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UNIVERSIDAD DE VIGO Departamento de Química Analítica y Alimentaria Área de Nutrición y Bromatología Compuestos

UNIVERSIDAD DE VIGO

UNIVERSIDAD DE VIGO Departamento de Química Analítica y Alimentaria Área de Nutrición y Bromatología Compuestos

Departamento de Química Analítica y Alimentaria

Área de Nutrición y Bromatología

Compuestos orgánicos en muestras de pelo obtenidas de jabalí común (Sus scorfa): Biocentinelas de la contaminación ambiental

Luis Guillermo Fresco Dorrio

Grado en Ciencias Ambientales

Trabajo Fin de Grado

Ourense, Enero de 2017

Doña Elena Martínez Carballo, profesora titular del área de Nutrición y Bromatología y Doña Xiana
Doña Elena Martínez Carballo, profesora titular del área de Nutrición y Bromatología y Doña Xiana

Doña Elena Martínez Carballo, profesora titular del área de Nutrición y Bromatología y Doña Xiana González Gómez, investigadora predoctoral en el área de Nutrición y Bromatología de la Facultad de Ciencias de Ourense de la Universidad de Vigo.

AUTORIZAN

A Luis Guillermo Fresco Dorrio a presentar el trabajo titulado Compuestos orgánicos

en muestras de pelo obtenidas de jabalí común ( Sus scorfa ): Biocentinelas de la contaminación ambiental”, realizada bajo nuestra dirección en el laboratorio del área de Nutrición y Bromatología de la Facultad de Ciencias de Ourense, puesto que presenta los requisitos exigidos para optar al título de Graduado en Ciencias Ambientales.

Y para que así conste, se expide la presente autorización en Ourense, a 10 de enero de

2017.

Fdo: Elena Martínez Carballo

Fdo: Xiana González Gómez

AGRADECIMIENTOS

Primeramente quiero dar las gracias a la universidad de Vigo y al departamento de Nutrición y Bromatología de la Facultad de Ciencias de Ourense por brindarme la oportunidad de trabajar con ellos y permitirme realizar un proyecto fascinante como este. Especialmente a Xiana y Elena pues sin su ayuda esto no sería posible. También a mis compañeras de laboratorio que amenizaron las largas esperas ante el turbovap.

Gracias a mis amigos y familia, cuya curiosidad sobre el tema no para de despertar más la mía y que en todo momento fueron un gran apoyo.

Gracias también a mi madre por hacer lo necesario de que no me falte de nada y ayudar en todo lo que puede.

Y por último gracias a Miner que se pasó más de un año aguantando mis largas charlas sobre el tema siempre con una sonrisa en la cara y apouandome en todo momento.

Índice

Índice de tablas y figuras

I

I. Introducción

3

1.

Caracterización de los contaminantes organicos

3

a) Propiedades físico-químicas

4

b) COP en el Convenio de Estocolmo

10

c)

Otros CO

11

2.

Toxicidad

13

 

a)

Toxicocinética

13

 

a. Abosrción

13

b. Distribución

13

c. Metabolismo

14

d. Excreción

14

 

b)

Efectos en los seres vivos

14

 

3. Legislación

17

4. Biomonitorización

18

 

a)

Matrices invasivas

19

b)

Matrices no invasivas

20

c)

Pelo como matriz no invasiva

20

d)

Jabalí común (Sus scorfa)

22

II. Justificación y Objetivos

27

III. Parte experimental

31

 

1.

Toma de muestras

31

2.

Material e instrumentos

34

3.

Reactivos y disolventes

37

4.

Preparación de las disoluciones patrón

38

5.

Protocolo analítico

40

IV. Resultados y discusión

49

 

1.

Características de las muestras seleccionadas

49

2.

Método analítico para la determinación de OP en jabalí

50

a)

Detección

50

b)

Extracción, concentración y purificación

52

3.

Validación del método

54

4.

Determinación de OP seleccionados en muestras de pelo de jabalí

59

V. Conclusiones

69

Referencias bibliográficas

73

Índice de tablas y figuras

Tablas:

Tabla 1: Propiedades físicas y químicas

8

Tabla 2: Compuestos y año de inclusión del convenio de

10

Tabla 3: TEF según la OMS

I6

Tabla 4: Datos de muestras recogidas

31

Tabla 5: Condiciones analíticas e instrumentales utilizadas en la determinación de contaminantes orgánicos mediante

35

Tabla 6: Condiciones analíticas e instrumentales utilizadas en la determinación de contaminantes orgánicos mediante

36

Tabla 7: Patrones utilizados

38

Tabla 8: Parámetros del método GC-MS/MS de los contaminantes orgánicos objetivo

43

Tabla 9. Parámetros del método LC-MS/MS de los contaminantes orgánicos

44

Tabla 10. Características epidemiológicas de los animales

49

Tabla 11. Métodos de extracción y limpieza evaluados en pelo de

53

Tabla 12. Pendiente de las rectas de calibrado obtenidas para la cuantificación de los OP mediante

calibración por patrón interno (PCB 30 y PBDE 166) exceptuando la familia de los OPE que se realizó por

calibración

54

Tabla 13. Porcentajes de R y RSD, así como límites de detección (LOD) y cuantificación (LOQ) expresados en

ng/g pelo

56

Tabla 14. Porcentajes de R y RSD para los patrones surrogados.……………………………………………………………

58

Tabla 15. Contribución de los principales congéneres para DL-PCB, NDL-PCB, OCP, OP, OPE, BFR y PAH

59

I

Figuras:

Figura

1: Esquema de Bioconcentración

5

Figura 2: Esquema sobre la Bioacumulación

6

Figura 3: Esquema sobre la biomagnificación

7

Figura 4: Efecto saltamontes

7

Figura 5: Anatomía del pelo

21

Figura 6: Distribución de "Sus scorfa"

22

Figura 7: Localización geográfica de las

32

Figura 8: Distribución estimada de los

33

Figura 9: Figura 9.1 Equipo LC-MS/MS. Dionex Ultimate 3000 HPLC Thermo Scientific. Figura 9.2 Equipo LC/MS-MS. TSQ Quantum™ Access MAX. Figura 9.3 Equipo GC-MS/MS. Agilent 7890B, Agilent 7000C ,7650A

 

36

Figura 10: Esquema del método analítico

42

Figura 11: Cromatogramas GC-MS/MS en modo MRM de: A- un patrón de 100 µg/L de todos los contaminantes estudiados. B- una muestra de pelo

51

Figura 12: Cromatogramas LC-MS/MS en modo SRM de: A-un patrón de 100 µg/L de todos los OPE. B- una muestra de

51

Figura 13: Diagrama de dispersión con las concentraciones totales de los OP encontrados en las 20 muestras

de

62

Figura 14: Gráfico resultante del análisis por componentes principales obtenido para los dos principales componentes y las muestras analizadas en el espacio resultante

62

Figura 15: Mapa donde muestra los riesgos relativos a padecer cáncer de estómago entre (2004-2008)

63

Figura 16: Distribución de los resultados obtenidos para el análisis de la varianza de dos vías teniendo en cuenta las variables sexo y lugar

65

II

I. Introducción

I. Introducción

I. Introducción.

Introducción

1. Caracterización de los contaminantes orgánicos (CO).

El libro de Rachel Carson “Primavera Silenciosa” (1962) fue una de las primeras denuncias al uso indiscriminado de sustancias químicas con consecuencias aún desconocidas durante los años 50 y su posible efecto sobre las poblaciones de aves. A partir de ahí se inició un movimiento social y ecológico de crítica y protesta que culminó con la creación de diversos instrumentos jurídicos mundiales como el Convenio de Estocolmo sobre Contaminantes Orgánicos Persistentes (Ghanta, S. y col. 2016).

Los contaminantes orgánicos persistentes (POP, del inglés Persistent Organic Pollutants) son químicos utilizados en su mayoría en compuestos industriales o agrarios que solo pueden surgir de forma natural en incendios y erupciones volcánicas de forma poco significativa. Su auge resultó tras la Segunda Guerra Mundial

a causa de la inmensa industrialización. Son sustancias de comprobado y eficaz efecto plaguicida y para su

aplicación contra vectores de enfermedades por lo que su uso fue intensivo, más tarde se descubrieron los daños que éstos causaban en el medio ambiente y la salud humana. Son daños de larga duración, extensión

y que afectan en gran medida a los seres vivos por sus propiedades poco biodegradables, la volatilidad de

algunos y su tendencia a la bioacumulación y biomagnificación. El proceso de acumulación sucede primordialmente en el tejido graso, lo que aumenta la concentración en animales adaptados a climas fríos por su mayor cantidad de grasa y a esto se suma el hecho de que los compuestos volátiles son transportados

como dicta el efecto saltamontes hacia latitudes altas y más frías donde éstos pierden capacidad de volatilización y se depositan definitivamente (Wania, F. y col. 1997).

Introducción

a) Propiedades físicas y químicas.

