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PATENTES Y MARCAS
51 Int. Cl. : C12N 15/62
7
A61K 31/714
ESPAÑA
C07H 17/08
C12P 19/62
12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3
86 Número de solicitud europea: 97930626 .3
86 Fecha de presentación : 04.07.1997
87 Número de publicación de la solicitud: 0909327
87 Fecha de publicación de la solicitud: 21.04.1999
54 Título: Eritromicinas y procedimiento para su preparación.
30 Prioridad: 05.07.1996 GB 9614189
73 Titular/es: Biotica Technology Limited
19.08.1996 US 24188 P 112 Hills Road
28.05.1997 GB 9710962 Cambridge CB2 1PH, GB
PFIZER Inc.
45 Fecha de publicación de la mención BOPI:
72 Inventor/es: Leadlay, Peter, Francis;
01.12.2005 Staunton, James;
Cortes, Jesus y
Pacey, Michael Stephen
45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:
74 Agente: Ponti Sales, Adelaida
01.12.2005
ES 2 244 001 T3
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de
la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se
considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del
Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 244 001 T3
DESCRIPCIÓN
Eritromicinas y procedimiento para su preparación.
5 Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a nuevos policétidos, así como a procedimientos y medios para su preparación, y
específicamente a nuevas eritromicinas que son útiles como agentes antibacterianos y antiprotozoarios y otras aplica-
ciones (por ejemplo, anticancerígenos, aterosclerosis, reducción de motilidad gástrica, etc.) en mamíferos, incluyendo
10 al hombre, así como en peces y aves. Esta invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen
los nuevos compuestos, y a métodos para tratar infecciones bacterianas y protozoarias en mamíferos, peces y aves,
mediante la administración de los compuestos a mamíferos, peces y aves que requieran de dicho tratamiento.
Los genes biosintéticos de policétidos o porciones de estos, los cuales se pueden derivar a partir de diferentes
15 sectores de genes biosintéticos de policétidos, son manipulados para permitir la producción de las nuevas eritromi-
cinas.
Los policétidos son de una clase estructuralmente muy grande y diversa de productos naturales que incluyen mu-
chos compuestos que poseen propiedades antibióticas y otras propiedades farmacológicas, tales como la eritromicina,
20 tetraciclinas, rapamicina, avermectina, ionóforos de poliéter y FK506. En particular, los policétidos son producidos
abundantemente por medio de Streptomyces y bacterias de actinomicetos relacionadas. Estos son sintetizados median-
te condensación consecutiva repetida, de una manera análoga a la de la biosíntesis de ácido graso. La mayor diversidad
estructural encontrada entre los policétidos naturales proviene de la selección de (usualmente) acetato o propionato
como unidades de “iniciación” o de “extensión”; y del grado variable del procesamiento del grupo β-ceto, observa-
25 do después de cada condensación. Ejemplos de las etapas de procesamiento incluyen la reducción a β-hidroxiacilo,
reducción seguida por la deshidratación a 2-enoilo y la reducción completa del aciltioéster saturado. El resultado es-
tereoquímico de estas etapas de procesamiento también se especifican para cada ciclo de extensión de cadena. La
biosíntesis de los policétidos es iniciada por un grupo de enzimas formadoras de cadena conocidas como sintasas
de policétidos. Se han descrito dos clases de sintasa de policétido (PKS) en actinomicetos. Sin embargo, los nuevos
30 policétidos y procesos objeto de esta invención son sintetizados por sintasas de policétidos para los macrólidos de
eritromicina, avermectina y rapamicina (Figura 1) y consiste en un grupo o “módulo” diferente de enzimas para cada
ciclo de extensión de cadena de policétidos (Figura 2ª) Cortes, J. et al. Nature (1990) 348:176-178; Donadio, S. et al
Science (1991) 252:675-679; MacNeil, D. J. et al. Gene (1992), 115:119-125; Schwecke, T.et al, Proc. Natl. Acad. Sci.
EUA (1995) 92:7839-7843. Nota: el término “módulo natural” tal y como se usa aquí mismo, se refiere al grupo de
35 dominios contiguos, desde un gen de β-cetoacilsintasa (“KS”) al siguiente gen de proteína portadora de acil (“ACP”),
el cual lleva a cabo un ciclo de extensión de cadena de policétido. El término “módulo combinatorio” es usado para
referirse a cualquier grupo de dominios contiguos (y partes de dominio) que se extienden desde el primer punto de
un primer módulo natural, a un segundo punto equivalente de un segundo módulo natural. El primer y segundo punto
generalmente estarán en los dominios del núcleo, los cuales están presentes en todos los módulos, es decir, ambos
40 en puntos equivalentes de dominios KS, AT (acil transferasa), ACP respectivos, o en regiones de enlace entre los
dominios.
La Figura 2a muestra la organización de los genes de la sintasa de policétido productora de eritromicina, (también
conocida como sintasa B 6-desoxieritronolida, DEBS). Tres marcos de lectura abiertos codifican los polipéptidos
45 DEBS. Los genes están organizados en seis módulos designados de unidades repetidas. El primer marco de lectura
abierto codifica a la primera multienzima o casete (DEBS1)la cual consiste en tres módulos: el módulo de carga (carga
ery) y dos módulos de extensión (módulos 1 y 2). El módulo de carga comprende una transferasa de acilo y una
proteína portadora de acilo. Esto puede contrastarse con la Figura 1 de WO93-13663 (referida arriba). Esta muestra
ORF1, para consistir en solo dos módulos, el primero de los cuales, es de hecho el módulo de carga y el primer módulo
50 de extensión.
La eliminación en marco de la parte de ADN codificadora del dominio de la cetoreductasa del módulo 5 en el
DEBS, ha mostrado conducir a la formación de análogos de eritromicina 5,6-dideoxi-3-micarosil-5-ocoeritronolida
B, 5,6-dideoxi-5-oxoeritronolida B y 5,6-dideoxi-6, 6-epoxi-5-oxoeritronolida B (Donadio, S, et al. Science, (1991)
55 252:675-679). De la misma manera, la alteración de los residuos de sitio activos en el dominio de enoilreductasa del
módulo 4 en el DEBS, por medio de ingeniería genética del ADN codificador de sintasa de policétido correspondien-
te y su introducción dentro de Saccharopolyspora erythraea condujo a la producción de 6,7-anhidroeritromicina C
(Donadio S, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA (1993) 90:7119-7123).
60 En la Solicitud de Patente Internacional número WO 93/13663, la cual está incorporada en su totalidad aquí por
referencia, describe tipos adicionales de manipulación genética de los genes DEBS que son capaces de producir poli-
cétidos alterados. Sin embargo, se ha indicado que muchos de los intentos de este tipo son improductivos (Hutchinson
C. R. y Fuji, I. Annu. Rev. Microbiol.(1995) 49:201-238, en la pág. 231). Ha sido descubierta la secuencia de ADN
completa de los genes procedentes de Streptomyces hygroscopicus que codifican a la sintasa de policétido Tipo I mo-
65 dular que gobierna la biosíntesis de la rapamicina de policétido inmunosupresora macrocíclica, ha sido descubierta
(Schwecke, T. et al. (1995) Proc. Natl. Acd. Sci. EUA 92:7839-7843) (Figura 3). La secuencia de ADN se deposita en
la Base de Datos EMBL/Genbank bajo el número de acceso X86780.
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A pesar de que se ha identificado un gran número de policétidos terapéuticamente importantes, existe todavía la
necesidad de obtener unos nuevos policétidos que tengan propiedades mejoradas o posean una bioactividad comple-
tamente nueva. Los policétidos complejos producidos por las sintasas de policétidos Tipo I modulares son particular-
mente valiosos, ya que éstos incluyen una actividad conocida como antihelmínticos, insecticidas, inmunosupresores,
5 fungicidas y/o agentes antibacterianos. A causa de su complejidad estructural, dichos policétidos nuevos no pueden
ser obtenidos inmediatamente mediante síntesis química total, o mediante modificaciones químicas de los policétidos
conocidos. Un aspecto de la invención surge de nuestra apreciación de que un ensamblaje del gen sintasa de policé-
tido Tipo I codifica un módulo cargador el cual es seguido por los módulos de extensión. Es particularmente útil el
proporcionar un ensamblaje del gen de sintasa de policétido híbrido en el cual el módulo de carga sea heterogéneo
10 a los módulos de extensión y que conduzca a un policétido que tenga una cantidad de iniciación alterada. Este es un
concepto un tanto desconocido para el estado de la técnica anterior, ya que éste no reconoce la existencia de los módu-
los de carga. WO93/13663 se refiere a la alteración de los genes sintasa de policétido mediante la inactivación de una
sola función (es decir, un solo enzima) para afectar “a un módulo completo” por medio de la eliminación, inserción o
reemplazo de este mismo. El ensamblaje de carga, en sus términos, no es un módulo.
