunciado.

En cada uno de los tubos de ensayo añadimos 2,5 ml de reactivo Biuret, adicionando en cada
caso 50 µl del plasma problema, 50µl de cada punto de la recta o agua (tubo blanco) tal y
como se indica a continuación:

Muestra Reactivo Biuret Muestra Absorbancia 540nm

Blanco 2.5ml 50µl agua 0.000
1 2.5ml 50µl madre 0.491
2 2.5ml 50µl patrón de 80 0.430
3 2.5ml 50µl patrón de 60 0.348
4 2.5ml 50µl patrón de 40 0.332
5 2.5ml 50µl patrón de 20 0.255
Problema 2.5ml 50µl muestra plasma 0.408

Agitamos los tubos y dejamos reposar 20 minutos a temperatura ambiente. Leemos la

absorbancia a una longitud de onda de 540 nm.

Chart Title
120
Concentración de proteinas

100
y = 341.45x - 66.747
80 R² = 0.9731
60
(mg/ml)

Series1
40
20 Linear (Series1)
0
0 0.2 0.4 0.6
Absorbancia 504 nm

Ecuación de la recta: Y=341,45x-66.747

Problema: Concentración = 341.45*absorbancia-66.747

Obtenemos: Concentración= 341.45*0.408-66.47=72.84mg/ml

3.- VALOR HEMATÓCRITO

  Introducción

El valor hematocrito es el porcentaje en volumen ocupado por lo eritrocitos en una

determinada muestra de sangre. Varía en función al número y tamaño de los hematíes, así
como con el volumen del plasma. Junto con el recuento de células sanguíneas y la cantidad
de hemoglobina constituyen las tres pruebas hematológicas básicas que determinan índices
muy útiles en hematología.
En uno de los métodos, se emplean tubos especiales para la centrifugación de sangre
incoagulable: tubos de Wintrobe, en los cuales se coloca la sangre y se centrifuga hasta que
permanezca a una altura constante la columna de glóbulo. La graduación del tubo permite
obtener cómodamente la relación entre el volumen de plasma y de glóbulos.
Para pequeñas muestras de sangre, usamos los capilares de micro hematocrito.

 Material

- Capilares de microhematocrito o tubos de Wintrobe

- Centrifuga
- Regla graduada
- Pipetas Pasteur

 Método

Como trabajamos con pequeñas muestras de sangre, usamos un capilar. Introducimos

uno de los extremos en la sangre e inclinamos hacia abajo el otro extremo. Retiramos el
tubo capilar y eliminamos cualquier resto de sangre de su superficie externa. Cerramos un
extremo del tubo taponándolo con plastilina. Luego, disponemos el capilar sobre la platina
de la centrifuga para microhematócrito con el borde cerrado orientado hacia la parte
periférica.
Ponemos a centrifugar el capilar durante 5 minutos a 10.000 r.p.m. Mediante una regla,
medimos la longitud que ocupa en el capilar la columna de los eritrocitos sedimentados y la
referimos en el tanto por ciento a la longitud total de la columna de sangre que llena el
capilar.

Obtenemos un valor hematocrito del 36%, equivalente a una vaca u oveja.

4.- CONCENTRACIÓN DE HEMOGLOBINA

 Introducción

La hemoglobina ocupa el interior de los glóbulos rojos, salvo en determinadas patologías.

Un aumento de los valores de hemoglobina por encima de los normales puede ser debido a
un aumento del número de eritrocitos (cambio de altitud) o bien a una pérdida de líquido
plasmático. Un descenso en los valores de hemoglobina por debajo de los normales es, sin
embargo, un índice característico de las anemias, hemorragias repetidas y leucemia.

Determinaremos la cantidad de hemoglobina presente en una muestra de sangre mediante

un método colorimétrico basado en la reacción del reactivo de Drabkin con la hemoglobina,
pasándola a cianometahemoglobina que posee un máximo de absorción a 540 nm. Es una
reacción cuantitativa.

 Material

- Reactivo de Drabkin
- Tubos de ensayo
- Pipetas
- Colorímetro

 Método

Colocamos 5 ml de reactivo de Drabkin en el tubo de ensayo del colorímetro. Tomamos

0,02 ml de sangre que se mezclan con el contenido del tubo y dejamos reposar durante 5
minutos.
A continuación se lee a 540 nm ajustando el 100% de transmitancia con reactivo de
Drabkin. Se pasa la medida a absorbancia (A=2 - log (T) ) y calculamos el número de
miligramos de hemoglobina presentes en los 20 microlitros de sangre, utilizando una curva
patrón obtenida previamente a partir de concentraciones conocidas de hemoglobina.
Como blanco usamos una solución comercial ya preparada.

Tenemos dos absorbancias: 0.305 que equivale a 11.2g/dl y 0.301 que equivale a 11g/ml.