Persistencia en el medio ambiente. Es la capacidad que tienen algunos compuestos orgánicos de persistir ante procesos de degradación

fotolítica, biológica y/o química. Esto les permite mantenerse tanto en el ambiente como en seres

vivos durante una gran extensión temporal (Gómez, B. O. C. y col. 2014). Por lo tanto se entiende que

cuanto más tiempo esté presente en el medio, más persistente será.

Tiempo de vida media El tiempo de vida media o t½ es el tiempo necesario para que la concentración de una sustancia se

reduzca a la mitad de su valor original. Se suele utilizar como criterio para la persistencia de un

contaminante en el medio. (Klasmeier y col., 2006).

El t½ plantea varios problemas a la hora de aplicarlos debidos a la falta de información y metodología

para extrapolar correctamente los datos a la realidad puesto a que varía con la biodegradación,

fotodegradación y reacciones de hidrolisis que se llevan a cabo sobre la sustancia. (Sinkkonen y col.,

2000).

Presión de vapor.

La presión de vapor (P V ) está íntimamente relacionada con la volatilidad de la sustancia y depende de

la temperatura. Los compuestos orgánicos tienen una (P V ) que les confiere características semivolátiles

por lo que se desplazan fácilmente entre la atmósfera, suelos y aguas.

Coeficiente de reparto octanol/aire (K oa )

Se utiliza para determinar la movilidad de un contaminante entre fases orgánicas como material

lipídico y el ambiente (Xu, S. y col. 2014). Al igual que la presión de vapor es un parámetro muy utilizado

como descriptor de procesos de partición. Según el estudio de Radonic y col. en 2011, son

intercambiables salvo para desgribir procesos de partición gas/partículas en entornos urbanos e

industriales.

Se puede obtener mediante la siguiente fórmula:

K oa = C oct / C air

Donde:

C oct es la concentración de soluto en octanol.

C air es la concentración de soluto en aire.

Introducción

Coeficiente de adsorción de carbono orgánico (log Koc) Es la medida de la tendencia de un compuesto orgánico a ser absorbidos por los suelos y sedimentos.

Indica el grado de partición de los compuestos entre suelos o sedimentos y la fase acuosa del medio

ambiente describiendo la probabilidad que tiene la sustancia a filtrarse en el suelo o quedarse inmóvil

(Chu y col. 1996; Jonker y col. 2000).

Coeficiente de reparto octanol-agua Log (K ow )

Se utiliza para modelar el comportamiento de las membranas biológicas estudiando su hidrofobicidad

y lipofilicidad (Baena, Y. y col. 2004). Según un estudio realizado en 1996 por H.R. Rogers, el hecho de

que los contaminantes orgánicos presenten un K ow inferior a 4.0 es la razón de su alta acumulación en

suelos y fases orgánicas.

Bioconcentración. Proceso en el cual la concentración de un contaminante encontrado en un ser vivo supera la

concentración del mismo contaminante en el ecosistema habitado por el ser vivo analizado. Se puede

estimar según el K ow o se puede calcular el factor de bioconcentración (BCF) de la siguiente manera

(Daley, J. M. y cols. 2014)

BCF=Cb/Cw

Donde:

Cb es la concentración de contaminante en el organismo. Cw es la concentración del contaminante en el ambiente (normalmente agua).

Cw es la concentración del contaminante en el ambiente (normalmente agua). Figura 1: Esquema de Bioconcentración

Figura 1: Esquema de Bioconcentración

Cw es la concentración del contaminante en el ambiente (normalmente agua). Figura 1: Esquema de Bioconcentración

Introducción

Bioacumulación. Se produce por asimilación de un contaminante por un organismo mediante exposición directa o

consumo de un contaminante sin biotransformarlo. Esto lleva a una progresiva acumulación del

contaminante en el individuo puesto que la tasa de asimilación supera la de eliminación del

contaminante (Porta, M. y col. 2008).

Se puede calcular el factor de bioacumulación (BAF) de la siguiente manera (Maria, G. y cols. 2009)

BAF=Cb/Cw

Donde:

Cb es la concentración de contaminante en el organismo. Cw es la concentración del contaminante en el ambiente más la ingesta.

del contaminante en el ambiente más la ingesta. Figura 2: Esquema de bioacumulación Biomagnificación.

Figura 2: Esquema de bioacumulación

Biomagnificación. Consiste en el aumento de concentración de contaminante según se vaya ascendiendo en la cadena

trófica, pudiendo comprobarse tanto en peces, aves e incluso mamíferos como mismamente en el ser

humano (Porta, M. Puigdomènech, E. y col. 2008).

Se puede calcular el factor de biomagnificación (BMF) de la siguiente manera (Daley, J. M. y cols. 2014)

BMF=Cb/Cw

Donde:

Cb es la concentración de contaminante en el organismo. Cw es la concentración del contaminante en la dieta.

Introducción

Introducción Figura 3: Esquema sobre la biomagnificación Transporte. Por su carácter semivolatil muchos CO pueden

Figura 3: Esquema sobre la biomagnificación

Transporte. Por su carácter semivolatil muchos CO pueden presentarse en forma de vapor o adsorberse a

compuestos atmosféricos propagándose durante largas

distancias tanto por el aire, el agua o usando organismos

vivos.

tanto por el aire, el agua o usando organismos vivos. Figura Ilustración 4: Efecto 1: saltamontes

Figura Ilustración 4: Efecto 1: saltamontes Efecto saltamontes

En función de las temperaturas ambientales estos

compuestos pueden evaporarse y condensar en climas más

gélidos dando lugar al efecto saltamontes por el cual se

produce un transporte hacia latitudes más polares (Ramírez,

M. A. Y. 2003).

También se depositan y transportan en aguas superficiales y en sedimentos y suelos desde donde se

acumulan en organismos por ingestión, absorción o inhalación.

Introducción

Tabla 1: Estructuras, propiedades físico-químicas y toxicológicas de las principales OP (Fernández-Cruz y col.

2016)

 

*1 MW

*2

*4 log

*5 log

*6 s w

*7 LD50

COMPUESTOS

GRUPO

(g/m

ol)

(g/cm 3 )

*3 K oc

Kow

Koa

(mg/L)

(mg/kg

bw)

*8 IARC

ESTRUCTURA

Aldrín

Compuestos

365

1.6

7.67

6.50

2.61-

0.011

100-

3

Aldrín Compuestos 3 6 5 1 . 6 7 . 6 7 6 . 5 0
Aldrín Compuestos 3 6 5 1 . 6 7 . 6 7 6 . 5 0
Aldrín Compuestos 3 6 5 1 . 6 7 . 6 7 6 . 5 0

organoclorados

4.69

4500

Clordano

Compuestos

410

1.59-

3.49-

5.54

4.58-

0.056-

460

2B

organoclorados

1.63

4.64

5.57

1.85

DDT

Compuestos

354

0.98-

5.18-

6.79-

8.70-

0.025-

113-

2B

organoclorados

099

5.35

6.95

9.93

0.085

450

Dieldrín

Compuestos

381

1.75

6.67

6.2

4.08-

0.011

37-330

3

Dieldrín Compuestos 3 8 1 1 . 7 5 6 . 6 7 6 . 2
Dieldrín Compuestos 3 8 1 1 . 7 5 6 . 6 7 6 . 2
Dieldrín Compuestos 3 8 1 1 . 7 5 6 . 6 7 6 . 2

organoclorados

4.55

Endrín

Compuestos

4.53

 

381

1.64

 

5.45

-

0.200

7.6

3

 

organoclorados

2

Compuestos

Heptacloro

 

373

1.57

4.34

6.10

-

0.05

 

40-119

2B

organoclorados

 

0.0047

 
  0.0047  
  0.0047  
  0.0047  
 

Compuestos

285

2.044

6.08

5.73

2.56-

2600-

2B

HCB

 

-

 

organoclorados

4.54

0.0062

4000

Toxafeno

Compuestos

432

1.65

3-5

3.3-

3.18

0.55

49-112

2B

organoclorados

6.64

Mirex

Compuestos

3.76

5.28

 

0.60

 

600-

2B

 

546

-

-

 
 

organoclorados

3

>3000

Dibenzo-p-

219-

1.643-

 

4.52-

4.75-

0.278-

0.6-

PCDD

dioxinas

-

2.27E-

3

PCDD dioxinas - 2.27E- 3

policloradas

460

1.886

 

13.37

8.20

9

1157

Dibenzofuranos

154-

1.225-

3.66-

3.96-

1.93

0.6-

Dibenzofuranos 154- 1.225- 3.66- 3.96- 1 . 9 3 – 0.6-

PCDF

6.5-7.6

3

 

policlorados

202

1.271

4.58

4.88

0.77

1157

Bifenilos

292-

4.41-

6.04-

4.46-

0.175-

Bifenilos 292- 4 . 4 1 - 6.04- 4.46- 0.175-

PCBs

1.2024

 

0.0065

2-4.25

1

 

policlorados

395

6.9

7.21

8.18

 

6

 