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Si el módulo de carga es uno que acepta muchas unidades de ácido carboxílico diferentes, entonces el ensamblaje
del gen híbrido puede ser usado para producir muchos policétidos diferentes. Por ejemplo, un ensamble de gen híbrido
puede emplear ácido nucleico que codifique un módulo de carga avr con módulos de extensión ery. Un módulo de carga
puede aceptar unidades de ácido no naturales y derivados de estas mismas; el módulo de carga avr es particularmente
20 útil en este sentido (Dutton et al., (1991) J. Antibiot., 44:357-365). Además, es posible determinar la especificidad
del módulo de carga natural para unidades de iniciación no naturales y para tomar ventaja de la especificidad relajada
del módulo de carga para generar policétidos nuevos. De esta manera, otro aspecto de la invención, es la capacidad
inesperada del módulo de carga ery para incorporar ácidos carboxílicos no naturales y derivados de estos mismos,
para producir nuevas eritromicinas y cepas productoras de eritromicina que contengan únicamente genes DEBS. Por
25 supuesto, se pueden hacer también alteraciones de un policétido producto, particularmente reemplazando un módulo
de extensión, por uno que dé una unidad de cétido en un estado de oxidación diferente y/o con una estereoquímica
diferente. Se ha asumido generalmente que la estereoquímica de los grupos metilo en la cadena de policétido, se de-
termina mediante la aciltransferasa, pero es de hecho, una característica de otros dominios de la sintasa de policétido
y así está abierta a la variación solamente mediante el reemplazo de aquellos dominios individualmente o mediante el
30 reemplazo del módulo. Pueden añadirse o eliminarse el metilo u otros sustituyentes mediante el reemplazo total del
módulo. Consecuentemente, se hace aparente para aquellos expertos en la materia, que es posible combinar el uso de
la especificidad de sustrato relajada del módulo de carga de eritromicina con el reemplazo del módulo de extensión
y la sustitución del módulo de carga híbrido, como un mecanismo para producir un amplio rango de nuevas eritro-
micinas. Así, esta invención describe la producción de nuevas eritromicinas mediante organismos no transformados
35 y también dichos ensamblajes de genes, vectores que contienen dichos ensamblajes de genes, y organismos transfor-
mantes que puedan expresar estos, para producir nuevas eritromicinas en organismos transformados. Los organismos
transformantes pueden albergar plásmidos recombinantes o se pueden integrar los plásmidos. Un plásmido con una
secuencia int se integrará dentro de un sitio de adhesión específico (atf) dentro de un cromosoma de un hospedador.
Los organismos transformantes pueden ser capaces de modificar los productos iniciales, por ejemplo, al llevar a cabo
40 todas o algunas de las modificaciones biosintéticas normales en la producción de eritromicinas (como se muestra en
la Figura 2B). Sin embargo, puede hacerse uso de organismos mutantes de tal manera, que algunos de las vías de paso
normales sean bloqueadas, por ejemplo, para producir productos sin uno o más grupos hidroxi “naturales” o grupos de
azúcares, por ejemplo como se describe en WO 91/16334 o Weber et al. (1995) J. Bacteriol. 164:425-433 los cuales
están incorporados aquí en su totalidad, para su referencia. Alternativamente, puede hacerse uso de organismos en los
45 cuales algunas de las vías de paso normales sean sobreexpresadas para superar etapas limitantes de la velocidad poten-
ciales, en la producción del producto deseado, por ejemplo como se describe en WO 97/06266 la cual es incorporada
en su totalidad aquí, para su referencia.
Este aspecto del procedimiento concierne ampliamente con el tratamiento de los módulos del gen de sintasa de
50 policétido, como bloques de construcción que pueden ser usados para construir los sistemas de enzimas y así, de
productos de nuevas eritromicinas de los tipos deseados. Esto involucra generalmente el partir y ensamblar los módulos
y los agrupamientos de módulos múltiples. Los lugares lógicos para hacer y romper las conexiones intermodulares
son las regiones de enlace que están entre los módulos. Sin embargo, puede ser preferible hacer los cortes y uniones
adentro de los dominios (es decir, las porciones codificadoras de enzimas), cerca de los extremos de éstos. El ADN está
55 altamente conservado aquí, entre todas las sintasas de policétidos modulares y esto puede ayudar en la construcción
de híbridos que puedan ser transcritos. Esto también ayuda a mantener el espacio de los sitios activos de las enzimas
codificadas, lo cual puede ser importante. Por ejemplo, al producir un gen híbrido mediante el reemplazo de un módulo
de carga ery por un módulo de carga avr, se eliminó el módulo ery junto con una pequeña cantidad del siguiente
dominio de cetosintasa (KS). El inicio del dominio KS (lo suficientemente espaciado del sitio activo) es altamente
60 conservado y, por lo tanto, proporciona un sitio de empalme apropiado como alternativa a la región de enlace que está
entre el dominio de carga y el inicio del dominio KS. El módulo ery extraído fue entonces reemplazado por un módulo
de carga avr.
De hecho, cuando se sustituye un módulo de carga, es deseable reemplazar, no solo los dominios de los módulos
65 de carga (generalmente aciltransferasa (AT) y proteína portadora de acilo (ACP)), sino también la cetosintasa que
está en el inicio del siguiente módulo de extensión. Típicamente el módulo de carga extraído habría proporcionado un
iniciador de propionato y el reemplazo tiene el objetivo de proporcionar uno o más iniciadores diferentes. Sin embargo,
el propionato puede alimentarse dentro del módulo de extensión desde un depósito de propionato en la célula huésped,
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conduciendo a la disolución de los productos deseados. Esto se puede evitar en parte sustituyendo un módulo de carga
extendido que incluya todo o la mayoría del dominio de KS. (El sitio de empalme puede estar en la región del extremo
del gen de KS o en el comienzo del siguiente gen AT, o en la región de enlace que está entre ellos).
5 Cuando se reemplazan “módulos”, no se restringe, solo, a módulos “naturales”. Por ejemplo, un “módulo combi-
natorio” que va a ser extraído y/o reemplazado y/o insertado puede extenderse desde el dominio correspondiente de
dos módulos de tipo natural, por ejemplo, desde el AT de un módulo hasta el AT del siguiente, o desde KS hasta KS.
Los sitios de empalme estarán en las correspondientes regiones marginales conservadas o en las regiones de enlace.
Un módulo combinatorio también puede ser “doble” o múltiple mayor, para añadir 2 o más módulos al mismo tiempo.
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En un aspecto adicional, la invención proporciona nuevas eritromicinas obtenibles mediante los aspectos previos.
Estos incluyen los siguientes:
(i) Un análogo de eritromicina (siendo un compuesto macrólido con un anillo de 14 miembros) en el cual, C-13
15 soporta una cadena lateral diferente de etilo, generalmente un grupo alquilo C3 -C6 de cadena recta, un grupo alquilo
C3 -C8 ramificado, un grupo cicloalquilo o cicloalquenilo C3 -C8 (sustituido opcionalmente, por ejemplo, por uno o
más grupos alquilo C1−4 o alcoxi de hidroxi o átomos de halógeno), o un heterociclo de 3-6 miembros que contiene
O u S, saturado o parcial o totalmente insaturado, sustituido opcionalmente (como por cicloalquilo), o R1 es fenilo el
cual puede estar opcionalmente sustituido por, al menos, un sustituyente seleccionado de alquilo C1 -C4 , alcoxi C1 -C4
20 y grupos alquiltio C1 -C4 , átomos de halógeno, trifluorometilo y ciano; o R1 puede ser un grupo con una Fórmula (a)
como se muestra abajo:
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en donde x es O, S o -CH-, a, b, c y d son cada uno independiente O-2 y a + b + c + d ≤ 5. Los candidatos preferidos
para el sustituyente R en C-13, son los grupos de unidades de carboxilato RCOOR, utilizables como sustratos mediante
un módulo iniciador avr, o variantes de iniciador de rapamicina. Los sustratos preferidos son los ácidos carboxílicos
35 RCOOH. Los sustratos alternativos que se pueden utilizar de manera efectiva son las sales de ácido carboxílico, los
ésteres de ácido carboxílico o las amidas. Los ésteres preferidos son los tioésteres de N-acetil-cisteamina los cuales
pueden ser utilizados inmediatamente como sustratos por el módulo iniciador avr, tal y como está ilustrado en Dutton
et al. en EP 0350187, la cual está incorporada en su totalidad aquí, por referencia. Las amidas preferidas son los
imidazoles de N-acil. Otros sustratos alternativos que se pueden utilizar, son derivados que son precursores oxidativos
40 de los ácidos carboxílicos; así, por ejemplo sustratos adecuados pueden ser los aminoácidos de la fórmula RCH (NH2 )
COOH, ácidos glioxílicos de la fórmula RCOCOOH, derivados de metilamina de la fórmula RCH2 NH2 , derivados
de metanol de la fórmula RCH2 OH, aldehídos de la fórmula RCHO o ácidos alcanóicos sustituidos de la fórmula R
(CH2 )n COOH en donde n es 2, 4 ó 6. Así, ejemplos de los sustratos preferidos incluyen al isobutirato (R=i-Pr) y 2-
metilbutirato (R=1-metilpropil). Otras posibilidades incluyen al n-butirato, carboxilato de ciclopropilo, carboxilato
45 de ciclobutilo, carboxilato de ciclopentilo, carboxilato de ciclohexilo, carboxilato de cicloheptanilo, carboxilatos de
ciclohexenilo, carboxilatos de cicloheptanilo y variantes metiladas en anillo, de carboxilatos cíclicos y los derivados
de éstos anteriormente mencionados.
El análogo de eritromicina puede corresponder al producto inicial de una sintasa de un PKS (6-desoxieritronolida)
50 o el producto conseguido después de uno o más pasos biosintéticos normales. Como se muestra en la Figura 2B, estos
comprenden: 6-hidroxilación; 3-0-glicosilación; 5-0-glicosilación; 12-hidroxilación; y metilación de azúcar específica.
De esta manera, los análogos pueden incluir aquellos correspondientes a 6-desoxieritronolida B, eritromicina A, y
los diversos intermediarios y alternativos (a pesar de no estar limitados a éstos) mostrados en la Figura 2B.
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(ii) Análogos de eritromicina que difieren del compuesto “natural” correspondiente (Figura 2B) en el estado de
oxidación de una o más unidades de cétidos (es decir, la selección de alternativas de entre el grupo: -CO-, -CH(OH)-,
-CH-, y -CH2 -).
