Pro Pried A Des Funciona Is

Bento Gonçalves – RS
17 a 21/10/2011
PROPRIEDADES FUNCIONAIS DAS FITOMOLÉCULAS
Marcia Ortiz Mayo Marques

Laboratório de Produtos Naturais
Centro de P&D de Recursos Genéticos Vegetais
INSTITUTO AGRONÔMICO (IAC)
Prof. Dra. Marcia Ortiz Mayo Marques

mortiz@iac.sp.gov.br
FITOMOLÉCULAS
PROPRIEDADES
FUNCIONAIS

Função Fitomoleculas: Comunicação
Defesa herbívoros
Polinização
Dispersão sementes
Foto: Montero & Naranjo.
Vespa (Braconidae) parasitando pulgão em

uma planta de Cyphomandra betacea.

1: larvas de lepidópteros
(Spodoptera littoralis)
2: larvas de larvas do
coleóptero Diabrotica
virgifera virgifera
2
Difosfato de farnesila * trans-cariofileno
(*) Terpeno Sintase 23 (TPS23): expressão desta enzima é controladaVARASSIN

no nívelet al, 2000
transcricional e induzida, independentemente, pelos danos causados nas
folhas por S. littoralis e nas raízes por D.virgifera
Conclusão: trans-cariofileno pode atrair os inimigos naturais dos herbívoros (

nematóides e vespas HENTRICH
parasitas).
et al, 2007

Kollner et al, The Plant Cell, v. 20, p. 482–494, 2008
Comunicação: Polinizadores
geraniol linalol
...Polen, nectar, resinas.
VARASSIN et al, 2000
Mamíferos:
HENTRICH et al, 2007

alcool benzílico

Classe Composto Planta Polinizador Referência
Terpenos
Pineno Antúrios HENTRICH et
Geraniol (Anthurium sp) Abelhas al, 2007
(Meliponinae)
Limoneno Orquideas REIS et al, 2000
(Oncidium sp)
Passifloras Mamangaba VARASSIN et al,

Linalol (P. alata) (Xylocopa sp) 2000
Benzenóides
Passifloras Morcego VARASSIN et al,
Alcool benzílico (P. mucronata) (Glossophaga sp) 2000
Benzoato de Orquideas Borboletas Huber et al,

benzila (Gymnadenia (Lepidoptera) 2005
sp)
Derivados lipídeos HENTRICH et
Anturios Abelhas al, 2007
Heptadeceno
Orquideas (Eulossa sp) Huber et al,
mortiz@iac.sp.gov.br 2005
FLAVONÓIDES, ÁCIDOS GRAXOS E ESTILBENO
ÁCIDOS ω-3

Propriedade: antitumoral, antioxidante
gengibre Gingerol Shogaol
Catharantus roseus L.
vincristina Sulfato de vincristina

Espécie: Chamomilla recutita - Família: Annonaceae
Objetivo: Avaliar a atividade do (-) bisabolol, principal

componente do óleo essencial de Chamomilla recutita,
contra o Leishmania infantum.
*agente etiológico da leishmaniose nos países da bacia mediterrânica

Leishmanioses são causados por protozoários do
gênero Leishmania que afetam o homem e outras espécies de
mamíferos, incluindo os caninos, que são os principais hospedeiros da
doença.
A leishmaniose humana é encontrada em regiões
com um clima quente.
O agente patogênico da leishmaniose na Península Ibérica é

a espécie Leishmania infantum. A maior incidência está no
Mediterrâneo e da zona central da península, principalmente entre
crianças (Castro et al. 2003 ).