3.38-

Clordecona

Compuestos

126-

 

491

-

3.41

4.50

6.69

3.0

 

2B

 

organoclorados

 

410

   

5

9 1 - 3.41 4.50 6.69 3.0   2 B   organoclorados   410    

-HCH

-HCH

Lindano

Pentaclorobenzeno

PBB

PBDE

PFOS

Perfluorooctanoico y sales)

(SULFATO

PFOA

Perfluorooctanoico y sales)

(ACIDO

PFOS-F

sulfonyl fluorado)

(Perfluorooctano

Endosulfán

Hexabromocyclododecano

Hexaclorobutadieno

Pentaclorofenol y sus sales y esters

Compuestos

organoclorados

Compuestos

organoclorados

Compuestos

organoclorados

Compuestos

organoclorados

Retardantes

llama bromados

Retardantes

llama bromados

de

de

Productos

químicos

Perfluorinados

(PFCs)

Productos

químicos

Perfluorinados

(PFCs)

Productos

químicos

Perfluorinados

(PFCs)

Compuestos

organoclorados

Retardantes

llama bromados

de

Alifáticos

Halogenados

Policlorofenoles

291

291

291

250

627-

943

564-

959

538

414

502

407

342

261

266

1.87

1.89

1,89

1,834

-

-

-

-

1,824

1,745

2,24

1,55

1,978

3.57

3.8

Introducción

7.46

10-69

3.57

3.78

8.74

5

3,0-

3,57

3,72

-

17

4,24-

4,77

5,17

-

0,551-

0,562

3,33-

5,08

8 9,1

5,53- 0,003-

-

0,03

4,89-

6,80

6,285

-6,64

-

<0,001

0,0133

2,57

-

-

550-

570

2,06

-

4,03-

4,13

-

-

7,84

3,62-

3,83

5,62

-

-

9,5E3

1,41E-

4

- 0,53

-

6,6E-2

3,67

4,5

4,78

5,01

6,88

-

2-2,55

14

100

100

88

250

15000-

21500

5800-

7400

160-

370

430-

680

-

86,6

>10

270

50

2B

2B

-

-

2A

-

2B

2B

2B

-

-

3

2B

100 88 250 15000- 21500 5800- 7400 160- 370 4 3 0 - 680 - 86,6
100 88 250 15000- 21500 5800- 7400 160- 370 4 3 0 - 680 - 86,6
100 88 250 15000- 21500 5800- 7400 160- 370 4 3 0 - 680 - 86,6
100 88 250 15000- 21500 5800- 7400 160- 370 4 3 0 - 680 - 86,6
100 88 250 15000- 21500 5800- 7400 160- 370 4 3 0 - 680 - 86,6
100 88 250 15000- 21500 5800- 7400 160- 370 4 3 0 - 680 - 86,6
100 88 250 15000- 21500 5800- 7400 160- 370 4 3 0 - 680 - 86,6
 

Hidrocarburo

Naftalenos Policlorinados

aromático

162-

policiclico clorado

404

Hidrocarburo

PAH

aromático

152-

policiclico

275

PYRE

Pretroides

302-

 

665

 

Pesticidas

263

OP

organofosfatados

351

esters

266-

OPE

organofosfatados

431

CARB

carbamato

360

NEO

Neonicotinoides

256

-

1,225

1,282

1,01-

1,70

1,358

1,389

0,976

1,48

1,527

1,54

-

1,40

6,52

-

2,7

3,73

-

2,45

-

3,9

8,3

4,07-

6,84

4,8-

7,6

2,86

4,82

4

3,65

3,806

-

0,66

1,26

Introducción

1,36E7

4,19E1

0

-

-

-

-

-

-

0,28E-

28,0E-

7

3,93-

5E-4

4,6

0,08

0,050

0,7

0,287

0,145

0,58

>3-

1540

232-

>430

18-500

3-1500

1400

8400

9,7-

34,3

424-

475

-

1-3

3

2A-2B

2A-3

3

-

, 7 - 34,3 4 2 4 - 475 - 1 - 3 3 2A-2B 2
, 7 - 34,3 4 2 4 - 475 - 1 - 3 3 2A-2B 2
, 7 - 34,3 4 2 4 - 475 - 1 - 3 3 2A-2B 2
, 7 - 34,3 4 2 4 - 475 - 1 - 3 3 2A-2B 2
, 7 - 34,3 4 2 4 - 475 - 1 - 3 3 2A-2B 2

*1 MW (g/mol): Peso molecular del compuesto.*2 : Densidad en g/cm 3 .*3 Koc: Coeficientes de partición del carbono orgánico.*4 Log (K ow ):

Coeficiente de reparto octanol- agua.*5 Log (K OA ): Coeficiente de reparto octanol-aire.*6 S w : Solubilidad en agua Mg/L.*7 LD 50(Mg/Kg BW): Dosis letal 50.*8 IARC: Agencia internacional de la investigación sobre el cáncer. *9 P v : Presión de vapor

b) COP en el Convenio de Estocolmo

El anexo D del convenio de Estocolmo especifica los requerimientos que un contaminante orgánico tiene que

tener para ser incluido. Éstos especifican persistencia, capacidad de bioacumulación, capacidad de transporte

a larga distancia y efectos sobre la salud.

En el convenio figuran 26 COP prioritarios producidos de manera intencionada o no intencionada, lo que

obliga a más de un centenar de países firmantes a prohibir o reducir según el caso su proliferación.

En la siguiente tabla se muestra que compuestos fueron incluidos y en qué año.

Tabla 2: Compuestos y año de inclusión del convenio de Estocolmo.

Año

Numero

Compuestos

2004

12

PCBs, Dioxinas, Furanos y varios plaguicidas organoclorados.

2009

9

Plaguicidas clorados, Hexabromobifenilo y polibromados difenilos

2011

1

Endosulfan

2013

1

Hexabromociclodecano (HBCD)

2015

3

Hexaclorobutadieno, naftalenos policlorados y pentaclorofenol con sales y esteres.

c) Otros CO

Introducción

Existen otros contaminantes orgánicos que por sus características, sus parámetros o porque sus efectos nocivos aún no han sido bien establecidos, no forman parte del Convenio de Estocolmo. Aun así merecen una mención especial por los posibles efectos negativos sobre la salud humana y animal:

Hidrocarburos aromáticos poli cíclicos (PAH) Los PAHs son un grupo de cientos de compuestos orgánicos que suelen ser complejos. Normalmente de procedencia natural debido a una mala combustión de madera en incendios aunque también pueden proceder de un origen antrópico como en la quema de carbono, polución producida por cigarrillos, vehículos a motor, las actividades industriales siderúrgicas que producen aluminio, hierro y acero incluyendo en estas las refinerías. La IARC declara algunos de los PAH como carcinogénicos y una exposición continua y prolongada puede causar problemas respiratorios, reproductivos o del desarrollo (Bull, S. y cols. 2013).

Piretrinas y piretroides La piretrina tiene una alta capacidad insecticida caracterizada por su rápido efecto especialmente en insectos voladores. Son neurotóxicos y funcionan bloqueando los canales de sodio en los axones causando en insectos derribo, convulsiones y muerte. Son moderadamente tóxicos para mamíferos con una LD 50 de 350 a 500 mg/kg en su forma natural y con una LD 50 de 1500 mg/kg en piretroides sintéticos comerciales. Su persistencia se ve delimitada por la fragilidad del compuesto frente a radiación UV por lo que no es considerado un POP (Pérez López, E. 2012).

Pesticidas organofosforados (OPP) Son los insecticidas más utilizados actualmente. De proveniencia sintética y tienen efecto neurotóxico. Actúan inhibiendo la enzima acetilcolinesterasa sobre las sinapsis hística depositando un grupo fosforil en su centro de actividad permitiendo la acumulación de ACh y sobreestimulando los receptores colinérgicos (Ramírez, J. A. & Lacasaña, M. 2001). Por lo tanto una larga exposición a estos pesticidas o una ingestión en grandes cantidades puede ser dañino o incluso letal para animales y personas.

Introducción

Retardantes de llama organofosforados (OPE)

Se emplearon ampliamente tras la prohibición de los halogenados retardantes de llama o como

plastificantes, fluidos hidráulicos o resinas, sin embargo posteriores investigaciones relatan

que pueden ser nocivos para los seres vivos y el medio ambiente.

Los organofosforados no son resistentes a la luz solar por lo que se van degradando, no se

consideran persistentes ni bioacumulativos pero si se acumula en sedimentos. Se consideran

potencialmente canrcinogénicos y algunos son disruptores endocrinos y tóxicos para la

reproducción (Moral, M. P. M. 2015).

Carbamatos

Los carbamatos son insecticidas sintéticos derivados de orgánicos. Como los organofosforados

actúan inhibiendo la acetilcolinesterasa pero en este caso de forma reversible lo que reduce

su toxicidad y tiempo de actuación. En dosis pequeñas algunos de los más utilizados en España

como lo es el metomilo causan irritaciones cutáneas y mucosas, en cambio en grandes

cantidades afecta el sistema nervioso periférico de múltiples maneras y puede causar fallo

renal llevando así a la muerte, normalmente esto sucede en humanos por ingestión

intencionada (Suárez Solá, M. L. y col. 2004).