60 La estereoquímica de cualquiera de -CH(OH)- es también independientemente seleccionable.
(iii) Análogos de eritromicina que difieren del compuesto “natural” correspondiente en la ausencia de una cadena
lateral de metilo “natural” (esto se consigue mediante el uso de una variante de AT). Los módulos de extensión
normales usan tanto unidades C2 como C3 para proporcionar unidades de cétidos sin metilar o metiladas. Se pueden
65 proporcionar unidades no metiladas en donde las unidades metiladas sean naturales (y viceversa, en sistemas en donde
existen unidades no metiladas naturalmente) y también proporcionar unidades más grandes, por ejemplo, C4 para
proporcionar sustituyentes de etilo.
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(iv) Análogos de eritromicina que difieran del compuesto “natural” correspondiente en la estereoquímica del metilo
“natural”; y/o sustituyentes de anillo diferentes al metilo.
(v) Análogos de eritromicina que tengan las características de dos o más de las secciones (i) a (iv).
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(vi) Derivados de cualquiera de los anteriores, que hayan experimentado procesos adicionales hechos por enzimas
que no sean PKS, por ejemplo, una o más hidroxilación, epoxidación, glicosilación o metilación.
En un aspecto adicional de la presente invención, se introduce un plásmido que contenga ADN de PKS “dona-
35 dora” en una célula hospedadora bajo condiciones en donde el plásmido se integra dentro de los genes DEBS del
cromosoma de la cepa productora de eritromicina mediante recombinación homogénea, para crear una PKS híbrida.
Una realización preferida es cuando un ADN de PKS donadora incluye un segmento que codifica un módulo de carga
de tal manera, que éste módulo de carga se ligue a los genes DEBS en el cromosoma. Dicha PKS híbrida produce
valiosos y nuevos productos de eritromicina, cuando se cultiva bajo condiciones apropiadas, como se ha descrito aquí
40 mismo. Específicamente, cuando el módulo de carga de los genes DEBS es reemplazado por el módulo de carga de la
PKS productora de avermectina (avr), los nuevos productos de eritromicina contienen una unidad iniciadora típica de
aquéllas usadas por la sintasa de policétido de avr. De esta manera, cuando el módulo de carga de la PKS de ery es
reemplazada por el módulo de carga de avr, se encuentra que las cepas de Saccharopolyspora erythraea que contienen
dicho híbrido de PKS, producen macrólidos de 14 miembros que contienen unidades iniciadoras típicamente utilizadas
45 por la PKS de avr.
Es inesperado que se encuentre que los policétidos de macrólidos de 14 miembros producidos por dichas células
recombinantes de S. erythraea, incluyan derivados de eritromicina A, mostrando que son llevados a cabo correcta-
mente los diversos pasos del proceso, requeridos para la transformación de los productos del híbrido de PKS en unos
50 nuevos y terapéuticamente valiosos derivados de eritromicina A. Un aspecto adicional de la presente invención es el
hallazgo inesperado y sorprendente de que la transcripción de cualquiera de los genes de eritromicina híbridos se pue-
de incrementar, específicamente, cuando los genes híbridos se someten al control de un promotor de un gen de PKS
de Tipo II, enlazado a un gen activador específico para este promotor. Es particularmente destacable que cuando una
célula manipulada genéticamente contiene genes de eritromicina híbridos bajo dicho control es cultivada bajo condi-
55 ciones apropiadas para la producción de eritromicina, se producen niveles significativamente mejorados de la nueva
eritromicina. Dichos incrementos específicos en la obtención de un producto valioso de eritromicina, también se han
visto en PKS de eritromicina natural colocada bajo el control de un promotor de PKS Tipo II y un gen activador. En
una realización preferida, los genes deseados presentes en un plásmido derivado de SCP2*, se colocan bajo el control
de un promotor actI bidireccional derivado del sector del gen biosintético de actinorhodina de Streptomyces coelicolor
60 y en el cual el vector también contiene el gen estructural que codifica a la proteína activadora específica Act II-orf
4. El plásmido recombinante se introduce en la Saccharopolyspora erythraea, bajo condiciones en donde ya sea los
genes de PKS introducidos o los genes de PKS ya presentes en la cepa hospedadora, se expresan bajo el control del
promotor actI.
65 Dichas cepas producen el producto de eritromicina deseado y el gen activador requiere solamente la presencia del
promotor específico con el fin de mejorar la eficiencia de transcripción procedente del promotor. Esto es particular-
mente sorprendente, ya que los activadores de la familia de actII-orf4 no pertenecen a una clase reconocida de las
proteínas de unión de ADN. En consecuencia, puede esperarse que proteínas adicionales u otros elementos de con-
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trol puedan requerirse para que tenga lugar la activación en un hospedador heterogéneo no conocido para producir
actinorhodina u otro pigmento de isocromanoquinona relacionado. También es sorprendente y útil que las cepas re-
combinantes puedan producir un producto de eritromicina más de diez veces, que cuando los mismos genes de PKS
están bajo el control de un promotor natural y el producto de eritromicina específico también se producido precoz-
5 mente en un cultivo en crecimiento, en lugar de solamente durante la transición desde el crecimiento hasta la fase
estacionaria. Dichas eritromicinas son útiles como antibióticos y para muchos otros propósitos en medicina humana y
veterinaria. De esta manera, cuando la célula manipulada genéticamente es Saccharopolyspora erythraea, el activador
y el promotor son derivados del sector del gen de PKS de actinorhodina y el sector del gen de PKS de ery regulado
por actI/actII-orf4 es depositado en el cromosoma siguiendo la integración específica de sitio de un vector de plás-
10 mido de bajo número de copias, cultivando estas células bajo condiciones apropiadas se puede producir un producto
de macrólido de 14 miembros de más de diez veces en total, que una cepa comparable que no esté bajo condiciones
de control heterogéneo. Cuando en una célula manipulada genéticamente tal como Saccharopolyspora erythraea, los
genes de PKS bajo este control heterogéneo son genes de PKS Tipo I híbridos cuya construcción está descrita aquí
mismo, pueden obtenerse más de diez veces de producto de policétido híbrido, comparándose con los mismos genes
15 de sintasa de policétido Tipo I híbridos que no estén bajo dicho control. Específicamente, cuando los genes híbridos de
PKS Tipo I son genes de PKS de ery, en los cuales el módulo cargador es reemplazado por el módulo de carga avr, se
encuentra un incremento de diez veces en las cantidades totales de los nuevos macrólidos de 14 miembros producidos
por las células manipuladas genéticamente, cuando se cultivan bajo condiciones apropiadas como se ha descrito aquí
mismo anteriormente.
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Los medios apropiados y preferidos para desarrollar las células productoras de eritromicina diseñadas genética-
mente y sin transformar y los medios apropiados y preferidos para el aislamiento, identificación y utilidad práctica de
las nuevas eritromicinas están descritos más ampliamente en los ejemplos.
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en donde x es O, S o -CH2 -, a, b, c y d son cada uno independientemente O-2 y a + b + c + d = 5.
R2 es H o OH; R3 -R5 son cada uno, independientemente H, CH3 o CH2 CH3 ; R6 es H u OH; y R7 es H, CH3 , o
CH2 CH3 ; R8 es H o desosamina; R9 es H, CH3 o CH2 CH3 ; R10 es OH, micarosa (R13 es H), o cladinosa (R13 es CH3 ),
15
R11 es H; o R10 = R11 = O; y R12 es H, CH3 , o CH2 CH3 .
En la definición de arriba, los grupos alquilo que contienen 3 o más átomos de carbono pueden ser de cadena lineal
o ramificada. Halo significa flúor, cloro, bromo o yodo. Alfa-ramificado significa que el carbono que está unido en la
posición C-13 es un átomo de carbono secundario enlazado a dos átomos de carbono adicionales, el remanente de la
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cadena alquilo puede ser una cadena lineal o ramificada.
Los compuestos preferidos de la fórmula 1 son aquellos en donde R3 -R5 , R7 , R9 y R12 son CH3 y R1 es isopropilo
o sec-butilo, 2-buten-2-ilo, 2-penten-2-ilo o 4-metil-2-penten-2-ilo opcionalmente sustituidos por uno o más grupos
hidroxilos. También son preferidos los compuestos de fórmula 1 en donde R3 -R5 , R7 , R9 y R12 son CH3 y R1 es
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cicloalquilo o cicloalquenilo C3 -C6 , el cual puede estar opcionalmente sustituido por uno o más grupos hidroxilo o
uno o más grupos alquilo C1 -C4 . En un grupo adicional de los compuestos preferidos, R1 es un anillo heterocíclico
que contiene oxígeno o azufre de 5 ó 6 miembros, particularmente un anillo 3-tienilo o 3-furilo el cual puede estar
opcionalmente sustituido por uno o más grupos hidroxilo o uno o más grupos alquilo C1 -C4 o átomos de halógeno. En
otro grupo de compuestos preferidos, R1 es un grupo alquiltioalquilo C3 -C6 , particularmente un grupo 1-metiltioetilo.
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Otras realizaciones específicas de la presente invención incluyen los compuestos de la fórmula 2:
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R1 es H, alquilo C1 -C8 , alquenilo C2 -C8 , alquinilo C2− C8 , alcoxialquilo o alquiltioalquilo que contiene de 1 a 6
átomos de carbono en cada grupo alquilo o alcoxi en donde cualquiera de dichos grupos alquilo, alcoxi, alquinilo
o alquinilo pueden estar sustituidos por uno o más grupos hidroxilo o por uno o más átomos de halo; o por un
65 cicloalquilo C3 -C8 o cicloalquenilo C5 -C8 cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido por metilo o
uno o más grupos alquilo C1 -C4 o átomos de halo; o un anillo heterocíclico de 3 a 6 miembros que contiene oxígeno o
azufre que puede estar saturado, o total o parcialmente insaturado, el cual puede estar opcionalmente sustituido por uno
o más grupos alquilo C1 -C4 o átomos de halo; o un grupo de la fórmula SR14 en donde R14 es alquilo C1− C8 , alquenilo
7
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C2 -C8 , alquinilo C2 -C8 , cicloalquilo C3 -C8 , cicloalquenilo C5 -C8 fenilo o fenilo sustituido en donde el sustituyente es
alquilo C1 -C4 , alcoxi C1 -C4 o halo, o anillo heterocíclico de 3 a 6 miembros que contiene oxígeno o azufre que puede
ser saturado o total o parcialmente insaturado y el cual puede estar opcionalmente sustituido por uno o más grupos
alquilo C1 -C4 o átomos de halo.