O tratamento farmacológico da doença, apresenta uma vasta gama de
reações adversas, motivando a busca de novos agentes no controle da doença.
Assim, tem havido um crescente interesse na utilização de componentes do óleo
essencial contra a leishmaniose (Rosa et al. 2003)
Teste da pureza do (-)α-bisabolol

(-)α-bisabolol foi fornecido por Sensient
Fragrances S.A. (Granada, Spain).
A purificação foi avaliada por GC-MS (Gas
Chromatograph Hewlett-Packard 5973)

Padronizou-se a concentração de promastigotas de 1x106
nas culturas de Leishmania infantum em meio RPMI-1640 no inicio
do experimento.
(-)α-bisabolol foi diluído em 1% dimetilsulfóxido (DMSO),

com meio RPMI-1640 nas concentrações de 1,000 mg / mL. Obtendo
a partir desta as concentrações de 1000, 500, 250, 125, 100, 75, 62,5,
50, 37,5, 31,2, 25; 18,75, 15,6, 12,5, 7,8 e 6,25 mg/mL

Família: Asteraceae
Nome popular: catinga-de-bode, mentrasto, maria-
preta, picão-branco, picão-roxo, erva-de-São João,
erva-de-São-José, erva-de-Santa-Lúcia

Aflatoxinas são produtos do metabolismo secundário de Aspergillus flavus e
Aspergillus parasiticus.
Contaminam grande variedade de alimentos,principalmente o amendoim, nozes,

sementes de algodão, milho, trigo, sementes oleosas em geral, ração animal,
produzindo a aflatoxina em condições ambientais adequadas, como temperatura
entre 25-30 Celsius e atividade de água superior a 0,86.
A contaminação de grãos com micotoxinas e fungos toxigênicos, pode ocasionar,

além de problemas de saúde, perdas econômicas consideráveis já que lotes
contaminados devem ser descartados.
A FAO (Food and Agriculture Organization) estima uma perda mundial de 25%
dos grãos produzidos.

Aflatoxina B1: altamente tóxica

OBJETIVOS
Avaliar o potencial do óleo essencial de folhas e flores de

mentrasto (Ageratum conyzoides) na inibição do crescimento e
da produção da aflatoxina B1 (AFB1) em cultura de Aspergillus
flavus,
Avaliar a composição química do óleo essencial das folhas e

flores de mentrasto;
Fracionar o óleo essencial para obtenção do princípio ativo

inibidor do crescimento e da produção de aflatoxina B1;
Avaliar possíveis alterações na ultra-estrutura celular do fungo.

MATERIAL E MÉTODOS
Óleo essencial das folhas e flores : hidrodestilação
Concentrações de óleo essencial : 30 μg/mL; 20 μg/mL; 10

μg/mL; 5μg/mL; 1 μg/mL; 0,40 μg/mL; 0,20 μg/mL; 0,10 μg/mL;
0,04μg/mL; 0,020μg/mL; 0,01 μg/mL and 0,00 μg/mL (controle).
Microscopia eletrônica: avaliação da atividade dos óleos

essenciais nas células do fungo.
Frações foram purificadas por : CCDP
Identificação das substâncias: EM

Estruturas químicas dos principais componentes do óleo essencial de folhas e
flores de Mentrasto.

RESULTADOS
Composição química: principais componentes foram o precoceno II

(46,35%), precoceno I (42,78%), cumarina (5,01%) e trans-cariofileno
(3,02%).
Precoceno II é o composto ativo do óleo essencial.
Atividade: Inibiram significativamente o crescimento do fungo m

58%, 61% 44%, 45%, 63%, 63%, 57%, 49%, 30%, 29% e 20%.
As concentrações (58 a 49%) inibiram a produção da aflatoxina B1

completamente.
Observada alterações ultraestruturais dependente da concentração

do óleo essencial de Ageratum conyzoides utilizado. Mais evidentes
no sistema das endomembranas, afetando principalmente a
mitocôndria.

