PRODUCCION DE AMINOACIDOS

MSG production
Fermentors at Kyowa
Akko Corp. The
volume of each is
63,420 gallons and
the height is about
100 ft tall. Hofu,
Japan
PRINCIPALES USOS
60 % industria alimentaria
30 % suplementacion de dietas animales
10 %. medicina, cosmetica e industria quimica

SABORIZANTES
CALIDAD DE PRODUCTO
SUPLEMENTACION DE GRANOS Y PIENSOS

NUEVAS APLICACIONES:
Fibras de polialanina
FABRICACION DE POLIMEROS Resinas de isociananto de Lys
Cueros sinteticos con polimetilglutamato
COSMETICOS champues, bronceadores, dentifricos, surfactantes
FARMACOS Tirosina como precursor de L- Dopa, bloqueantes de receptores,etc
 VOLUMENES DE PRODUCCION
• Estimated world market :

aminoacido 1981 1985 1992 1996

(ton/año) (ton/año) (ton/año)
L-Arg 400 1000
L-Asp 250 4000 6000 7,000
L-Cys 200 1000 1,500
L-Glu 80000 340000 600000 1,000,000
Gly 3500 6000 22,000
L-Lys 20000 70000 200000 250,000
DL-Met 120000 250000 350,000
L-Phe 150 3000 6000 8,000
L-Thr 160 200 4,000
Produccion total en el año 2001: 1.8 millones de toneladas
Mercado estimado: USD 3 billion

Degussa AG ( Germany)
Kyowa (Japon) y Ajinomoto (Japon) producen ¾ de la produccion mundial
 METODOS DE PRODUCCION

1- EXTRACCION A PARTIR DE HIDROLIZADOS DE PROTEINA: Se aplica

solamente para Cys, Tyr y Leu

2- SINTESIS QUIMICA. Se obtienen mezclas racemicas que luego se resuelven con

enzimas de origen microbiano.

3- METODOS MICROBIOLOGICOS

a) Fermentacion directa a partir de una fuente de carbono

Produccion de glutamico con Corynebacterium empleando sacarosa, acetato o
hidrolizados de almidon.
Produccion de lisina por Brevibacterium con melazas o glucosa.
Resolucion de mezclas racemicas

Para Met, Ala y Gly

 Conversion de Alfa cetoacidos

ADH o AA DH + NAD(P)H
Alfa- cetoacidos + amonio Aminoacido

Aspartasa (DE E. COLI) + NAD(P)H

Fumarato + amonio Aspartico

Fenilalanina deshidrogenasa + NAD(P)H

Fenilpiruvato + NH4 Fenilalanina
( Brevibacterium flavum)
Otro metodo enzimatico:
Obtencion de Hidantoinas y Uso posterior de Hidantoinasa y
Carbamoylasa de especies de Arthrobacter
Aldehido + KCN + (NH4)2CO3

pH 8.5

Ejemplo: Obtencion de D- Asp para penicilinas

 CEPAS UTILIZADAS EN LA PRODUCCION
MICROBIOLOGICA DE AMINOACIDOS

•-Cepas salvajes o aisladas de la naturaleza

•-Mutantes auxotroficas
•-Mutantes regulatorias
•-Mutantes combinadas

•- Cepas obtenidas por manipulacion genetica de mutantes:

-USANDO PLASMIDOS VECTORES

-Usando fagos
- Usando fusion de protoplastos para combinar cepas con caracteristicas
deseables (Genome shuffling)
Genome shuffling para cepas que pueden recombinar en forma
mitotica

E. coli K12
Porque shuffling?
 PRODUCCION DE AMINOACIDOS CON CEPAS SALVAJES

Antecedentes: En 1908 se aislo el Acido Glutamico de un alimento autoctono oriental por lo que se empezo a
producir comercialmente a partir de la hidrólisis de proteinas. En 1957 se aisla una cepa microbiana capaz de
producir y secretar al medio aprox. 1 g/ L de Ac. Glutamico. Desde entonces se aislaron muchas cepas
capaces de acumular mas de 30 g/ L del aminoacido.

Generos productores: Corynebacterium,

Brevibacterium y Microbacterium.

Caracteristicas morfologicas y
bioquimicas: Gram positivos, no
esporulados, inmoviles, forma de coco o
cocobacilo.