5
R2 es H u OH; R3 -R5 son cada uno, independientemente H, CH3 o CH2 CH3 ; R6 es H u OH; y R7 es H, CH3 , o
CH2 CH3 ; R8 es H o desosamina; R9 es H,CH3 o CH2 CH3 ; R10 es OH, micarosa (R13 es H), o cladinosa (R13 es CH3 ),
R11 es H; o R10 = R11 = O; y R12 es H, CH3 , o CH2 CH3 , con la condición de que cuando R3 -R5 sean CH3 , R7 sea CH3 ,
R9 sea CH3 y R12 sea CH3 , entonces R1 no es H o alquilo C1 .
10
En la definición de arriba, los grupos alquilo que contienen 3 o más átomos de carbono pueden ser de cadena lineal
o ramificada. Halo significa flúor, cloro, bromo o yodo.
Los compuestos preferidos de la fórmula 2 son aquellos en donde R3 -R5 son CH3 , R7 es CH3 , R9 es CH3 y R12 es
15 CH3 y R1 es SR14 en donde R14 es metilo o etilo. En otro grupo de los compuestos preferidos, R1 metilo, isopropilo o
sec-butilo, los cuales pueden estar sustituidos por uno o más grupos hidroxilo. En un grupo adicional de compuestos
preferidos, R1 es un grupo alquilo C3 -C8 ramificado sustituido por uno o más grupos hidroxilo o uno o más átomos
halo, particularmente 1-(trifluorometil)etilo.
20 La invención también se refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento de una infección bacteriana
o una infección protozoaria en un mamífero, pez o ave, que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de
un compuesto de fórmula 1 o de fórmula 2 o una sal farmacéuticamente aceptable de este mismo y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
25 La invención también se refiere a un método para tratar una infección bacteriana o protozoaria en un mamífero,
pez o ave, la cual comprende administrar a dicho mamífero, pez o ave, una cantidad terapéuticamente efectiva de un
compuesto de fórmula 1 o de fórmula 2 o una sal farmacéuticamente aceptable de éste mismo.
El término “tratamiento” tal y como se utiliza aquí, a menos que se indique lo contrario, incluye al tratamiento o
30 prevención de una infección bacteriana o una infección protozoaria, tal y como se provee en el método de la presente
invención.
Tal y como se utiliza aquí, a menos que se indique lo contrario, los términos “infección(es) bacteriana(s)” e “infec-
ción(es) protozoaria(s)” incluyen las infecciones bacterianas e infecciones protozoarias que ocurren en los mamíferos,
35 peces y aves así como los desórdenes relacionados con las infecciones bacterianas e infecciones protozoarias que se
puedan tratar o evitar mediante la administración de antibióticos tales como los compuestos de la presente invención.
Dichas infecciones bacterianas e infecciones protozoarias y desórdenes relacionadas con dichas infecciones, incluyen
a las siguientes: neumonía, otitis media, sinusitis, bronquitis, tonsilitis y mastoiditis, relacionadas con la infección por
Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Staphilococcus aureus, o Staphilococ-
40 cus aureus, o Peptostreptococcus spp.; faringitis, fiebre reumática y glomerulonefritis relacionadas con la infección
por Streptococcus pyogenes, estreptococo de Grupos C y G, Clostridium diphtheriae o Actinobacillus haemolyticum;
infecciones del tracto respiratorio relacionadas con la infección por Mycoplasma pneumoniae, Legionalla pneumophi-
la, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae o Chlamydia pneumoniae; infecciones de la piel o de tejidos
blandos sin complicaciones, abscesos y osteomielitis y fiebre puerperal relacionada con la infección por Staphylococ-
45 cus auerus, estafilococos de coagulasa positiva (es decir, S. epidermis, S. hemolyticus, etc.), Streptococcus pyogenes,
Streptococcus agalactiae, grupos estroptocócicos C-F (estreptococos de colonia en minuto), Streptococcus viridians,
Corynebacterium minutissimum, Clostridium spp., o Bartonella henselae; infecciones del tracto urinario agudas sin
complicaciones relacionadas con la infección por Staphylococcus saprophitycus o Enterococcus spp.; uretritis y cer-
vicitis y enfermedades transmitidas por vía sexual relacionadas con la infección por Chlamydia trachomatis, Hae-
50 mophilus ducreyi, Treponema pallidum, Ureaplasma urealyticum, o Neiserria gonorrheae; enfermedades de toxinas
relacionadas con la infección por S. aureus (envenenamiento de alimento y Síndrome de choque tóxico) o estreptoco-
cos de Grupos A, B y C; úlceras relacionadas con la infección por Helicobacter pylori; síndromes febriles sistémicos
relacionados con la infección por Borrelia recurrentis; Enfermedad de lima relacionada con la infección por Borrelia
burgdorfen; conjuntivitis, queratitis y dracocistitis relacionadas con la infección por Chlamydia trachomatis, Neisseria
55 gonorrheae, S. aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes, H. influenzae, o Listeria spp.; enfermedad de complejo (MAC)
Mycobacterium avium diseminada relacionada con la infección por Mycobacterium avium o Mycobacterium intrace-
llulare; gastroenteritis relacionada con la infección por Campylobacter jejuni; protozoa intestinal relacionada con la
infección por Cryptosporidium spp.; infección odontogéneca relacionada con la infección por Streptococcus viridians;
tos persistente relacionada con la infección por Bordatella Pertussis; gangrena de gas relacionada con la infección por
60 Clostridium perfringens o Bacteroides spp.; y aterosclerosis relacionada con la infección por Helicobacter pylori o
Chlamydia pneumoniae. Las infecciones bacterianas e infecciones protozoarias y desórdenes relacionados con dichas
infecciones que pueden ser tratadas o evitadas en animales incluyen los siguientes: enfermedad respiratoria de bovino
relacionada con la infección por P. Haem., P. multocida, Micoplasma bovis, o Bordetella spp., enfermedad entérica
de vaca relacionada con la infección por E. coli o protozoa (es decir, Coccidia, criptosporidia, etc.); mastitis de vaca
65 lechera relacionada con la infección por Staph. Aureus, Streptococcus uberis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus
dysgalactiae, Klebsiella spp., Corynebacterium o Enterococcus spp.; enfermedad respiratoria de porcino relacionada
con la infección por A. pleuro, P. multocida, o Micoplasma spp.; enfermedad entérica de porcino relacionada con
la infección por E. coli, Lawsoniaintracellularis, Salmonella, o Serpullina hyodysinteriae; úlcera de piel infecciosa
8
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de vaca relacionada con la infección por Fusobacterium spp.; metritis vacuna relacionada a la infección por E. coli;
verrugas velludas de vacuno relacionadas con la infección por Fusobacterium necrophorum o Bacteriodes nodosus;
ojo rosa de vacuno relacionado con la infección por Moraxella bovis; aborto prematuro de vacuno relacionado con
la infección por protozoa (es decir, neosporium); infección del tracto urinario en perros y gatos relacionada con la
5 infección por E. coli; infecciones de la piel y de tejidos blandos en perros y gatos relacionadas con la infección por
Staph.epidermis, Staph.intermedius, Staph, de coagulasa negativa o P. multocida; e infecciones bucales o dentales
en perros y gatos, relacionadas con la infección por Alcaligenes spp., Bacteriodes spp., Clostridium spp., Entero-
bacter spp., Eubacterium, Peptostreptococcus, Porphyromonas o Prevotella. Otras infecciones bacterianas e infec-
ciones protozoarias y desórdenes relacionados con dichas infecciones que pueden ser tratados o evitados de acuerdo
10 con el método de la presente invención se hace referencia en J.P. Sanford et al., “The Sanford Guide To Antimicro-
bial Therapy” 26º edición, (Antimicrobial Therapy Inc. 1996). También se ha hecho gradualmente evidente que los
compuestos de esta invención pueden tener utilidad considerable en el tratamiento de estados de enfermedades (por
ejemplo, cáncer, SIDA y aterosclerosis) que no están normalmente asociadas a infecciones bacterianas ni infecciones
protozoarias.
15
Cuando se utiliza en el tratamiento de una infección bacteriana o un desorden relacionado con una infección
bacteriana o cáncer en un mamífero, tal como un humano, pez o ave, puede ser administrado un compuesto de fórmula
1 o de fórmula 2, solo o en forma de una composición farmacéutica que comprenda al compuesto y un diluyente o
excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones pueden ser administradas oralmente, por ejemplo en
20 forma de pastillas o cápsulas, o parenteralmente, que incluye la inyección subcutánea e intramuscular. Los compuestos
de fórmula 1 o de fórmula 2 pueden ser administrados también rectalmente, tal como la aplicación mediante un
supositorio. El portador farmacéuticamente aceptable dependerá del modo de administración usado. Por ejemplo,
se pueden utilizar como portadores farmacéuticamente aceptables en pastillas lactosa, citrato de sodio, y sales de
ácido fosfórico, junto con agentes desintegrantes (tales como almidón)y agentes lubricantes (tales como esterato de
25 magnesio, lauril sulfato de sodio y talco). También, para usarse en cápsulas, los portadores útiles farmacéuticamente
aceptables son la lactosa y polietilenglicoles de alto peso molecular (por ejemplo, con pesos moleculares de entre
2,000 y 4,000). Para uso parenteral se pueden preparar soluciones estériles o suspensiones en donde el excipiente
farmacéuticamente aceptable sea acuoso (por ejemplo, agua, dextrosa isotónica o solución salina isotónica) o no
acuosas (aceites grasos de origen vegetal, tales como aceite de algodón o de cacahuete, de polioles tales como glicerol,
30 o propilenglicol).
