Georgina Mitjans Domenech

CUESTIONARIO PRÁCTICA 8

1. Qué es una proteína recombinante? 


Una proteína recombinante es una proteína que queremos obtener por interés en
nuestro estudio. Para obtener estas proteínas, en primer lugar, el gen que codifica la
proteína de interés, se introduce en un plásmido bacteriano para facilitar su manejo, y a
partir de ahí, se transfiere a las células que lo van a traducir para obtenerla. En este caso
la expresión se lleva a cabo en E.coli por su fácil manejo y elevado rendimiento.

2. En el Anexo 3 consulta cómo funciona el operón lac. Qué es un sistema de

expresión inducible? Qué es el IPTG y para qué se utiliza en vuestro experimento?
La expresión de genes puede ser inducida cuando una molécula específica llega a la
celula.Para sistemas inducibles, un gen de represión previene la expresión de un gen. La
lactosa es la molécula lac operón inductora, cuando aparece en los alrededores de la
celula, se introduce pasivamente en e.coli, se une al represor, este se deprende de la
región controladora y se puede realizar la transcripción. Posteriormente se realizará la
síntesis de β-galactosidasa y permeasa. La molécula de IPTG es absorbida por la bacteria
a través de la acción de la enzima permeasa de lactosa. Una vez dentro de la célula,
induce la transcripción del gen que codifica la β-galactosidasa, una enzima hidrolasa
que cataliza la hidrólisis de β-galactósidos a monosacáridos. IPTG : Agent inductor, es un
analeg no degradable de la lactosa, per tant hi haurà expressió continua dels gens (per
la proteína GST, en el plàsmit) 2 operons lac, un original de la celula, i un al plasmid. La β-
galactosidasa degrada la lactosa, per això utilitzem IPTG.

3. Consulta el Anexo 1 para responder qué tipo de molécula es el glutatión. Describe

la reacción catalizada por la GST.

El glutatión es un tripeptid : glutamat, cisteína, glicina (agent antioxidant) Reacción catalizada

por la GST : fa servir el seu grup tiol com agent reuctor, neutralitza especies reactives d’oxigen.



4. En el Anexo 2, busca las siguientes características de la resina Glutatión-Agarosa

utilizada: (a) Capacidad de unión. (b) % suspensión. (c) Composición química. Cuál
es la función de la azida sódica en la resina comercial? Qué capacidad de unión (mg
de GST) tienen los μL de resina utilizados en vuestra purificación?

Azida sódica : limpiar la columna, impide crecimientos bacterianos, inhibe la citocrom oxidasa
de células bacterianas.


5. Incluye la figura con los resultados obtenidos en el gel SDS-PAGE, e interpreta los
resultados:
 1 2 3 4 5 6 7 8 9

a. En las muestras E.T., se observan bandas diferentes en las muestras GST respecto las
muestras control?

Podemos observar en la imagen un primer carril donde se sembró el marcador de

pesosmoleculares. En el siguiente carril se cargó un extracto total del cultivo sin el gen
que recombina la GST, efectivamente vemos muchas bandas correspondientes a otras
proteínas pero no vemos especialmente marcada la banda del GST. No obstante en el
siguiente carril se cargó un extracto total del cultivo que recombino GST y se puede ver
la banda que hace referencia a su peso molecular más colorida.En el siguiente carril se
cargó un lisado por sonicación del cultivo de GST y coherentemente con lo esperado
observamos muchas bandas que determinan todas las proteínas extraídas por
sonicación y la banda de la GST bastante visible y marcada. Posteriormente se hizo la
purificación con resina glutatión agarosa con el objetivo de separar la GST del resto de
proteínas y esta muestra se cargó en el carril correspondiente a ES. Para el LNU se cargó
una muestra del lisado que la resina no unido y pudimos concretar que el proceso de
separación de GST con glutatión agarosa no es 100% eficaz para los volúmenes y
concentraciones de nuestro estudio ya que en ese carril también se observa, aunque
mucho menos colorida, una banda correspondiente a GST. En EG-1 y en el eG-2 también
observamos la misma banda aunque en el EG-1 la vemos más marcada. Las dos últimas
muestras son simplemente muestras de BSA, la primera más concentrada que la otra, y
como era de esperar observamos dos bandas a la misma altura pero una más marcada
que la otra que es la que corresponde a la muestra más concentrada.
b. Estima visualmente el peso molecular de las proteína GST.c. En las muestras GST,
interpreta los cambios en el patrón de proteínas observado entre las fracciones
ET, L.C., LNU, ES, EG-1 y EG-2. Según el marcador

Podemos observar que la GST tiene un peso molecular de unos 29-30 kDa

6. Para la purificación de GST, calcula el volumen total de cada fracción (LC, LNU, ES, EG-1
y EG-2) y el % de cada fracción cargado en el gel. 


Volumen LC : 10 ml. 0,16% cargado en el gel (16µl).

Volumen LNU : 1 ml. 1,6% cargado en el gel (16µl).

Volumen ES, EG-1 i EG-2 : 30 µl. 66,6% cargado en el gel (20µl)

7. En base a una estimación visual del gel, crees que en las fracciones eluidas con
SDS-PAGE tampón de Carga con β-mercaptoetanol (E.S.) y tampón de elución con
glutatión (EG) has recuperado toda la GST del lisado celular (LC)? Discute las
posibles causas que expliquen el resultado obtenido.

Pot ser que no s’unís per condicions de com es va fer la purificació (temps d’unió)


8. En las fracciones eluidas ES y EG, existe una banda única o se observan bandas
adicionales? A qué se podrían deber estas bandas adicionales? Cómo se podrían
reducir o eliminar? 

Altres bandes:

- Altres proteines
- Degradació : afegir altres inhibidors o afegir més PMSF

9. Explica la base bioquímica por la que la GST se eluye de la resina cuando utilizamos
SDS-PAGE Tampón de Carga con β-mercaptoetanol (ES) y tampón de elución con
glutatión (EG).