Rodenticidas anticoagulantes

Actúa interrumpiendo el ciclo de la vitamina k, un compuesto determinante para los factores

de coagulación y formación de protrombina. Este método es de acción multiple, por lo que

debe ser ingerido varias veces por los animales para causar un efecto anticoagulante letal

(Fuentes Sierra, E. 2007).

Fenil-Pirazoles

Sirvieron como forma de sustituir a otros insecticidas como los organofosforados o

carbamatos. Actúan como insecticidas y acaricidas, estudiándose su uso en garrapatas,

bloqueando los canales de cloro en las membranas celulares dentro del sistema nervioso

central. Su uso extendido plantea dudas sobre efectos de larga duración en la vida animal

(Chaguri, J. y col. 2016).

Neonicotinoides Se sintetizaron originalmente a partir de nicotina natural en 1990. Poseen la misma composición estructural esencial de la nicotina además de tener su mismo mecanismo de acción neurotóxica con la diferencia de actuar más sobre insectos y menos sobre mamíferos.

Introducción

Una característica importante es el excelente movimiento sistémico dentro de las plantas, lo

que hace que sean un peligro considerable para los polinizadores al entrar en contacto con

néctar y polen contaminados (Kahl, M. 2015).

2. Toxicidad

a) Toxicocinética

El campo de la toxicología aumentó debido a la preocupación que generaban los efectos adversos de los

contaminantes en los seres humanos. Se le prestó entonces una atención gradual a animales domésticos y

silvestres (Mulvey y col. 2003).

Para abordar satisfactoriamente el análisis de la exposición de contaminantes orgánicos debemos tener en

cuenta el metabolismo de dicho contaminante.

Absorción

En mamíferos hay tres rutas de absorción principales.

Vía respiratoria

Vía dérmica

Vía Gastrointestinal

Recientes investigaciones muestran que la inhalación el contacto dérmico y la ingestión de polvo

pueden ser una vía de exposición importante para CO de bajo peso molecular (Eljarrat y col. 2014). La

tasa de absorción a través de la vía gastrointestinal depende en gran parte de la composición y

características químicas del contaminante ingerido por lo que los CO más lipofilicós tienen una

absorción muy alta a no ser que su K ow sea muy alto, en este caso las tasas disminuyen de un 90 a un

50% de absorción impidiéndoles cruzar películas lipofílicas y acuosas durante el proceso de absorción

(O'Sullivan y col. 2013).

Distribución

Los OPs se distribuyen a través del cuerpo de forma diferente y dependiendo de la ruta y forma de

administración, el tiempo de muestreo de los tejidos después del tratamiento y la actuación de

inductores o inhibidores del metabolismo. Se distribuyen principalmente en zonas de alto contenido

lipídico, especialmente en riñones, hígado, y la grasa corporal (O'Sullivan y col. 2013; Vizcaino y col.

2014.)

Introducción

Metabolismo

Durante el proceso metabólico se trata de aumentar la polaridad de los OP y así una vez obtenidas sustancias hidrófilas acelerar la excreción lo que o se desintoxican o se activan (Bauer y col., 1995; Pelkonen y col. 1982; Shou y col. 1994).

El metabolismo de los xenobióticos lipofílicos se puede dividir en dos fases.

Fase I:

Biotransformación. Durante este proceso normalmente se incluyen transformaciones como oxidación, hidroxilación o reducciones. En estas se introduce un grupo funcional polarizando la molécula y permitiendo una posterior conjugación o interacción con macromoléculas para una fácil excreción. En este proceso intervienen un grupo de enzimas fundamentalmente hepáticas pertenecientes al grupo citocromo P450 llamadas “Mixes Function Oxidasas”. Fase II:

Conjugación. Consiste en polarizar incluso más los xenobióticos lipofílicos añadiendo ácido sulfúrico o glucurónido al grupo funcional ya presente en la molécula o adquirido durante la biotransformación. Este proceso se realiza mediante los grupos de enzimas hepáticas glucatión-S-transferasa o la sulfotransferasa. Por lo tanto se facilita la excreción (Hofvander, L. y col. 2006; Yebra-Pimentel I., y col. 2015).

Excreción

Es la fase final de la eliminación de los OP. Mayoritariamente se excretan por orina, bilis o heces pero también puede darse en otros fluidos corporales como sudor, semen, saliva, leche o lágrimas (Grova, N.y col., 2002). Dada la alta persistencia de estos contaminantes la excreción apenas de su consumo aun que sí de la carga corporal del individuo (Fernández-González, R., y col. 2015). Se elimina de manera muy lenta pudiendo tardar desde meses hasta décadas.

b) Posibles efectos en los seres vivos

Los POP causan daños en la salud animal, humana y en el medio ambiente. Algunos efectos que se relacionan con los POP son daños del sistema nervioso central, del endocrino, del reproductivo y malformaciones fetales, trastornos de comportamiento, diabetes, problemas durante la lactancia y carcinogénesis (Gómez, B. O. C. y col. 2014). Hay datos que asocian ciertos umbrales de contaminantes a algunas enfermedades. Normalmente para determinar la toxicidad de ciertos contaminantes se valora la cantidad de exposición y el tiempo durante el cual el individuo estuvo expuesto.

Introducción

Dada la variedad de compuestos y la cronicidad de los mismos, suele ser difícil encontrar el compuesto causante de los síntomas, cuando además de eso los efectos pueden darse a relativamente bajas concentraciones e incluso tras varias generaciones después de la exposición de un individuo. Gracias a la gran cantidad de esfuerzos científicos que se implican en este campo, el reconocimiento del compuesto causante de los daños mejoró considerablemente.

Los efectos nocivos de los OP dependen de la concentración de éstos por lo que muchos organismos gubernamentales decidieron crear listas de agentes tóxicos permitiendo la comparativa entre ellas. Una de ellas es la Agencia Internacional de Investigación sobre el Cáncer (IARC). La IARC creo 4 grupos de toxicidad según sus efectos cancerígenos. Grupo 1 con 117 agentes y que es cancerígeno para humanos, grupo 2A con 74 agentes que probablemente son cancerígenos para seres humanos, 2B que tiene 287 agentes posiblemente carcinogénicos y grupo 3 con 503 agentes que no son clasificables en las otras categorías. Además clasificó como sustancia más carcinogénica para humanos el 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-pdioxina (2,3,7,8-TCDD). Esta clasificación sirvió para establecer un número de equivalencia tóxica (TEF en sus siglas en inglés). El TEF atribuye a cada compuesto una equivalencia respecto al el 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-pdioxina (2,3,7,8-TCDD). Solo se refiere a efectos adversos causados por los receptores celulares y varía según el animal en cuestión. Esta equivalencia fue desarrollada por Comité de la Organización del Tratado del Atlántico Norte sobre los Retos de la Sociedad Moderna (OTAN / CCMS 1988) y adoptada por los países que la firmaban hasta que fue revisada en 1997 por la OMS y se volvió a evaluar por la misma en 2005.

Tabla 3: TEF según la OMS

Introducción

OMS 1998

OMS 2005

 

OMS 1998

OMS 2005

Dibenzo -p-dioxinas cloradas

Dibenzofuranos clorados

2,3,7,8-TCDD

1

1

2,3,7,8-TCDF

0,1

0,1

1,2,3,7,8-PeCDD

1

1

1,2,3,7,8-PeCDF

0,05

0,03

1,2,3,4,7,8-HxCDD

0,1

0,1

2,3,4,7,8-PeCDF

0,5

0,3

1,2,3,6,7,8-HxCDD

0,1

0,1

1,2,3,4,7,8-HxCDF

0,1

0,1

1,2,3,7,8,9-HxCDD

0,1

0,1

1,2,3,6,7,8-HxCDF

0,1

0,1

1,2,3,4,6,7,8-HpCDD

0,01

0,01

1,2,3,7,8,9-HxCDF

0,1

0,1

OCDD

0,0001

0,0003

2,3,4,6,7,8-HxCDF

0,1

0,1

PCBs mono-orto sustituidos

1,2,3,4,6,7,8-HpCDF

0,1

0,1

PCB 105

0,0001

0,00003

2,3,4,6,7,8-HxCDF

0,01

0,01

PCB 114

0,0005

0,00003

1,2,3,4,7,8,9-hPCDF

0,01

0,01

PCB 118

0,0001

0,00003

OCDF

0,0001

0,0003

PCB 123

0,0001

0,00003

PCBs no-orto sustituidos

 

PCB 156

0,0005

0,00003

PCB 77

0,0001

0,0001

PCB 157

0,0005

0,00003

PCB 81

0,0001

0,0003

PCB 167

0,00001

0,00003

PCB 126

0,1

0,1

PCB 189

0,0001

0,00003

PCB 169

0,01

0,03

Existen también numerosos experimentos de laboratorio con roedores que tras la exposición de

contaminantes ambientales muestran cierto grado de inmunotoxicidad (Luebke y col. 2012; Vos y col. 1989).