Cuando se usa in vivo para tratar infecciones bacterianas o trastornos relacionados con una infección bacteriana en
un sujeto mamífero, o para el tratamiento de varios cánceres en humanos (en particular, cáncer de pulmón de célula
no pequeña, y en otros mamíferos tales como perros, ya sea oral o parenteralmente, la dosis diaria habitual estará en
35 el rango de 0,1-100 mg/kg. de peso corporal, especialmente 0,5-25 mg/kg. de peso corporal en dosis únicas o dividi-
das.
La frase “sal(es) farmacéuticamente aceptable(s)”, tal y como se utiliza aquí, a menos que se indique lo contrario,
incluye las sales de grupos ácidos o básicos las cuales pueden estar presentes en los compuestos de la presente inven-
40 ción. Los compuestos de la presente invención que son básicos por su naturaleza, son capaces de formar una amplia
variedad de sales con varios ácidos orgánicos e inorgánicos. Los ácidos que pueden ser usados para preparar sales
de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos básicos, son aquellos que forman sales de
adición de ácido no tóxicas, es decir, sales que contienen aniones farmacológicamente aceptables, tales como sales de
clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, nitrato, sulfato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, acetato, lactato,
45 salicato, citrato, citrato ácido, tartrato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato,
gluconato, glucaronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato,
p-toluenosulfonato y pamoato [es decir, 1,1’-metilen-bis-(2-hidroxi-3-naftoato].
Aquellos compuestos de la presente invención que son acídicos por su naturaleza son capaces de formar sales
50 básicas con varios cationes farmacológicamente aceptables. Ejemplos de dichas sales incluyen las sales de metales al-
calinos o de metalesalcalinotérreos y particularmente, las sales de calcio, magnesio, sodio y potasio de los compuestos
de la presente invención.
Ciertos compuestos de la presente invención pueden tener centros asimétricos y por lo tanto, existen en diferentes
55 formas enantioméricas y diastereoméricas. Esta invención se refiere al uso de todos los isómeros y estereoisóme-
ros ópticos de los compuestos de la presente invención y mezclas de estos mismos, y para todas las composiciones
farmacéuticas y métodos de tratamiento que puedan emplearlos o contenerlos.
La presente invención incluye los compuestos de la presente invención y sales farmacéuticamente aceptables de
60 éstos, en donde uno o más átomos de hidrógeno, carbono u otros átomos, son reemplazados por isótopos de éstos. Di-
chos compuestos pueden ser útiles como herramientas de investigación y de diagnóstico en estudios farmacocinéticos
de metabolismo y en ensayos de enlazamiento.
Los compuestos de la presente invención son producidos mediante fermentación de un organismo transformado o
65 no transformado, capaz de producir eritromicinas, incluyendo pero no limitándose a la especie de Saccharopolyspora,
Streptomyces griseoplanus, Norcadia sp., Micromonospora sp., Arthobacter sp., y Streptomyces antibioticus, pero ex-
cluyendo a S. coelicolor. Son particularmente apropiadas a este respecto, las cepas transformadas o no transformadas
de Saccharopolyspora erythraea, por ejemplo, NRRL 2338, 18643, 21484. Son particularmente preferidas aquellas
9
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cepas transformadas en las cuales, el módulo de carga de eritromicina ha sido reemplazado por el módulo de carga
procedente del productor de avermectina, Streptomyces avermilitis, o el productor de rapamicina, Streptomyces hy-
groscopicus. El método preferido para producir los compuestos de la presente invención es mediante la fermentación
del organismo apropiado en presencia de un ácido carboxílico apropiado de la fórmula R1 COOH, en donde R1 es
5 como se ha definido previamente en las fórmulas 1 y 2 o una sal, éster (particularmente preferible si es un tioéster
de N-acetilcisteamina) o amida de éste o un precursor oxidativo de éste. El ácido o derivado de éste se añade a la
fermentación, ya sea en el momento de la inoculación o en intervalos durante la fermentación. La producción de los
compuestos de la presente invención se puede seguir retirando muestras de la fermentación, extrayendo con un sol-
vente orgánico y siguiendo la aparición de los compuestos de esta invención mediante cromatografía, por ejemplo,
10 usando cromatografía de líquidos a alta presión. La incubación se continua hasta que la obtención del compuesto
de fórmula 1 ó 2 ha sido maximizada, generalmente durante un período de 4 a 10 días. Un nivel preferido de cada
adición del ácido carboxílico o derivado de éste está entre 0,05 y 4,0 g/L. Los mejores rendimientos de los com-
puestos de fórmula 1 ó 2 son generalmente mediante la adición gradual del ácido o el derivado de la fermentación,
por ejemplo, mediante la adición diaria durante un periodo de varios días. El medio utilizado para la fermentación
15 puede ser un medio de complejo convencional que contenga fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y elementos
traza.
Los medios preferidos y adecuados para hacer crecer las células productoras de eritromicina manipuladas genéti-
camente y sin transformar, y los medios adecuados y preferidos para el aislamiento, identificación, y utilidad práctica
20 de los compuestos de fórmulas 1 ó 2 están descritos más ampliamente en los Ejemplos.
Algunas realizaciones de la invención serán descritas ahora con referencia a los dibujos adjuntos, en los cuales:
25
La Figura 1 da las fórmulas químicas de los tres policétidos conocidos;
Las Figuras 3a y 3b son diagramas que muestran la construcción del plásmido pIG1;
35
Las Figuras 4a, 4b y 4c son diagramas que muestran la construcción del plásmido pND30;
Se registró el espectro UV usando un espectrofotómetro de arreglo de diodos Hewlett-Packard 1090M. Todos los
espectros NMR fueron medidos en CDCl3 por un espectrómetro de 500 MHz Varian Unity, a menos que se indique
lo contrario, y las posiciones de los picos se expresan en partes por millón (p.p.m.) sacados a partir de tetrametilsi-
10 lano. Las formas de los picos se indican como sigue: s. singlete; d. doblete; t. triplete; q. cuarteto; m. multiplete; br.
amplio. El número atómico mostrado en las estructuras de RMN no es representativo de la nomenclatura estándar,
pero correlaciona los datos de RMN con éste ejemplo en particular. Los datos HPLC-MS fueron obtenidos usando un
cromotógrafo de líquidos Hewlett-Packard 1090M en interfaz con un espectrómetro de masas VG plarform II equi-
pado con una fuente APCI (método A) o usando un cromatógrafo de líquidos Hewlett-Packard 1050 en interfaz con
15 espectrómetro de masas VG Plarform II equipado con una fuente APCI (método B y método C).
Método A de HPLC
25 Fase móvil Gradiente: acetonitrilo: acetato de amonio 0,05 M (28:72) respecto acetonitrilo: acetato de amonio 0,05
M (50:50) durante 22 minutos, mantener acetonitrilo: acetato de amonio 0,05 M (50:50) 22-25 minutos;
regresar a las condiciones iniciales 25-30 minutos.
Método B de HPLC
30
Columna MetaChem Inertsil de 5 µm C8 3 mm x 150 mm
35 Fase móvil Isocrática: metanol:acetato de amonio 0,05 M con ácido trifluoroacético al 0,1% (60:40)
Método C de HPLC
Fase móvil Gradiente: acetonitrilo: acetato de amonio 0,05 M (30:70) a acetonitrilo: acetato de amonio 0,05 M
(50:50) por 30 minutos.
45
Se hace uso de los siguientes medios y soluciones:
50 sacarosa 69 g
KNO3 10 g
ácido succínico 2,36 g
KH2 PO4 2,7 g
55 MgSO4 .7H2 O 1,2 g
ZnCl2 10 mg
MnCl2 .4H2 O 6,2 g
CuCl2 .2H2 O 0,53 mg
60 CoCl2 0,55 mg
FeSO4 .7H2 O 2,5 mg
CaCl2 .2H2 O 38 mg
agua mili-Q Para 1,0 L
KOH a pH 6-6.4
65
11
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Medio de agua corriente
glucosa 5g
triptona 5g
5
extracto de levadura 2,5 g
EDTA 36 mg
agua corriente a 1,0 L
KOH a pH 7,1
10
Medio ERI-P
Dextrosa 50 g/L
harina NutrisoyMR 30 g/L
15
(NH4 )2 SO4 3 g/L
NaCl 5 g/L
CaCO3 6 g/L
pH ajustado a 7,0
20
La harina NutrisoyMR se compró de British Arkady, Skerton Road, Manchester, Reino Unido.
El plásmido pIG1 consiste en un plásmido derivado de SCP2∗ que contiene un gen de PKS Tipo I híbrido que
30
comprende el módulo de carga avr en lugar del módulo de carga ery, los dos primeros módulos de extensión de la
PKS de ery y la tioesterasa de la PKS de ery. Este se construye a través de varios plásmidos intermediarios como sigue
(Figura 3).