IMPORTÂNCIA ECONÔMICA
• Brasil – maior mercado de agrotóxicos no mundo;
•Mercado Pessoal, Perfumaria e Cosméticos * :

3ª posição mundial
Crescimento médio de 10,5% (últimos 15 anos)
US$ 37,4 bilhões
•Aromas: crescimento de cerca de 5% ao ano,
* ABIHPEC; 2011 Euromonitor International

Pesquisas com Plantas Aromáticas e Medicinais (IAC)
Nativas/Cultivadas
Bioprospecção
Óleos Essenciais Extratos Vegetais
• Caracterização Química • Domesticação

•Caracterização Olfativa • Diversidade Genética
• Avaliação Biológica •Genômica e metabolômica
• Melhoramento Genético

BIOPROSPEÇÃO DE PLANTAS AROMÁTICAS NATIVAS
Objetivo : avanço do conhecimento

da flora aromática nativa sob o
ponto de vista:
• levantamento taxonômico;
• variabilidade química e genética;
•agregar valor as espécies;
• contribuir para o uso sustentável ;
• conservação das espécies

Número de famílias botânicas, gêneros e espécies do Cerrado e
Mata Atlântica avaliadas
Família Gênero Espécie

36 82 157

EXPEDIÇÃO DE COLETA
EXTRAÇÃO DOS ÓLEOS ESSENCIAIS

E PREPARO DE EXTRATOS
ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO AVALIAÇÃO OLFATIVA E DA

QUÍMICA ATIVIDADE BIOLÓGICA *
DIVERSIDADE QUÍMICA E
DOMESTICAÇÃO
GENÉTICA
MELHORAMENTO GENÉTICO

EXTRAÇÃO DE FITOMOLÉCULAS
VOLÁTEIS (ÓLEOS ESSENCIAIS)
HIDRODESTILAÇÃO

DESTILAÇÃO POR ARRASTE A VAPOR

ROTINA DE ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA DE ÓLEOS ESSENCIAIS
Óleos essenciais
CG - EM CG - DIC
EM IR co-injeção de padrões IR co-injeção de padrões
* Substâncias não identificadas
Isolamento: CCDC; CC; CLAE
IV EM RMN de 1H RMN de 13C

Atividade bacteriana dos óleos essenciais
de
Baccharis dracunculifolia e Vernonia scorpioides **
Óleos essenciais: avaliados em linhagens de Staphylococcus aureus
Bombas de efluxo: proteínas integrantes da membrana plasmática

bacteriana e que tem sido responsabilizadas por diversos casos de
resistência a drogas , as quais são expelidas para fora da célula ;
CIM: método da diluição em meio de cultura solidificado em diferentes

concentrações
(*): José P. de Siqueira-Júnior/ Lab. Genética de Microorganismos – UFPB)

Tabela 1. CIM (µg/mL) dos óleos essenciais (µL/mL) de B. dracunculifolia e V. scorpioides.
Linhagens/Antibiótico OE de B. dracunculifolia OE de V. scorpioides

IS-58 / Tetraciclina 5 ≥20
RN-4220 / Eritromicina 10 ≥20
SA-1199B / Norfloxacina ≥20 ≥20
Tabela 2. CIM (µg/mL) do norfloxacina (Nor) na ausência e na presença de concentrações

subinibitórias dos óleos essenciais.
NOR + OEBd NOR + OEBd NOR + OEVs NOR + OEVs

NOR
(CIM 1/4) (CIM 1/8) (CIM 1/4) (CIM 1/8)
64 4 (16) 16 (4) 8 (8) 64 (0)
OEBd - óleo essencial de B. dracunculifolia; OEVs - óleo essencial de V. scorpioides
*entre parênteses, os fatores de redução da CIM.
Resultado: OE não apresentaram atividade antiestafilococica

OE + NOR : atividade moduladora da resistência, indicando inibição
de bomba de efluxo

Principais componentes do óleo essencial de Baccharis dracunculifolia
E-nerolidol