Ésta es evaluable a través de tres amplias categorías que son:

Histopatología de los tejidos linfoides

Cambios en la función inmune y variación de características de células leucocitarias.

Cambios en la resistencia frente a patógenos.

Otro experimento sobre los efectos de los OP en animales hecho por Sonne y col. (2006) documenta y

demuestra como la alimentación de perros de trineo con carne contaminada deteriora el sistema inmune de

los individuos con respecto al grupo control.

De la misma manera los resultados de Bernhoft y col. (2000) y Lie y col. (2004, 2005) sugirieron que la

inmunoglobulina G, la inmunidad humoral y la celular pueden ser afectados por contaminantes

organoclorados.

3. Legislación

Internacional

Introducción

Desde 1972, cuando se legisló el convenio de Londres sobre la Prevención de la contaminación del mar por vertido de deshechos y otras materias, se fueron creando gradualmente nuevas normativas que influían indirectamente en los contaminantes orgánicos persistentes.

En 2001 se abordó este tema directamente mediante el Convenio de Estocolmo sobre Contaminantes Orgánicos Persistentes del PNUMA. La Finalidad de este convenio es la de proteger la salud humana y el medio ambiente de los peligros que entrañan los CO. Para ellos establece medidas como:

Eliminar de ser posible la liberación de POP al medio ambiente.

Fomentar el tránsito a alternativas más seguras.

Determinar y gestionar los residuos que contienen POP.

Promover el intercambio de información, sensibilización y educación al respecto.

Europea

En el ámbito europeo tenemos entre otras la normativa REACH las de residuos y de especial importancia el Reglamento (CE) Nº 850/2004. Este último tiene un propósito similar al Convenio de Estocolmo pero amplía el número de sustancias y aplica medidas de control más estrictas, entre ellas:

Prohíbe la producción, uso y comercialización de todas las sustancias incluidas.

Consideración como residuos de las existencias de POP prohibidos.

Obligatoriedad de notificación en caso de producir o usar POP aun permitidos.

Indexación y monitorización de los compuestos emitidos o vertidos por parte de las empresas.

Asistencia técnica a países con economías de transición.

4. Biomonitorización

Introducción

Actualmente incluso los ecosistemas más alejados de toda actividad antrópica poseen trazas de actividad humana, esto se debe a nuestra inmensa producción de contaminantes, nuestra falta de control sobre ellos y la alta movilidad que estos presentan dispersándose por corrientes de aire, marinas y a través de vectores como seres vivos entre otros (Ramírez, M. A. Y. 2003). La responsabilidad sobre la emisión de contaminantes suele ser evadida y la peligrosidad de éstos ignorada por grandes emisores lo que lo hace aún más peligroso para el medio ambiente y la salud pública. En consecuencia se da la existencia de metodologías para poder ejercer cierta monitorización del estado ecológico por lo que aparece el concepto de ecotoxicología. Esta rama de la toxicología evalúa mediante cuantificación o valoración la concentración de contaminantes químicos en el medio ambiente. La ecotoxicología necesita de una herramienta para poder incluir variables como la biotransformación, biodisponibilidad de la sustancia, especiación xenobiótica entre otros, esta se encontró en la biomonitorización, un proceso basado en la observación cualitativa y cuantitativa de los efectos que causan los agentes químicos en los seres vivos permitiendo una evaluación durante el tiempo de ciertos organismos llegando a permitir la predicción de futuros resultados basándose en tendencias y biorritmos. En resumen la biomonitorización es la herramienta básica y principal que permite programas de control y gestión ambiental efectivos (Hermoso de Mendoza García, M. y col. 2008).

Requisitos de un bioindicador

Hay algunas condiciones por las que se evalúa la aptitud de un bioindicador, es casi imposible cumplirlas todas por lo que buscamos que cumplan la mayor cantidad posible de los siguientes requisitos:

Representatividad espacial. Las especies analizadas deben habitar una extensión geográfica lo suficientemente amplia como para permitir comparaciones a gran escala.

Disponibilidad y accesibilidad de especímenes. Debe haber una cantidad y accesibilidad suficiente de especímenes como para poder tomar adecuadamente muestras para su posterior análisis en el laboratorio.

Representatividad ecológica. Debe poder relacionarse la cantidad de contaminante presente en el animal con la cantidad de contaminante presente en la cadena trófica.

Introducción

Sensibilidad. La población debe sobrevivir ante los contaminantes incluyendo la bioacumulación de los mismos pero aun así mostrar reacciones metabólicas a los mismos.

Longevidad. Una mayor esperanza de vida amplia el espectro temporal del análisis pudiendo comprobar con ello efectos a largo plazo.

Reproducibilidad de la recogida de individuos y muestras. Debe haber un procedimiento estandarizado para la recolección de muestras permitiendo una reproducibilidad del experimento en el laboratorio.

Para evaluar los potenciales efectos adversos, los niveles de contaminantes orgánicos se han monitorizado en distintos tipos de matriz biológica (Hermoso de Mendoza García M. y col. 2008).

a) Muestras invasivas y destructivas.

Las muestras invasivas implican la captura del animal y la extracción de sangre u biopsias dejando con vida al animal pero sometiéndolo a cierto nivel de estrés y asumiendo el riesgo de dañarlos al obtener la muestra. Tiene la ventaja de ser más riguroso en cuanto al procedimiento del contaminante pues se diferencia bien si es por ingestión u otros mecanismos de absorción o deposición. En cambio las muestras destructivas consisten en el uso como matriz de órganos internos del animal dando fin a su vida. Son técnicas con regularización legal que en caso de animales salvajes se tiende a hacer solo en caso de animales que hayan muerto de forma natural. Desde el punto de vista ecológico prima la supervivencia de una población frente a la del individuo y en el caso de especies en peligro de extinción la realización de muestras destructivas ya ha causado un daño severo en ciertas poblaciones. La disposición de órganos completos permite una obtención de resultados muy exactos y fiables pudiendo hacer seguimiento de los contaminantes y comparaciones entre órganos. Puesto a su metodología cruenta, la escasez de individuos en algunos casos y los efectos que puede tener en una población es un método a evitar salvo que sea la única opción posible.

b) Muestras no invasivas.

Introducción

Las muestras no invasivas ni destructivas destacan por su obtención no dañina al individuo y no solo se consideran más éticas por asignarle valor a la vida de un individuo sino que evitan efectos nocivos sobre las poblaciones por desaparición de individuos superando el número límite para la supervivencia de la población. EL uso de muestras no invasivas es de gran utilidad sobretodo en el estudio de poblaciones salvajes amenazadas o en peligro de extinción, puesto que permite obtener muestras sin necesidad de perturbar, o incluso observar, a los individuos (Nardelli, M. y col. 2011).

c) Pelo como matriz no invasiva.

El pelo es una característica de los mamíferos. Tiene varios cometidos como la protección del individuo de diferentes maneras. Proporciona una barrera física, microbiana, química y ayuda al camuflaje y a la señalización entre animales. Dada la creciente sensibilidad en los métodos analíticos el cabello es una matriz cada vez más utilizada dando lugar al aprovechamiento de las ventajas del pelo para la biomonitorización siendo éstas la facilidad de obtención de la muestra, su carácter no invasivo, su estabilidad y la capacidad de almacenar datos con un amplio marco temporal entre otras. (Foster, 2008; Mangelsdorf y col. 2014). El pelo también presenta desventajas como la dificultad para diferenciar entre contaminación externa e interna y la falta de armonización entre los métodos analíticos puesto que son métodos muy variables además de ser bastante recientes.

Anatomía El pelo nace en los folículos pilosos, unas estructuras en forma de vaina localizadas en la piel. En la base de cada folículo se encuentra la papila dérmica, la estructura rica en sangre responsable del crecimiento del pelo, melanocitos y queranocitos forran las paredes del folículo inferior, éstas se reproducen y mueren dando lugar al crecimiento del pelo. Los folículos alojan glándulas sebáceas, que son las encargadas de producir sebo para la hidratación de la piel. (Evans y De Lahunta. 2013)

Introducción

Introducción Figura 5: Anatomía del pelo Composición El pelo está compuesto por un 88% de proteína,

Figura 5: Anatomía del pelo

Composición El pelo está compuesto por un 88% de proteína, 3.5-4 % de lípidos, y agua. Debido a su contenido en lípidos, el pelo es adecuado para el control de compuestos lipofílicos. Cada folículo piloso está rodeado por un sistema de vasos sanguíneos en la raíz, que garantiza el intercambio continuo entre la raíz del pelo y el resto del organismo (Covaci y col. 2001).

De esta manera, los compuestos químicos presentes en sangre pueden encontrarse en el cabello también.

Introducción

d) Jabalí común o euroasiático (Sus scrofa).