El plásmido pCRabc (Figura 3) fue construido como sigue. Se llevaron a cabo tres reacciones PCR por separado:
Primeramente, se utilizaron 20 pmoles de cada uno de los oligonucleótidos sintéticos A1 (5’-CTC GTC GGT GGC
55
TTT GOG-3’) y A2 (5’-CCC GGG AAA AAC GAA GAC TAG TGG CGC GGA CGG CCG-3’) para amplificar un
producto de 1,0 kbp, de una plantilla pNCO12 de 100 ng. El producto de PCR fue reparado, en sus extremos, fosfo-
rilado y clonado, en un pUC18 con un corte de SmaI, para obtener un plásmido pCRa. Segundamente, se utilizaron
20 pmoles de cada uno de los oligonucleótidos sintéticos C1 (5’-CAC GCG CAG CGC GGC GGA-3’) y C2 (5’-CGA
ACC GCT AGC GGT CGT CGC GAT GGC CT-3’) para amplificar un producto de 1,5 kbp, de una plantilla pNCO12
60
de 100 ng. El producto fue reparado, en sus extremos, fosforilado y clonado en un pUC18 con un corte de SmaI, para
obtener un plásmido pCRc. Terceramente, se utilizaron 20 pmoles de cada uno de los oligonucleótidos sintéticos B1
(5’-GTG GCC CGG CCG TCC GTC CGC GCC ACT AGT CTT CGT TTT T-3’) y B2 (5’-AGC TAG CGG TTC
GTC CGC CGC TGC CGT GCC-3’) para amplificar un producto de 1,4 kbp, de una plantilla pVE3.4 de 100 ng. El
producto fue reparado, en sus extremos, fosforilado y clonado en un pCU18 con un corte de SmaI, para obtener un
65
plásmido pCRb.
12
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El plásmido pCRa fue digerido con Hindi y SpeI y el inserto de 1,0 kbp se ligó con el plásmido pCRb previamente
digerido con HindIII y SpeI, para obtener el plásmido pCRb. El plásmido pCRc fue digerido con NheI y EcoR1 y el
inserto de 1,5 kbp se ligó con el plásmido pCRb previamente digerido con NheI y EcoR1 para obtener el plásmido
pCRabc.
5
(iv) Construcción del plásmido pNEWAVETE
El plásmido pCRabc fue digerido con MfeI y SfiI y se purificó el fragmento de ADN que contenía el dominio
de carga de la PKS de avr mediante electroforesis en gel y se ligó al plásmido pNTEP2, el cual había sido digerido
10 con MfeI y SfiI y el fragmento más grande se purificó mediante electroforesis en gel. La mezcla de ligación fue
transformada en TG1 recO de E. coli y se comprobaron las colonias individuales por su contenido plasmídico. Se
identificó al plásmido deseado pNEWAVETE (13,7 kbp) por su patrón de restricción.
El plásmido pNEWAVETE fue digerido con NdeI y XbaI y el inserto fue purificado mediante sedimentación en
un gradiente de sacarosa. El inserto purificado se ligó al plásmido pRM52 (19,6 kbp) el cual había sido digerido con
NdeI y XbaI, y el vector fue purificado mediante sedimentación en un gradiente de sacarosa. La mezcla de ligación fue
30 usada para transformar E. coli y se comprobaron las colonias individuales por su contenido plasmídico. Se identificó
al plásmido pIG1 deseado, por su patrón de restricción.
Ejemplo 1b
El plásmido pND30 consiste en un plásmido derivado de SCP2∗ que contiene un gen de PKS Tipo I híbrido que
comprende el módulo de carga de avr en lugar del módulo de carga de ery, los dos primeros módulos de extensión de
la PKS de ery y la tioesterasa de la PKS de ery. Este es construido a través de varios plásmidos intermediarios como
40 sigue (Figura 4).
El pCJR101 (Figura 4) es un plásmido transportador, construido para ser usado en la expresión de los genes de PKS,
45 en actinomicetos. Este incluye un replicón de CoIE1 para permitir duplicarlo en E. coli, un replicón de Streptomyces de
bajo número de copias de SCP2∗ (Bibb, M. J. y Hopwood, D. A. J. Gen. Microbiol. (1981)126:427) y el gen activador
actI-orf4 procedente del sector act, el cual activa la transcripción procedente del promotor act, durante la transición
desde la fase de crecimiento hasta la fase estacionaria en el micelio vegetativo. Este se construye como sigue: un
fragmento de ADN de aproximadamente 970 bp de pMF1015 (conteniendo al gen activador actI-orf4) (Fernández-
50 Moreno, M.A. et al. Cell (1991) 66:769-780) es amplificado por PCR, usando como cebadores los oligonucleótidos
sintéticos: 5’-ACT AGT CCA CTG CCT CTC GGT AAA ATC CAG C-3’ y 5’-CTT AAG GGC TCC ACC GCG TTC
ACG GAC-3’; los cuales también introducen los sitios de restricción SpeI y AflII flanqueadores. Este fragmento es
clonado en el sitio reparado AatI del extremo del plásmido pUC19 para obtener el plásmido pCJR18. Un fragmento de
ADN de aproximadamente 215 bp es amplificado a partir de pMV400, el cual contiene el par promotor bidireccional
55 PactIII/PactI (Parro, V. et al. Nucl. Acids Res. (1991) 19:2623-2627), usando como cebadores los oligonucleótidos
synthetics 5’-ACA TTC TCT ACG CCT AAG TGT TCC CCT CCC TGC CTC-3’ y 5’-GTG ATG TAT GCT CAT
ATG TGT CCT CCT TAA TTA ATC GAT GCG TTC GTC CGG TG-3’; los cuales también introducen los sitios
flanqueadores NdeI y AflII. El producto de PCR es digerido con NdeI y AflII y ligado al plásmido pCJR18 previamente
cortado con NdeI y AflII, para generar al plásmido pCJR19. Se obtiene un fragmento de HindIII SphI de 1,1 kbp que
60 contiene el gen tsr, el cual confiere resistencia a la tioestreptona, mediante PCR a partir del plásmido pIJ922 (Lídiate,
D.J. et al gene (1985) 35:223-235) como plantilla, usando como cebadores los oligonucleótidos sintéticos 5’-TGA
ACA CCA AGC TTG CCA GAG AGC GAC GAC TTC CCC-3’ y 5’-GAC AGA TTG CAT GCC CTT CGA GGA
GTG CCC GCC GCC CGG-3’; los cuales también introducen a los sitios flanqueantes HindIII y SphI. El producto
de PCR es digerido con HindIII y SphI y ligado al plásmido pCJR19, cortado con HindIII y SphI para obtener el
65 plásmido pCJR24. El plásmido pIJ922 es digerido con BamHI y SstI y el fragmento que contiene una porción del
sitio de fertilidad y el origen de la duplicación (Lídiate, D. J. et al gene (1985) 35:223-235) se liga en pUC19 digerido
con BamHI y SstI para generar el plásmido pCJR16 (14,7 kbp) bifuncional. El plásmido pCJR24 es digerido con
SalI y SphI, los dos fragmentos más grandes procedentes de la digestión se purifican mediante electroforesis en gel y
13
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combinados en una ligación de cuatro componentes con el plásmido pCJR16 el cual ha sido digerido con XhoI y SphI.
La mezcla de enlace es usada para transformar los Streptomyces lividans y las colonias son seleccionadas en presencia
de tioestreptona. Una colonia tal, se muestra por contener el plásmido pCJR101 deseado (12,4 kbp aproximadamente),
identificado por su patrón de restricción.
5
(ii) Construcción del Plásmido pCJR29
La construcción del plásmido pCJR29 está ilustrada en la Figura 4. Un fragmento HindIII - XhoI de 1,1 kbp que
contiene al gen tsr, el cual confiere resistencia a la tioestreptona, es obtenido por PCR a partir del plásmido pIJ922
10 como plantilla, usando como cebadores a los oligonucleótidos 5’-TGA ACA CCA AGC TTG CCA GAG AGC GAC
GAC TTC CCC-3’ y 5’-GAC AGA TTC TCG AGC CTT CGA GGA GTG CCC GCC CGG-3’, los cuales también
introducen los sitios flanqueadores HindIII y XhoI. El producto de PCR fue digerido con HindIII y XhoI y se ligó al
plásmido pCJR16 que había sido digerido con HindIII y XhoI, para generar el plásmido pCJR25. El plásmido pCJR25
es digerido con HindIII y XhoI y enlazado con el plásmido pCJR19, que había sido digerido con HindIII y SphI,
15 para producir el plásmido pCJR29 deseado (12,4 kbp aproximadamente), identificado por su patrón de restricción.
El plásmido pCJR29 difiere del pCJR101 en la orientación del gen tsr, el gen actI-orf4 y el promotor actI/actIII, con
respecto al origen de replicación de origen derivada de SCP2∗ .
Ejemplo 1c
35 El segmento de ADN de aproximadamente 1,3 kbp del gen eryAI de S. erythraea, que se extiende desde el nu-
cleótido 1948 hasta el nucleótido 3273 del eryAI (Donadio S. et al., Science (1991) 252, 675-679) fue amplificado por
PCR, empleando como cebadores los oligonucleótidos sintéticos: 5’-CAT GCT CGA GCT CTC CTG GGA AGT-3’
y 5’-CAA CCC TGG CCA GGG AAG ACG AAG ACG G-3’; y el plásmido pNTEP2 como plantilla. El producto de
PCR fue reparado en sus extremos y ligado al plásmido pUC18, el cual había sido linealizado mediante digestión con
40 SmaI y después tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligación fue usada para transformar el TG1 recO de E.coli
y se comprobaron las colonias individuales por su contenido plasmídico. Se identificó el plásmido pMO1 deseado (3,9
kbp), por su patrón de restricción, en el cual el sitio StuI que limita el inserto, está adyacente al sitio HindIII en el
poliengarce.