Pueden emplear glucosa, acetato o etanol

como fuentes de carbono. No crecen en
metanol pero algunas cepas lo hacen en
alcanos.
Vias glicoliticas relacionadas con la produccion de AA

piruvato-carboxilasa

biotina
malato carboxilasa

via del glioxalato

NADPH
+NH3

glutamato
 Contribucion de las vias
anapleroticas en Corynebacterium
BIOSINTESIS Y REGULACION DE LA PRODUCCION Y
SECRECION DE ACIDO GLUTAMICO EN CORYNEBACTERIUM

- Las cepas productoras de acido glutamico se caracterizan por :

• Su requerimiento de biotina (auxotrofas)
• Por poseer una muy baja actividad de la enzima α- ceto glutarato
deshidrogenasa.
• Predominio de las vias anapleroticas
 •PAPEL DE LA BIOTINA

* Control feed-back de la sintesis de glutamato regulado por

secrecion
ASPARTATO TREONINA, METIONINA, LISINA, ETC
GLUCOSA PEP OXALACETATO

CITRATO αCETO- GLUTAMICO

GLUTARATO

•Modificacion de la permeabilidad celular.

• Crecimiento a alta temperatura
•Uso de detergentes
• Acidos grasos no saturados
• Inhibidores de la síntesis de pared (penicilina)
• Limitar la biotina
 PROCESO DE PRODUCCION DE ACIDO GLUTAMICO
♦El uso de penicilina, acidos grasos
Fuentes de Carbono: Hidrolizados de
saturados o tween permite producir
almidon, melazas de caña o remolacha
glutamico en medios con exceso de
conteniendo 10-20 % de sacarosa.
biotina Tambien el uso de cepas
auxotrofas al acido oleico.
Fuentes de Nitrogeno: Amonio o
urea. Se agrega durante el proceso para
evitar su derivacion a otros
aminoacidos (glutamina, prolina)
pH: se mantiene en 8-8.5 por agregado
de NH3
Minerales: Fosfatos, Potasio, Sulfatos,
Magnesio, Hierro y Manganeso.
♦Evitar el exceso de biotina
♦Limitacion de oxigeno: se acumulan
acidos organicos (lactico, succinico)
♦Exceso de NH3: se acumula
glutamina
 PRODUCCION DE AMINOACIDOS CON MUTANTES AUXOTROFAS

GLUTAMATO + N-ACETIL

1- Para producir intermediarios

de rutas biosinteticas lineales N- ACETIL GLUTAMICO

N- ACETIL GLUTAMIL-P

N- ACETIL GLUTAMIL-P SEMIALDEHIDO

N-ACETIL-ORNITINA

ORNITINA

CITRULINA
SUCCINATO ARGININA

ARGININA
2- Para producir AA en rutas biosinteticas ramificadas
A
B

C
D F
E G

Síntesis de los aminoacidos de la via del aspartato en Corynebacterium

PRODUCCION DE AMINOACIDOS CON MUTANTES
REGULATORIAS
Las mutantes regulatorias pueden seleccionarse por
resistencia a analogos estructurales toxicos o pueden ser
revertantes de cepas auxotroficas.

Analogo estructural de Lisina: aminoetil cisteina

HC- C- C- C- C- COOH HS- C- C-COOH

NH2 NH2 HN- CH2- CH3
PRODUCCION DE LISINA

FUENTE DE ORGANISMO FENOTIPO Y (g/L)

CARBONO

Glucosa C. glutamicum Hme - Leu - 34

Glucosa C. glutamicum Hme- Leu- AECr 39
Glucosa B.lactofermentu AECr Ala- CCLr 70
m MLr
Acetato B. flavum Hme- Thr- 75
etanol B.lactofermentu AECr 66
m
PROCESO DE PRODUCCION DE L- LISINA
Cepas: Se utilizan cepas de los mismos generos que para la produccion de acido
glutamico pero con mutaciones auxotroficas y/o regulatorias a los fines de hacer
el proceso mas selectivo (Thr- , Met- , AEC r , Hme- )

Tambien con cepas de ingenieria genetica donde se aumenta el dosaje genetico de

la enzima DAP sintetasa (Por analisis de flujos)

Fuentes de carbono: Fermentacion directa a partir de fuentes de carbono

sencillas: Melazas, acetato, etanol.
Fuentes de nitrogeno: NH3, urea (si tienen ureasa) , sales de Amonio.
Si son auxotrofos, deben agregarse los aminoacidos en cantidades limitantes. La
biotina no afecta este proceso.

Ejemplo de un medio de cultivo industrial: melaza de caña 20 %, hidrolizado de

proteina de soja 1.8 % y amoniaco gaseoso como fuente de N y para mantener el
pH (aprox. = 7). Tiempo de fermentacion: 60 Hs.