El jabalí (Sus scrofa) pertenece a la familia Suidae que a su vez se integra en el orden Artiodactyla, y según la

Unión Mundial para la Conservación (UICN) se le reconocen 17 subespecies de los cuales la más abundante

en extensión y cantidad es S. s. scrofa por lo que será el tratado en este trabajo

(Rossel, C. y col. 2001).

Distribución Tiene el área de distribución más amplia dentro de su familia históricamente incluyendo Europa, Asia

y el norte de África, actualmente también está presente en el continente americano, además de ser la

especie más abundante de la misma.

americano, además de ser la especie más abundante de la misma. Figura 6: Distribución de "Sus

Figura 6: Distribución de "Sus scorfa"

Introducción

Morfología

El adulto alcanza la altura máxima en la región de las extremidades delanteras las cuales finalizan en

cuatro dedos escudados por pezuñas. Un cuello apenas apreciable, orejas pequeñas y erguidas.

El tamaño varía dependiendo de la altitud y los alimentos disponibles pero pueden llegar a superar los

100 kg de peso, incluso 300 kg en ocasiones habiéndose encontrado indicios de que su peso va en

aumento según una distribución más occidental, en el caso de los machos y 80 kg en las hembras

mostrando así un marcado dimorfismo sexual.

El pelaje en adultos muestra una coloración parda con extremidades muy oscuras y pelo grisáceo en

zonas circundantes al hocico. La especie presenta una crin dorsal característica que se eriza en

momentos de tensión. El pelaje de los rayones o jabatos (hasta 5 a 6 meses) en cambio muestra

coloración rojiza o incluso amarillenta con 11 líneas longitudinales oscuras, tras este periodo toman

un tono uniforme hasta los 10 o 12 meses en los que adquieren tonos característicos de un ejemplar

adulto.

Considerando el aparato sensitivo sabemos que el olfato es el que mayor grado de desarrollo presenta

probablemente por la gran importancia que implica en la comunicación con otros miembros de su

especie ya que poseen diversas glándulas con tal función y su uso como detector de posibles

depredadores.

El apartado reproductivo de la especie es clave para explicar el sustento de la especie. Tiene una alta

capacidad reproductora por la precocidad en alcanzar la madurez sexual rondando los 10 meses, la

corta gestión que es de unos 120 días y la elevada media de crías por camada que se encuentra entre

4,4 y 5,9 (Rossel, C. y col. 2001).

Demografía

A pesar de tener una longevidad de hasta 13 años en España lo máximo observado son 11 y de la

población existente la inmensa mayoría es joven (en Europa entre un 62 y 79% no llegan a los 2 años).

Este hecho se da tanto en reservas naturales como en zonas con una gran intensidad cinegética. La

obtención de un censo de jabalís resulta complicado e inexacto por las grandes fluctuaciones

inherentes a la población y por su difícil observación, la mayoría de los datos se obtienen a partir de

actividades cinegéticas. La inexactitud de los datos es amplia, pero podemos decir que en España hay

Introducción

una densidad media entre 1,7 y 11,4 individuos por cada 100 hectáreas dependiendo esto en gran

medida por la oferta alimenticia en su hábitat.

Sus principales depredadores son el lobo (Canis lupus) y en algunas ocasiones aves rapaces que se

hicieron con los rayones. Pero los principales causantes de la gran tasa de renovación de esta especie

son las actividades cinegéticas siendo el factor de mortalidad más importante (entre 30 y 40%). A pesar

de ello la tendencia en España al igual que en el resto de Europa muestra una gran tendencia al alza

con un fuerte incremento de la población.

El tamaño medio de los grupos se establece entre 3 y 5 individuos. Son grupos que tienen como unidad

básica el grupo matriarcal que está compuesto de varias hembras y sus rayones normalmente

liderados por una hembra mayor. Además de estos grupos se componen otros de machos jóvenes

expulsados del grupo matriarcal por machos adultos que en época de celo abandonan su conducta

solitaria para reproducirse. (Da Silva, A. A. (2004)).

Alimentación. Se alimenta de forma generalista y oportunista aprovechando pocos alimentos muy digeribles y

disponibles (Schley & Roper 2003). Puede alimentarse de elementos muy diversos según

disponibilidad de éstos aún que esta suele estar compuesta generalmente por vegetales dejando los

alimentos de origen animal como un mero complemento. Comúnmente éstos casi siempre incluyen

bellotas, castañas, bulbos y hayucos en el apartado vegetal y como oportunista invertebrados

terrestres o acuáticos y huevos de aves que anidan en el suelo en el apartado cárnico.

Hábitat. La extrema adaptabilidad de los jabalíes les permite vivir en un muy variados ambientes abarcando

desde altitudes de marismas hasta prados subalpinos permitiéndole incluso una extrema tolerancia a

la presión antrópica llegando a establecerse en periferias de áreas urbanas.

Las áreas de establecimiento de cada grupo responden a dos factores, la disponibilidad de comida y la

existencia de machos por motivos reproductivos.

El área de campeo que pueden abarcar los machos varia de entre 12.000 y 15.000 hectáreas (un radio

de 7 km) y se reduce en las hembras a unos 6.000 hectáreas. De esto se deduce un estado

relativamente sedentario de la población aun que en casos excepcionales algunos ejemplares llegaron

a abarcar hasta 250 km de diámetro (Rossel, C. y col. 2001)

II. Justificación y objetivos

II. Justificación y objetivos

Justificación y Objetivos

II. Justificación y Objetivos

La alarmante presencia de contaminantes orgánicos es un tema tratado cada vez con más asiduidad y que ha ido cobrando mayor importancia a lo largo de los últimos años. Numerosos estudios constatan esta preocupación exponiendo así los efectos y el peligro que reside en dichos contaminantes.

Para intentar evitar o reducir estos graves efectos, los diferentes organismos públicos han establecido diversas normativas para restringir el uso y/o establecer los límites residuales de estos compuestos. Uno de los planes más ambiciosos creados hasta la fecha por la comunidad internacional es el Convenio de Estocolmo, referencia indiscutible desde su creación e implantación. Su propósito primordial es eliminar y cuando no es posible, regular las emisiones de los contaminantes orgánicos persistentes. Es un plan en continuo cambio, que desde su comienzo ha ido profundizando e incrementando la lista de contaminantes considerados tóxicos para la salud humana y animal. Además, establece la premisa de seguir elaborando sistemas de vigilancia que también hagan frente de manera activa a otros compuestos identificados como peligrosos.

Derivados de esta preocupación por el medio ambiente y la salud humana y animal, surge la necesidad de comprender y entender de qué manera los seres vivos están expuestos a gran cantidad de estos contaminantes. Según el Consejo Nacional de Investigación de los Estados Unidos (NRC, 1991), los objetivos primordiales de cualquier estudio realizado con muestras de animales incluyen la obtención de datos para evaluar riesgos para los humanos, identificar contaminantes en la cadena alimentaria y constatar posibles efectos negativos en los propios animales. Existen especies de fauna silvestre, como el jabalí, que en los últimos años han incrementado su presencia en zonas forestales y periurbanas de la Península Ibérica y también en el resto de Europa. Esto es debido a numerosas causas tales como la explosión demográfica que ha experimentado esta especie cinegética y el cambio climático entre otros. El jabalí cumple adecuadamente los requisitos de bioindicador y constituye por lo tanto una buena manera de detectar un posible riesgo toxicológico. Tienen una vida relativamente larga, una tolerancia alta frente al estrés ambiental, son fáciles de obtener en actividades cinegéticas y comparten muchos mecanismos fisiológicos con el ser humano (Sobańska, M. A. 2005).

Con la biomonitorización, en este caso, del jabalí, se pueden obtener y extrapolar datos acerca de la cantidad, la variabilidad y los posibles daños que estos contaminantes orgánicos causan en los organismos vivos de la zona.

Justificación y Objetivos

Los objetivos principales del presente Trabajo Fin de Grado han sido:

La puesta a punto de un método analítico rápido y sencillo que permita la determinación simultánea de 70 contaminantes orgánicos a nivel traza, con características físico-químicas variadas, agrupados en la siguientes familias: plaguicidas organoclorados (OC) y organofosforados (OPP), retardantes de llama bromados (PBDE) y organofosforados (OPE), hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH), bifenilos policlorados (PCB) y piretroides.

Determinar la presencia de contaminantes orgánicos en pelo de jabalí.

A partir de los datos obtenidos, evaluar patrones de contaminación y la posible exposición a contaminantes orgánicos en jabalís según su zona y su posible uso como bioindicador.

III. Parte experimental

III. Parte experimental

III. Parte experimental

1. Toma de muestras

Parte experimental

Las veinte muestras seleccionadas se localizan en los municipios de la provincia de Ourense (San amaro, Cenlle, Nogueira de Ramuín, Celanova y A Rúa). Se extraen con el animal ya muerto mediante pinzas manteniendo la raíz. El pelo procede de la región del cuello del animal y cuando esto no es posible de la región caudal.