El segmento de ADN de aproximadamente 0,85 kbp el gen rapA del Streptomyces hygroscopicous, que se extiende
desde el nucleótido 1643 hasta el nucleótido 2486 de rapA, se amplificó por PCR, empleando como cebadores los
siguientes oligonucleótidos: 5’-TTC CCT GGC CAG GGG TCG CAG CGT G-3’ y 5’-CAC CTA GGA CCG ACC
50 ACT CGA C-3’; y el ADN procedente del bacteriógrafo recombinante λ-1E (Schewcke, T. et al., Proc. Catl. Acad. Sci.
EUA (1995) 92:7839-7843) como plantilla. El producto de PCR fue reparado en sus extremos y enlazado al plásmido
pUC18, el cual había sido linealizado mediante la digestión con SmaI y después tratado con fosfatasa alcalina. La
mezcla de ligación fue usada para transformar el TG1 recO de E. coli y se comprobaron las colonias individuales por
su contenido plasmídico. Se identificó al plásmido pMO2 deseado (3,5 kbp), por su patrón de restricción.
55
(iii) Construcción del Plásmido pMO3
El segmento de ADN de aproximadamente 1,7 kbp del gen eryAI de S. erythraea, que se extiende desde el nucleó-
tido 4128 hasta el nucleótido 5928 de eryAI, fue amplificado mediante PCR, empleando como cebadores los siguientes
60 oligonucleótidos: 5’-TGG CCA GGG AGT CGG TGC ACC TAG GCA-3’ y 5’-GCC GAC AGC GAG TCG ACG
CCG AGT T-3’; y el plásmido pNTEP2 como plantilla. El producto de PCR fue reparado en sus extremos y enlazado
al plásmido pUC18, el cual había sido linealizado mediante la digestión con SmaI y después tratado con fosfatasa
alcalina. La mezcla de ligación fue usada para transformar el TG1 recO de E. coli y se comprobaron las colonias indi-
viduales por su contenido plasmídico. Se identificó al plásmido pMO3 deseado (4,4 kbp), por su patrón de restricción,
65 y los sitios BaII y AvrII están adyacentes al sitio HindIII del poliengarce.
14
ES 2 244 001 T3
(iv) Construcción del Plásmido pMO4
El plásmido pMO1 fue digerido con HindIII y BalI y el inserto de 1,3 kbp fue ligado al plásmido pMO3 que
ha sido digerido con HindIII y BalI. La mezcla de ligación fue usada para transformar el TG1 recO de E. coli y se
5 verificaron las colonias individuales por su contenido plasmídico. Se identificó al plásmido pMO4 deseado (5,6 kbp),
por su patrón de restricción.
10 El plásmido pMO4 fue digerido con StuI y el inserto de 3,0 kbp se ligó con el plásmido pNTEP2 que había sido
digerido con StuI y purificada mediante electroforesis en gel para extraer el inserto de 3,8 Kpb. La mezcla de ligación
fue usada para transformar el TG1 recO de E. coli y se comprobaron las colonias individuales por su contenido
plasmídico. Se identificó al plásmido pMO5 deseado (12,8 kbp), por su patrón de restricción.
El plásmido pMO2 fue digerido con BalI y AvrII y el inserto fue ligado con el plásmido pMO5 que ha sido
digerido con BalI y AvrII. La mezcla de ligación se utilizó para transformar el TG1 recO de E. coli y se comprobaron
las colonias individuales por su contenido plasmídico. Se identificó el plasmídico pMO6 deseado (13,5 kpb), por su
20 patrón de restricción.
El plásmido pCJR26 es un plásmido basado en SCP2∗ , que contiene un gen de PKS que comprende el módulo
25 de carga ery, el primer y segundo módulos de extensión de la ery de PKS y la tioesterasa terminante de cadena de
ery, excepto en que el segmento de ADN que codifica la malonil-CoA:ACP aciltransferasa dentro del primer módulo
de extensión, ha sido sustituido específicamente por el ADN que codifica a la malonil-CoA:ACP aciltransferasa del
módulo 2 de la PKS de rap. Este fue construido como sigue (Figura 9): el plásmido pMO6 fue digerido con NdeI y
XbaI y el inserto fue ligado al plásmido pCJR24, el cual había sido digerido con NdeI y XbaI y purificado mediante
30 de electroforesis en gel. La mezcla de enlace fue transformada en TG1 recO de E. coli y se comprobaron las colonias
individuales por su contenido plasmídico. Se identificó al plásmido pCJR26 deseado, por su patrón de restricción.
Ejemplo 1d
El plásmido pCJR26 fue usado para transformar los protoplastos de JC2 de S. erythraea. Las colonias resistentes
a la tioestreptona fueron seleccionadas en un medio R2T20, que contenía 10 µg/ml de tioestreptona. Se probaron
diversos clones por la presencia del pCJR26 integrado dentro del cromosoma, mediante hibridación de transferencia
40 Southern de su ADN genómico con un gen DEBS1-TE etiquetado como DIG.
Se hizo crecer un clon con una copia integrada de pCJR26 en un medio SSM, que contenía 5 mg/ml de tioestreptona
y se dejó crecer durante 7 días a 28-30ºC. Después de este tiempo, el caldo fue filtrado para retirar los micelios y se
ajustó el pH a 3. Se extrajo el caldo dos veces con dos volúmenes de acetato de etilo y se lavaron los extractos
45 combinados de acetato de etilo, con un volumen igual de cloruro de sodio saturado, secaron sobre sulfato de sodio
anhidro y se retiró el acetato de etilo a presión reducida, para dar aproximadamente 500 mg del producto crudo. Se
mostró que los productos fueron δ-lactonas derivadas del ácido (2S, 3R, 5R)-2-metil-3, 5-dihidroxi-n-hexanoico y del
ácido (2S, 3R, 5R)-2-metil-3,5-dihidroxi-n-heptanoico.
50
55
60
65
15
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Ejemplo 1e
5 Un ADN de pCJR49 de aproximadamente 5 mg fue usado para transformar los protoplastos de NRRL2338 de S.
erythraea para dar una cepa en la cual, el plásmido está integrado dentro del cromosoma. Se obtuvo el ADN total de
varias colonias y se analizó mediante hibridación Southern para confirmar que el plásmido se había integrado en el
módulo 2 de EryAI para dar una nueva ruta biosintética del nuevo macrólido.
10 Tuvieron lugar integraciones adicionales, dando secuencias de plásmido repetidas. El NRRL 2338/pCJR49 de S.
erythraea fue inoculado en un caldo de soja tríptico que contenía 5 mg/ml de tioestreptona y se incubó a 30ºC durante
tres días. Se usaron 100 ml de este cultivo de semilla para inocular 2 L de un medio definido de succionato de sacarosa
que contenía 5 mg/ml de tioestreptona en 5 matraces de 2 L, cada uno conteniendo 500 mL de medio junto con dos
agitadores para ayudar a la dispersión y mezclado a 300 r.p.m. Después de 5 días más de crecimiento, los cultivos
15 fueron centrifugados y el pH del sobrenadante se ajustó a pH 9. A continuación, se extrajo el sobrenadante tres veces
con un volumen igual de acetato de etilo y el disolvente fue retirado mediante evaporación. Los productos fueron
analizados mediante HPLC/MS y se identificaron dos macrólidos como análogos de eritromicina:
20
25
30
35
40 Ejemplo 1f
El plásmido pC-ATX es un plásmido basado SCP2∗ que contiene un gen de PKS que comprende el módulo de carga
45 ery, el primer y segundo módulos de extensión de la PKS de ery y la tioesterasa finalizadora de cadena de la PKS de ery,
excepto en que el segmento de ADN que codifica la metilmalonil-CoA:ACP aciltransferasa dentro del primer módulo
de extensión, ha sido sustituido específicamente por el ADN que codifica a la malonil-CoA:ACP aciltransferasa de
un sector del gen de PKS Tipo I putativo, clonado a partir de Streptomyces cinnamonensis ATCC 14513 (productora
de la monensina de policétido de poliéster). Este fue construido a través de varios plásmidos intermedios como sigue
50 (Figura 10).
La biblioteca genómica de Streptomyces cinnamonensis ATCC 14513 (el productor de monensina) fue construido
55 a partir de fragmentos Sau3A de 35 a 45 kpb de tamaño fraccionado de ADN cromosómico ligado con un BamHI
linealizado y un vector pWE15 cósmido tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligación fue empaquetada en
unas partículas λ, usando extractos de empaquetamiento Gigapack, y se transfectaron dentro de NM1blue de E. coli.
Se hicieron crecer aproximadamente 600 colonias de la librería en la superficie de una membrana de nylon, se lisaron
y se retículo su ADN a la membrana mediante irradiación UV. La membrana fue subsiguientemente usada para el
60 procedimiento de cribado. Se marcó el inserto de pMO8 que comprendía el dominio de la cetosintasa del módulo
2 de DEBS, mediante cebado aleatorio en presencia de 53 pαATP y se utilizó como sonda para la hibridación del
ADN. La muestra se hibridó durante 16 horas a 68ºC en un tampón de 4,0xSSC y se lavó, subsiguientemente, durante
una hora a 68ºC con un tampón de 0,8xSSC. Los tres clones positivos fueron aislados. Se secuenció el ADN de
los insertos de los tres clones hasta el final desde los sitios de cebado T3 a T7, presentes en el vector pWE15. Se
65 descubrió una región homóloga a los dominios de la cetosintasa de tipo I y a malonil-CoA:ACP aciltransferasa en
la secuencia de ADN del sitio de cebado T7, usando al clon 2 (llamado pSCIN02) como plantilla. La secuenciación
parcial de ADN del dominio malonil -CoA:ACP aciltransferasa (llamado ATX) reveló un motivo de secuencia inusual
en la parte de reconocimiento del substrato putativo del dominio, la cual fue sustancialmente diferente de las de
16
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malonato- o metilmalonato-CoA:ACP aciltransferasas específicas, previamente descritas (Haydock S.F. et. al., FEBS
(1995) 374:246-248).