β-pineno

limoneno

Principais componentes do óleo essencial de Vernonia scorpioides
E-cariofileno

germacreno D

α-E-E-farneseno

ÓLEO ESSENCIAL DE Lychnophora pinaster MART
•Família: Asteraceae
•Nome popular: arnica, arnica mineira
•Ocorrência - restrita a complexos rupestres de MG, BA e GO
•Substância majoritária:
• indústria alimentícia:
aromatizante (sintético);
• atração de insetos
M eO O
cinamato de metila
CARACTERIZAÇÃO DA DIVERSIDADE GENÉTICA,
VIA MARCADOR MICROSSATÉLITE, E CONSTITUINTES DO ÓLEO ESSENCIAL DE
Lychnophora pinaster MART
Doutorado : LENITA LIMA HABER/FCA-UNES-Botucatu (2008)

Co-orientação: Dra. Maria Imaculda Zucchi – APTA Polo Regional Centro Sul

Lychnophora pinaster
• Uso popular:
• folhas e flores : extrato alcoólico e pomada
antiinflamatória, analgésica e cicatrizante ferimentos,

contusões ou hematomas, picadas de insetos
(Pinheiro, 2002; Souza, 2003)
• uso cosmético
sabonete - eliminar asperezas e rachaduras, suavizar

hematomas e contusões
(Almeida et al., 1998)

OBJETIVOS
Avaliar a variabilidade genética de Lychnophora pinaster por

meio de marcador molecular microssatélite;
Avaliar a composição química dos óleos essenciais dos

indivíduos coletados em populações nativas no estado de MG;
Avaliar a composição química dos óleos essenciais cultivados

em Botucatu – SP

COLETA

MATERIAL E MÉTODOS
• População
• amostrados 20 indivíduos a;
• material vegetativo para propagação;
• folhas para análises do O.essencial e genética;
• amostras de solo;
• material para a confecção de exsicatas – depositadas no herbário do
IAC;
• dados de localização geográfica;

CULTIVO L. pinaster

Colheita, Extração e análise dos óleos essenciais
•Coleta do material nativo: Lavras (Antena , Estrada Real), Carrancas (Estrada
Real)
Colheita do material cultivado: 3 estações do ano ( verão, outono e inverno);
• Secagem: 40 C até peso constante;
• Extração do óleo essencial: hidrodestilação em aparelho Clevenger por 2hs;
•Análise do óleo essencial: CG-EM
•Avaliação dos resultados : análise multivariada (ACP)

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR
Marcador molecular: microsatélite
•Extração do DNA - construção da biblioteca enriquecida com locos microssatélites e estudo
da variabilidade genética e da estrutura populacional;
• Protocolo de extração de DNA baseado no uso de CTAB com modificações.
Doyle e Doyle (1990 )
• Quantificação do DNA - gel de agarose,
• Comparação do tamanho e da intensidade das bandas do DNA com bandas de DNA
do fago λ - 10ng/µL.

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR
• Construção da biblioteca enriquecida com locos SSR,

• Protocolo descrito por Billotte et al. (1999) com modificações;
• primers obtidos - seqüenciados, desenhados (Centro de Citricultura -
Cordeirópolis) e sintetizados (Imprint do Brasil).
• Otimização das condições de amplificação dos primers - série de amplificações com a Taq
polimerase,
• temperatura de reassociação (48º - 54ºC);
• concentração de MgCl2 (0,375 – 1,5µL);
• DNA (2,5 - 5,0µL);
• primers (1,0 - 4,0µL).

AVALIAÇÃO DOS LOCOS
• Programa Micro-Checker
• freqüência de alelos nulos,
• amplificação preferencial de alelos menores
• possíveis erros de genotipagem devido à presença de bandas
fantasmas (bandas duplicadas);
• Freqüências alélicas e genotípicas Teste exato de Fisher

• aderência às proporções de Equilíbrio de Hardy-Weinberg;
• Desequilíbrio genotípico entre pares de locos desequilíbrio de ligação;

DIVERSIDADE GENÉTICA
• Freqüências alélicas FSTAT,

• Diversidade genética GDA,
• número médio de alelos (A),
• heterozigozidades esperada (He) e observada (Ho),
• índice de fixação;
• taxa de cruzamento aparente.
ESTRUTURA GENÉTICA
• Variâncias das freqüências alélicas estatísticas F