Dado a que las muestras se obtuvieron en actividades cinegéticas no conocemos cual es exactamente el hábitat de nuestro individuo muestreado. En la “Tabla 4” se muestran las características de las muestras recogidas.

Tabla 4: Datos de muestras recogidas de los jabalís estudiados

No.

Peso aprox. (Kg)

Sexo

Fecha de recogida

Lugar de recogida

1 85 Kg

Macho

24/01/2015

A Rúa

2 80Kg

Macho

07/02/2015

San Amaro

3 50 Kg

Hembra

07/02/2015

Cenlle

4 40 Kg

Hembra

07/02/2015

Cenlle

5 50 Kg

Macho

07/02/2015

Cenlle

6 40 Kg

Hembra

07/02/2015

San Amaro

7 50 Kg

Macho

08/02/2015

Laias

8 80 Kg

Macho

09/02/2015

San Amaro

9 80 Kg

Macho

08/02/2015

A Bola (Celeanova)

10 80 Kg

Macho

07/02/2015

Cenlle

11 50 Kg

Hembra

08/02/2015

A Bola (Celeanova)

12 50 Kg

Hembra

01/11/2015

Nogueira de Ramuín

13 40 Kg

Hembra

08/11/2015

Luintra

14 85 Kg

Macho

08/11/2015

Luintra

15 40 Kg

Macho

08/11/2015

Luintra

16 70 Kg

Macho

08/11/2015

Luintra

17 50 Kg

Hembra

08/11/2015

Luintra

18 30 Kg

Hembra

08/11/2015

Luintra

19 40 Kg

Hembra

08/11/2015

Luintra

20 30 Kg

Hembra

08/11/2015

Luintra

Parte experimental

En la siguiente Ilustración (7) se localizan las muestras geográficamente.

Ilustración (7) se localizan las muestras geográficamente. Dado el gran movimiento de los individuos un punto

Dado el gran movimiento de los individuos un punto concreto de la localización de las muestras es imposible además de poco práctico ya que ignoraría el territorio en el que realmente se recogieron los contaminantes.

Parte experimental

Para evitar esto realizamos una estimación creando un perímetro de posible distribución basado en el diámetro de su territorio y las zonas que suelen ser habitadas por estos animales (Figura 8).

y las zonas que suelen ser habitadas por estos animales (Figura 8). Figura 8: Distribución estimada

Figura 8: Distribución estimada de los jabalís

2. Material e instrumentos

1. Material

Parte experimental

- Cartuchos de 6 mL (SPE Columns) de Telos, Fisher Scientific (Leicestershire, UK).

- Espátulas en acero inoxidable de J.P. Selecta (Barcelona, España).

- Filtros de jeringa 0,22 µm de Restek (Bellefonte, USA).

- Frascos Pyrex con tapón de rosca de 500 y 50 ml, de Afora (Barcelona, España).

- Insertos de vidrio de 100 µl, de Supelco, (Bellefonte, USA).

- Matraces aforados de distintos volúmenes, de Afora (Barcelona, España).

- Micropipetas con rango de medida entre 2 y 10000 µl de Eppendorf Ibérica, (Barcelona, España).

- Pinzas de acero inoxidable, de J.P. Selecta (Barcelona, España).

- Pipetas Pasteur de vidrio, de Afora (Barcelona, España).

- Probetas de vidrio de distintos volúmenes, de Afora (Barcelona, España).

- Tubos de centrífuga Pyrex de 50 mL de Afora (Barcelona, España).

- Tubos de vidrio de fondo cónico de 15 ml de Afora (Barcelona, España).

- Vasos de precipitados de 25, 50, 100, 200, 600 y 1000 ml, de Afora (Barcelona, España).

- Viales ámbar de 10 y 30 mL de Afora (Barcelona, España).

- Viales de inyección Agilent (California, USA).

- Viales de inyección Thermo (Massachusetts, USA).

Pequeño aparataje de laboratorio

Agitador vórtex Reax Top, de Heidolph (Cinnamiusion, Alemania).

Balanza analítica monoplano GR-200 equilibrada para una exactitud de 0,0001 gr de

A&D (Ahensburg, Alemania).

Baño de ultrasonidos Ultrasons- H, de J.P. Selecta (Barcelona, España).

Centrífuga Universal 320R de Hettich (Lauenau, Alemania).

Estufa de incubación de Raypa (Barcelona, España).

Evaporador Turbovap de Caliper Life Sciencies (Massachusetts, USA).

Instrumentos de detección

Parte experimental

El equipo instrumental que se emplea en este trabajo es un cromatógrafo de gases (GC) Agilent 7890B,

acoplado a un detector triple cuadrupolo Agilent 7000C y a un automuestreador Agilent 7650A (Agilent;

California, USA) con las siguientes características (Tabla 5):

Tabla 5. Condiciones analíticas e instrumentales utilizadas en la determinación de contaminantes orgánicos mediante GC-MS/MS.

CROMATÓGRAFO DE GASES

Agilent 7890B

Automuestreador

Agilent 7650A

Inyector

Multimodo; Solvent Vent.

Temperatura inyector

60°C (0.2 min), 900°C/min hasta 300°C (10 min), 900°C/min hasta 60°C (0 min).

Liner

Ultra Inert Liner Splitless, Wool.

Volumen de inyección

2 µL

Gas portador

Helio; 1mL/min, flujo constante

Programa del horno

60°C (1 min), 40°C/min hasta 190°C (0 min), 5°C/min hasta 280°C (2 min), 10°C/min hasta 325°C (5 min).

Columna analítica

Agilent HP 5MS (30m x 0.25mm x 0.25µm)

DETECTOR QQQ

Agilent 7000C

Tlínea de transferencia

280°C

Modo

Impacto electrónico

Tde la fuente

280°C

Tcuadrupolos (Q1 y Q3)

180°C

Gases de colisión

Nitrógeno a 1,5 mL/min, Helio a 2,25 mL/min.

SOFTWARE DE ADQUISICIÓN

Agilent Mass Hunter Data Acquisition

Análisis cualitativo

Mass Hunter Workstation Software for Qualitative Analysis (Ver. B.07.00).

Análisis cuantitativo

Mass Hunter Workstation Software for Quantitative Analysis (Ver. B.07.00).

Parte experimental

Un cromatógrafo de líquidos Dionex Ultimate 3000 HPLC Thermo Scientific equipado con bomba

cuaternaria, inyector automático, desgasificador y horno para columnas, acoplado a un detector de

espectrometría de masas con un triple cuadrupolo TSQ Quantum™ Access MAX de Thermo Scientific (Tabla

6).

TSQ Quantum™ Access MAX de Thermo Scientific (Tabla 6). Figura 9.1 Figura 9.2 Figura 9.3 Figura

Figura 9.1

Access MAX de Thermo Scientific (Tabla 6). Figura 9.1 Figura 9.2 Figura 9.3 Figura 9: Figura

Figura 9.2

MAX de Thermo Scientific (Tabla 6). Figura 9.1 Figura 9.2 Figura 9.3 Figura 9: Figura 9.1

Figura 9.3

Figura 9: Figura 9.1 Equipo LC-MS/MS. Dionex Ultimate 3000 HPLC Thermo Scientific. Figura 9.2 Equipo LC/MS-MS. TSQ Quantum™ Access MAX. Figura 9.3 Equipo GC-MS/MS. Agilent 7890B, Agilent 7000C ,7650A Agilent.

Tabla 6. Condiciones analíticas e instrumentales utilizadas en la determinación de contaminantes orgánicos mediante LC-MS/MS.

CROMATÓGRAFO DE

Dionex Ultimate 3000 HPLC Thermo Scientific

 

LÍQUIDOS

Volumen de inyección

5 µL

Columna analítica

Kinetex TM 2.6 µm C18 (100 Å, 100 x 2,1 mm)

 

Temperatura

40º C

 

Fase móvil

Disolvente A: agua

Disolvente B: metanol

Disolvente C: agua y 10% de ácido fórmico

 

Disolvente D: isopropanol

 

Fujo

0,25 mL/min

Gradiente

90 % A durante 2 min

5 % B durante 2 min

5 % C durante 2 min

5

% A durante 10 min

90 % B durante 10 min

5 % C durante 10 min

5

% A durante 11 min

90 % B durante 11 min

5 % C durante 11 min

- 45 % B durante 11,1 min

- 45 % B durante 16 min

5 % C durante 11,1 min

5 % C durante 16 min

90

% A durante 16,1 min

5 % B durante 16,1 min

5 % C durante 16,1 min

90

% A durante 22 min

5 % B durante 22 min

5 % C durante 22 min

Parte experimental

DETECTOR

TSQ Quantum™ Access MAX

Voltaje capilar

4 kV

Temperatura del capilar

350º C

Presión de N 2

35

Presión de N 2 auxiliar

5

Gas de colisión

Argón

SOFTWARE DE ADQUISICIÓN

Análisis cualitativo

Xcalibur 2.2 Thermo Electron Corporation

Análisis cuantitativo

Xcalibur 2.2 Thermo Electron Corporation

3. Reactivos y disolventes

1. Reactivos

El método utilizado necesita de los siguientes reactivos para su correcto procedimiento

Sulfato sódico anhidro 99% de Panreac (Barcelona, España).