Condiciones del proceso: agitacion 150 rpm; aireacion 0.6 vvm, temperatura
28 0 C
Concept of the typical amino acid fermentation
cell
product
Nitrogen

nutrients

metabolism
product
EL ANALISIS DE FLUJOS A TRAVES DE
TODOS LOS PASOS ENZIMATICOS QUE
LLEVAN A LA PRODUCCION DE LYS
INDICO QUE UN FACTOR LIMITANTE
ESTA EN EL PUNTO DE RAMIFICACION
DEL PEP. ADP
pyk
AA PEP ATP

ppck pps
CO2 PIRUVATO TCA

Ppc pyc
ASPARTATO OAA odc

LYS decarboxilasa

OBJETIVOS:
♦ Amplificar ppc
♦ Eliminar ppck
♦ Eliminar pyk (exceso de ATP)
Continuous & fed-batch culture for lysine
production
Carbon flux in central metabolism
PEP
Net flux:
PEP G6P Glucose
38%
Forward flux: pyk
ppck 2.76 Pyr
72% ppc (-0.75)
0.29
Back flux:
34%
pyc
1.24 Pyr
odc
(-0.15)

Sahm et al., 2000. Biol. Chem. 381:899-910.

OAA Citrate
aceB
Aspartate Malate
Glyoxylate
Isocitrate
aceA
Succinate
Lysine a-Ketoglutarate
Split Pathway with Corynebacterium glutamicum

Wild type

Mutante dap D( sobreexpresion)

Export de lisina por la proteina transportadora (Lys E)
Tambien actuaria como control intracelular del nivel
de Lys y otros aminoacidos
 Estrategias de modificacion de rutas
metabolicas para mejorar la
production of amino acids
• Amplification of rate-limiting enzyme (removal of bottleneck)
bottleneck
Phe

• Amplification of branch-point enzyme (matabolic conversion) Lys

Thr

• Introduction of heterologous enzyme with different control architecture

(bypass of bottleneck reaction)
Ile

Ile insensitive
• Introduction of heterologous enzyme with different catalytic mechanism
(acceleration of key reaction)
Pyr Ala
NAD NADH
NADH NAD

• Amplification of the first enzyme in terminal pathways

Trp

intermediate
Recent progress in strain development technology
Engineering of central metabolism

Strategy to increase precursor availability Typical method patented for increasing

for aromatic and histidine production carbon flux to aromatic biosynthesis
Recent progress in strain development technology
Transport engineering
Tryptophan

Cysteine
Genome-based strain construction
PEP
Mutation Lysine, g/l PEP G6P Glucose

hom 8 Pyr
ask 55
hom, ask 75 Pyr
hom, ask, pyc 80 pyc

OAA Citrate
Aspartate Malate
ask Glyoxylate
Isocitrate
Lysine Asp-β-semialdehyde Succinate
a-Ketoglutarate
hom
87580
Threonine
g/liter
Ohnishi et al., 2002, Appl Microbiol Biotechnol 58:217-23
 L- treonina
• Se produce con una cepa de E. coli manipulada geneticamente.
• La mutante inicial se selecciono por resistencia a AHV. (Mutante regulatoria)
• E. coli tiene 3 AK reguladas por Thr e Ile (AKI), Met (AKII) y Lys (AKIII) –(Obtencion
de auxotrofos a Met , Lys)
• E. coli tiene 2 ASD reprimidas por Lys, Thr y Met
• El operon Thr ABC esta regulado por atenuacion transcripcional
• Thr deaminasa y Thr deshidrogenasa (ilv A y tdh) son tambien puntos de control
(Auxotrofos a Ile)
Methodology of genome-based reconstruction
of a classically derived production strain.
 Caracteristicas genotipicas y fenotipicas
de una Cepa recombinante productora de Treonina (65 g/L)

Gen que codifica para el factor ppGpp que

rel A aumenta la transcripcion de los genes trna de los
AA
Mutante con thr C inactivado
thr C
Mutante de treonina deaminasa que reduce el
ilvA nivel de atenuacion del operon thr

Uso de sacarosa
suc
Gen relacionado a eflux: Aumenta la excrecion
rht 23A
Mutante sin treonina deshidrogenasa: disminuye
tdh
la degradacion
PEP carboxilasa insensible al aspartato :
ppc aumenta el flujo de carbonos hacia OAA y Asp

Plasmido con el operon thr clonado y con una

pVC40 mutacion thrA* (mutacion AKI)
 Outlines of purification process for feed
grade lysine and threonine
Fermentation broth Fermentation broth

Cell separation Biomass Cell separation Biomass

Acidifying with sulfuric acid Ammonia solution
pH adjustment
Adsorption and elution on cation exchange resin
1st concentration
Lysine fractions
Waste water 2nd concentration
1st concentration

Neutralization with HCl Crystallization

2nd concentration
Separation
Crystallization
Drying
Separation Mother liquor

Drying Threonine

Lysine HCl