• índice médio de fixação dentro das populações – f,
• índice de fixação total das populações – F
• divergência genética entre populações – θp
• parâmetro Rst
• fluxo gênico aparente (Nm) entre populações
RESULTADOS
Populações nativas : substâncias majoritárias
OH
H
M eO O
cedr-8(15)-em-9-alfa-ol
cinamato de metila
H
E E
H E
trans-cariofileno
Prof. Dra. Marcia Ortiz Mayo Marques -humuleno
Populações nativas
Antena x Estrada Real x Poço Bonito
Estrada Real 1 75,55 15,7 4,61 0,79
Poço Bonito 81,95 12,16 3,39 0,79
Estrada Real 61,07 8,71 6,16 1,9
Antena 10,24 15,89 12,3 25,22
0 20 40 60 80 100 120
trans-cinamato de metila trans-cariofileno alfa-humuleno

sesquiterpeno oxigenado 1 sesquiterpeno oxigenado 4 cedr-8(15)-em-9-alfa-ol
Componentes majoritários (%) dos óleos essenciais das populações nativas de Lavras
(Antena e Poço Bonito) e de Carrancas (Estrada Real e Estrada Real 1), Minas Gerais.

Populações nativas
(14,37%)
B
◊ Antena ◊ Estrada Real ◊ Poço Bonito (57,27%)
Análise de componentes principais (ACP) para os indivíduos

nativos genotipados nas populações de Lychnophora pinaster.

Populações cultivadas
Antena
cedr-8(15)-em-9-alfa-ol 1,35 0,71 0,9 27,85
alfa-humuleno 5,35 2,41 3,56 0,93
trans-cariofileno 19,06 9,11 12,26 2,07
trans-cinamato de metila 41,77 63,48 57,05 12,46
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Verão Outono Inverno Nativa
Porcentagem relativa média (%) dos principais componentes do óleo

essencial de folhas de L. pinaster, oriundas de Antena, município de
Lavras (MG), e cultivadas em Botucatu (SP).

Estrada Real
alfa-humuleno 8,16 5,00 5,86 4,16
trans-cinamato de 55,27
40,19 46,02 59,09
metila
0 50 100 150 200 250
Porcentagem relativa média (%) dos principais componentes do óleo essencial de

folhas de L. pinaster, oriundas de Estrada Real, município de Carrancas (MG), e
cultivadas em Botucatu (SP).

Estrada Real 1
alfa-humuleno 4,86 4,16 4,11 4,33
trans-cinamato de
43,49 59,45 59,37 77,01
metila
0 50 100 150 200 250 300
Porcentagem relativa média (%) dos principais componentes do óleo essencial

de folhas de L. pinaster, oriundas de Estrada Real 1, município de Carrancas
(MG), e cultivadas em Botucatu (SP).

Poço Bonito
alfa-humuleno 5,09 4,45 4,07 4,13
trans-cinamato de
63,07 68,18 72,44 79,74
metila
0 50 100 150 200 250 300
Porcentagem relativa média (%) dos principais componentes do óleo essencial de

folhas de L. pinaster, oriundas de Poço Bonito, município de Lavras (MG), e
cultivadas em Botucatu (SP).

CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA
Padrão de divergência genética entre as três populações de L. pinaster

definido pelo agrupamento UPGMA, a partir das distâncias
genéticas de Nei (1972). Correlação cofenética igual
0,96% (1000 reamostragens bootstrap para porcentagem
de consistência dos nós).

CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA
Variabilidade genética: as populações podem ser agrupadas em 2 grupos:

Poço Bonito (grupo 1) e Antena e Estrada Real 1 e 2 (grupo 2).
As populações apresentaram uma porcentagem de endogamia, com

pequena taxa de autofecundação e com uma alta taxa de cruzamento,
sugerindo um sistema de reprodução misto, com tendência a alogamia.
A maior variabilidade genética ocorre dentro das populações, enquanto

que 9,43% de diversidade entre as populações, sendo considerada uma
divergência intermediária.