Sílica de Supelco (Bellefonte, USA).

Sulfato de cobre (opcional para tintar el HCl y facilitar la extracción).

2. Disolventes

Utilizamos los siguientes disolventes con purezas aptas para un cromatógrafo.

Acetona (CHROMASOLV for HPLC ≥99.8%) de Sigma Aldrich (Missouri, USA).

Etil acetato (CHROMASOLV for HPLC ≥99.7%) de Sigma Aldrich (Missouri, USA).

Hexano (CHROMASOLV for HPLC ≥97.0%) (GC) de Sigma Aldrich (Missouri, USA).

Metanol (CHROMASOLV -gradient grade for HPLC ≥99.9%) de Sigma Aldrich (Missouri, USA).

Parte experimental

4. Preparación de las disoluciones patrón.

Para evaluar la exposición de contaminantes se adquirieron los patrones utilizados, sus características y la elución en la que son utilizadas se presentan en la siguiente “tabla 7”.

Tabla 7: Patrones utilizados

Compuesto

 

CAS

Pureza (%)

Proveedor

4,4´DDT;

 

1,1-Bis(4-clorofenil)-2,2,2-Tricloroetano

50-29-3

98,7

Sigma-Aldrich

α-HCH; Alpha-hexaclorociclohexano

319-84-6

98,7

Sigma-Aldrich

Acetamiprid

 

135410-20-7

99,9

Sigma-Aldrich

Aldrín

309-00-2

97

Restek

Benzo(a)antraceno

56-55-3

99,9

Sigma Aldrich (Supelco)

Benzo(a)pierno

50-32-8

99,6

Sigma Aldrich (Supelco)

Benzo(b)fluoranetano

205-99-2

99,5

Sigma Aldrich (Supelco)

Benzo(ghi)perileno

191-24-2

96,3

Sigma Aldrich (Supelco)

Benzo(k) fluoranetano

207-08-9

99,9

Sigma Aldrich (Supelco)

β-HCH; Beta- hexaclorociclohexano

319-85-7

98

Dr Ehrenstorfer

HDEHP; Bis (2-etilhexilo) fosfato

298-07-7

97

Aldrich

Carbofurano

 

Chlordane

 

12789-03-6

-

Analytical Standard Solution

Chlorpirifos

2921-88-2

99,8

Sigma-Aldrich (PESTANAL)

Criseno

218-01-9

99,9

Sigma Aldrich (Supelco)

Clotianidina

 

210880-92-5

99,9

Sigma-Aldrich

Ciflutrina

68359-37-5

94,5

Aldrich

Cipermetrina

 

52315-07-8

95

Analytical Standard Solutions

Deltametrina

52918-63-5

99,5

Analytical Standard Solutions

Diazinón

333-41-5

95,5

Analytical Standard Solutions

Dibenzo(ah)antraceno

53-70-3

99,8

Sigma Aldrich (Supelco)

Dichlorvos

 

62-73-7

99,3

Analytical Standard Solutions

Dieldrin

60-57-1

98

Restek

Sal de amonio ditiofosfato de dietilo

1068-22-0

95

Aldrich

Dinotefurano

 

165252-70-0

99

Sigma-Aldrich

Fosfato de difenilo

838-85-7

99

Aldrich

Endrin

72-20-8

98

Restek

Fentión

55-38-9

99,3

Supelco

Fipronil

120068-37-3

97,9

Sigma-Aldrich (PESTANAL)

Fluoranetano

 

206-44-0

98,3

Sigma Aldrich (Supelco)

HCB; Hexaclorobenzeno

118-74-1

99

Sigma Aldrich (Aldrich)

Imidacloprid

 

138261-41-3

99,9

Sigma-Aldrich

Indeno(1,2,3-cd)pireno

193-39-5

99,6

Sigma Aldrich (Supelco)

Malatión

121-75-5

99

Dr Ehrenstorfer

Nytempiram

 

150824-47-8

99,9

Sigma-Aldrich

O, O-Sal de dietílo tiofosfato de potasio

5871-17-0

98

Sigma-Aldrich

o,p´DDT; 2-(2-clorofenil)-2-(4-clorofenil)-1,1,1-tricloroetano

789-02-6

99

Supelco

Paranthion metil

298-00-0

99,7

Sigma-Aldrich (PESTANAL)

PBDE 28;

2,4,4' - Tribromodifenil éter

41318-75-6

99,2

Accustandard

PBDE 47;

2,2', 4, 4' - Tetrabromodifenil éter

5436-43-1

98,0

Accustandard

PBDE 99;

2, 2', 4, 4', 5 - Pentabromodifenil éter

60348-60-9

98,3

Accustandard

Parte experimental

PBDE 100;

2, 2', 4, 4', 6- Pentabromodifenil eter

189084-64-8

100

Accustandard

PBDE 153;

2, 2', 4, 4', 5, 5' - Hexabromodifenil éter

68631-49-2

100

Accustandard

PBDE 154;

2, 2', 4, 4', 5, 6' Hexabromodifenil éter

207122-15-4

97

Accustandard

PBDE 183;

2, 2', 3, 4, 4', 5', 6 - Heptabromodifenil éter

207122-16-5

98,8

Accustandard

PBDE 209; 2, 2', 3, 3', 4, 4', 5, 5', 6, 6' - Decabromodifenil éter

1163-19-5

98,3

Accustandard

PCB 11;

3,3'-Diclorobifenilo

2050-67-1

-

Accustandard

PCB 28;

2,4,4'-Triclorobifenilo

7012-37-5

-

Sigma-Aldrich (Fluka)

PCB 52;

2,2',5,5'-Tetraclorobifenilo

35693-99-3

-

Sigma-Aldrich (Fluka)

PCB 77; 3,3',4,4'-Tetraclorobifenilo

32598-13-3

99,5

Dr. Ehrenstorfer

PCB 81; 3,4,4',5-Tetraclorobifenilo

70362-50-4

98

Dr. Ehrenstorfer

PCB 101;

2,2',4,5,5'-Pentaclorobifenilo

37680-73-2

-

Sigma-Aldrich (Fluka)

PCB 105;

2,3,3',4,4'-Pentaclorobifenilo

32598-14-4

97

Dr. Ehrenstorfer

PCB 114;

2,3,4,4',5-Pentaclorobifenilo

74472-37-0

99

Dr. Ehrenstorfer

PCB 118;

2,3',4,4',5-Pentaclorobifenilo

31508-00-6

99,5

Dr. Ehrenstorfer

PCB 123;

2,3',4,4',5'-Pentaclorobifenilo

65510-44-3

99,5

Dr. Ehrenstorfer

PCB 126;

3,3',4,4',5-Pentaclorobifenilo

57465-28-8

98

Dr. Ehrenstorfer

PCB 138;

2,2',3,4,4',5'-Hexaclorobifenilo

35065-28-2

-

Sigma-Aldrich (Fluka)

PCB 153;

2,2',4,4',5,5'-Hexaclorobifenilo

35065-27-1

-

Sigma-Aldrich (Fluka)

PCB 156;

2,3,3',4,4',5-Hexaclorobifenilo

38380-08-4

99

Dr. Ehrenstorfer

PCB 157;

2,3,3',4,4',5'-Hexaclorobifenilo

69782-90-7

99

Dr. Ehrenstorfer

PCB 167;

2,3',4,4',5,5'-Hexaclorobifenilo

52663-72-6

99

Dr. Ehrenstorfer

PCB 169;

3,3',4,4',5,5'-Hexaclorobifenilo

32774-16-6

99

Dr. Ehrenstorfer

PCB 180;

2,2',3,4,4',5,5'-Heptaclorobifenilo

35065-29-3

-

Sigma-Aldrich (Fluka)

PCB 189;

2,3,3',4,4',5,5'-Heptaclorobifenilo

39635-31-9

99

Dr. Ehrenstorfer

PCB 209;

Decaclorobifenilo

2051-24-3

-

Sigma-Aldrich (Fluka)

PBEB ; Pentabromoetilbenceno

85-22-3

98,8

Accustandard

Permetrina

52645-53-1

98

Analytical Standard Solutions

Pireno

129-00-0

98,8

Sigma-Aldrich (Supelco)

Thiacloprid

111988-49-9

99,9

Sigma-Aldrich

Thiametohoxam

153719-23-4

99,6

Sigma-Aldrich

TBP;

Tributilfosfato

126-73-8

99,5

Analytical Standard Solutions

TCP;

Tricresil fosfato

1330-78-5

90,0

Accustandard

TEP; Trietilfosfato

78-40-0

99,9

Dr. Ehrenstorfer

TPP; Trifenil fosfato

115-86-6

99,0

Analytical Standard Solutions