CONCLUSÃO
Populações nativas: perfil químico dos óleos essenciais divide-se em 2

grupos
-Grupo 1: populações Estrada Real, Estrada Real 1 e Poço Bonito, principal

constituinte o trans-cinamato de metila.
-Grupo 2: população Antena, principal substância o cedr-8(15)-en-9-alfa-ol .
A população de Antena cultivada em Botucatu apresentou divergência na

composição química em relação a região de origem .
Houve influência da época de colheita na proporção relativa dos

componentes mais abundantes no óleo essencial das populações cultivadas.

AGRADECIMENTOS
Comissão Organizadora do XVI MET
Dra. Vera Quecini – Embrapa Uva e Vinho
Dra Maria Imaculada Zucchi - APTA Polo Regional Centro Sul

Dr. Carlos A. Colombo - IAC
Dra. Lenita Lima Haber –IAC
Dra. Roselaine Facanali – IAC
Maria A. R. Vieira –IAC/FCA-UNESP
Mônica Tiho Chisaki –IAC/FCA-UNESP


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Difosfato de farnesila * trans-cariofileno

(*) Terpeno Sintase 23 (TPS23): expressão desta enzima é controladaVARASSIN

Conclusão: trans-cariofileno pode atrair os inimigos naturais dos herbívoros (

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...Polen, nectar, resinas.

VARASSIN et al, 2000

HENTRICH et al, 2007

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Passifloras Mamangaba VARASSIN et al,

Benzoato de Orquideas Borboletas Huber et al,

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gengibre Gingerol Shogaol

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Objetivo: Avaliar a atividade do (-) bisabolol, principal

*agente etiológico da leishmaniose nos países da bacia mediterrânica

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O agente patogênico da leishmaniose na Península Ibérica é

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Teste da pureza do (-)α-bisabolol

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(-)α-bisabolol foi diluído em 1% dimetilsulfóxido (DMSO),

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Contaminam grande variedade de alimentos,principalmente o amendoim, nozes,

A contaminação de grãos com micotoxinas e fungos toxigênicos, pode ocasionar,

Prof. Dra. Marcia Ortiz Mayo Marques

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Avaliar o potencial do óleo essencial de folhas e flores de

Avaliar a composição química do óleo essencial das folhas e

Fracionar o óleo essencial para obtenção do princípio ativo

Avaliar possíveis alterações na ultra-estrutura celular do fungo.

Prof. Dra. Marcia Ortiz Mayo Marques

Óleo essencial das folhas e flores : hidrodestilação

Concentrações de óleo essencial : 30 μg/mL; 20 μg/mL; 10

Microscopia eletrônica: avaliação da atividade dos óleos

Frações foram purificadas por : CCDP

Identificação das substâncias: EM

Prof. Dra. Marcia Ortiz Mayo Marques

Prof. Dra. Marcia Ortiz Mayo Marques

Composição química: principais componentes foram o precoceno II

Precoceno II é o composto ativo do óleo essencial.

Atividade: Inibiram significativamente o crescimento do fungo m

As concentrações (58 a 49%) inibiram a produção da aflatoxina B1

Observada alterações ultraestruturais dependente da concentração

Prof. Dra. Marcia Ortiz Mayo Marques

• Brasil – maior mercado de agrotóxicos no mundo;

•Mercado Pessoal, Perfumaria e Cosméticos * :

•Aromas: crescimento de cerca de 5% ao ano,

* ABIHPEC; 2011 Euromonitor International

Prof. Dra. Marcia Ortiz Mayo Marques

Óleos Essenciais Extratos Vegetais

• Caracterização Química • Domesticação

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Objetivo : avanço do conhecimento

• variabilidade química e genética;

•agregar valor as espécies;