25 El plásmido pMO35 es un derivado del pMO34 que contiene el gen TKLS-AT2 y un gen crotonil-CoA-reductasa
unido traduccionalmente, procedente de Streptomyces collinus (Wallace et al., E.J. Biochem. (1995) 233:954-962). El
gen crotonil-CoA-reductasa fue extirpado del plásmido pZYB3 (donado por el Prof. K. Reynolds), como un fragmento
NdeI - NamHI, el cual fue tratado con nucleasa de judía mung para producir extremos despuntados y se ligó en
el pMO34, previamente cortado con SpeI y, de la misma manera, con extremos despuntados usando nucleasa de
30 judía mung. La mezcla de ligación se utilizó para transformar el TG1 recO de E. coli y se comprobaron las colonias
individuales por su contenido plasmídico. Se identificó el plásmido pMO35 deseado (14,2 kbp) con la orientación
correcta del gen crotonil-CoA-cetoreductasa, por su patrón de restricción.
El plásmido pMO36 se digirió con NdeI y XbaI y el inserto se ligó al plásmido pCJR29, el cual había sido digerido
con NdeI y XbaI y purificado mediante electroforesis en gel. La mezcla de ligación se transformó en el TG1 recO de
45 E. coli y se comprobaron las colonias individuales por su contenido plasmídico. Se identificó el plásmido pC-ATX
deseado, por su patrón de restricción.
Ejemplo 1g
Se utilizó el plásmido pC-ATX para transformar los protoplastos JC2 de S. erythraea. Se seleccionaron las colonias
resistentes a la tioestreptona, en un medio R2T20 que contenía 10 µg/ml de tioestreptona. Se probaron diversos clones
por la presencia del pC-ATX integrado dentro del cromosoma, mediante la hibridación por transferencia Southern de
55 su ADN genómico con ADN marcado con DIG que codifica el gen DEBS1-TE.
Se hizo crecer un clon con una copia integrada de pC-ATX fue cultivado en un medio SSM, que contenía 5 µg/ml
de tioestreptona y se hizo crecer durante 7 días a 28-30ºC. Después de este tiempo, se filtró el caldo para eliminar los
micelios y se ajustó el pH a 3. El caldo se extrajo dos veces con dos volúmenes de acetato de etilo y los extractos de
60 acetato de etilo combinados, fueron lavados con un volumen igual de cloruro de sodio saturado, secado sobre sulfato
de sodio anhidro y se eliminó el acetato de etilo bajo presión reducida, para dar aproximadamente 500 mg del producto
crudo. Los productos se caracterizaron por cromatografía de gases, espectrometría de masas y NMR y se mostró que
fueron δ-lactona del ácido (2S, 3R, 4S, 5R)-2-metil-4-etil-3,5-dihidroxi-n-hexanoico y δ-lactona del ácido (2S, 3R,
4S, 5R)-2-metil-4-etil-3,5-dihidroxi-n-heptanoico.
65
17
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Ejemplo 1h
15
Construcción de NRRL 2338/pC-ATX de S. erythraea y su uso en la producción de macrólidos de 14 miembros
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40
45
Ejemplo 1i
50
Construcción del Plásmido pC-AT12
El plásmido pC-AT12 es un plásmido basado en SCP2∗ que contenía un gen de PKS, que comprende el módulo
de carga ery, el primer y segundo módulos de extensión de la PKS de ery y la tioesterasa terminadora de cadena de
55 la PKS de ery, excepto en que el segmento de ADN que codifica la metilmalonil-CoA:ACP aciltransferasa dentro del
segundo módulo de extensión, ha sido sustituido específicamente por el ADN que codifica a la malonil-CoA:ACP
aciltransferasa del módulo 2 de la PKS de rap. Este fue construido a través de varios plásmidos intermedios como
sigue (Figura 11).
El segmento de ADN de aproximadamente 1,0 kbp del gen eryAI de S. erythraea que se extiende desde el nucleóti-
do 6696 hasta al nucleótido 7707 de eryAI (Donadio. S. et al., Science (1991)252, 675-679) fue amplificado por PCR,
empleando como cebadores los oligonucleótidos sintéticos 5’-GGC GGG TCC GGA GGT GTT CAC CGA GTT-3’
65 y 5’-ACC TTG GCC AGG GAA GAC GAA CAC TGA-3’; y el plásmido pNTEp2 como plantilla. El producto de
PCR fue reparado en sus extremos y se ligó con el plásmido pUC18, el cual había sido linealizado mediante digestión
con SmaI y después tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligación fue usada para transformar el TG1 recO
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de E. coli y se comprobaron las colonias individuales por su contenido plasmídico. Se identificó el plásmido pMO25
deseado (3,5 kbp), en el cual el sitio StuI que limita el inserto, es adyacente al sitio HindIII del poliengarce, por su
patrón de restricción.
El segmento de ADN de aproximadamente 0,6 kbp del gen eryAI de S. erythraea que se extiende desde el nucleóti-
do 8660 hasta el nucleótido 9258 de eryAI fue amplificado por PCR, empleando como cebadores los oligonucleótidos
sintéticos 5’-TCC TAG GCC GGG CCG GAC TGG TCG ACC TGC CGG GTT-3’ Y 5’-AAA CAC CGC GAC CTG
10 GTC CTC CGA GC-3’; y el plásmido pNTEp2 como plantilla. El producto de PCR fue reparado en sus extremos
y se ligó con el plásmido pUC18, el cual había sido linealizado mediante digestión con SmaI y después tratado con
fosfatasa alcalina. La mezcla de ligación se utilizó para transformar el TG1 recO de E. coli y se comprobaron las
colonias individuales por su contenido plasmídico. Se identificó al plásmido pMO26 deseado (3,2 kbp), en el cual el
sitio AvrII que limita el inserto, es adyacente al sitio HindIII del poliengarce, por su patrón de restricción.
15
(iii) Construcción del Plásmido pMO27
El plásmido pMO25 fue digerido con EcoRI y BalI y el inserto de 1,0 kbp se ligó con el plásmido pMO2, el cual
había sido digerido con EcoRI y BalI. La mezcla de ligación fue usada para transformar el TG1 recO de E. coli y se
20 comprobaron las colonias individuales por su contenido plasmídico. Se identificó al plásmido pMO27 deseado (4,4
kbp), por su patrón de restricción.
25 El plásmido pMO26 fue digerido con AvrII y HindIII y el inserto de 0,6 kbp se ligó con el plásmido pMO27, el
cual había sido digerido con AvrII y HindIII. La mezcla de ligación fue usada para transformar el TG1 recO de E. coli
y se comprobaron las colonias individuales por su contenido plasmídico. Se identificó al plásmido pMO32 deseado
(5,1 kbp), por su patrón de restricción.
El plásmido pMO32 fue digerido con BspEI y SexAI y el inserto de 2,7 kbp fue ligado al plásmido pNTEP2, el
cual había sido digerido con las mismas dos enzimas y purificado mediante electroforesis en gel para retirar el inserto
de 2,8 kbp. La mezcla de ligación fue usada para transformar el TG1 recO de E. coli y se verificaron las colonias
35 individuales por su contenido plasmídico. Se identificó al plásmido pMO33 deseado (12,8 kbp), por su patrón de
restricción.
40 El plásmido pMO33 fue digerido con NdeI y XbaI y el inserto se ligó al plásmido pCJR29, el cual había sido
digerido con NdeI y XbaI y purificado mediante electroforesis en gel. La mezcla de ligación fue usada para transformar
el TG1 recO de E. coli y se comprobaron las colonias individuales por su contenido plasmídico. Se identificó el
plásmido pC-AT12 deseado, por su patrón de restricción.
45 Ejemplo 1j
El plásmido pC-AT12 fue usado para transformar los protoplastos JC2 de S. erythraea. Se seleccionaron las colo-
50 nias resistentes a la tioestreptona, en un medio R2T20 que contenía 10 µg/ml de tioestreptona.
Se hizo crecer un clon con una copia integrada de C-AT12 en un medio SSM que contenía 5 µg/ml de tioestreptona
y se hizo crecer durante 7 días a 28-30ºC. Después de este tiempo, el caldo fue filtrado para retirar los micelios y se
ajustó el pH a 3. El caldo se extrajo dos veces con dos volúmenes de acetato de etilo y los extractos de acetato de
55 etilo combinados, fueron lavados con un volumen igual de cloruro de sodio saturado, secado sobre sulfato de sodio
anhidro y se retiró el acetato de etilo bajo presión reducida, para dar aproximadamente 500 mg del producto crudo. Se
comprobó que los productos eran δ-lactonas del ácido 4-metil-3,5-dihidroxi-n-hexanoico y del ácido (3R, 4S, 5R)-4-
metil-3,5-dihidroxi-n-heptanoico.
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10
15
Ejemplo 1k
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Ejemplo 11
55 El plásmido pCJR49 es un plásmido basado en pCJR24 que contiene un gen DEBS1-TE mutante el cual no tiene
cetoreductasa en el módulo 2 y en el que el dominio AT del módulo 2 ha sido reemplazado por RAPS AT2 con el fin
de incorporar el extensor de malonilo, en lugar del extensor de metilmalonilo en el segundo módulo (Figura 12).
El plásmido pMO32 fue digerido con BspEI y SexAI y el fragmento que contiene el AT del módulo 2 de RAP fue
60 clonado dentro del pUC1-0, el cual había sido previamente digerido con BspEI y SexAI, para conseguir el plásmido
pCJR43.
El plásmido pCJR43 fue digerido con NdeI y XbaI y el fragmento que contenía el gen DEBS1-TE mutante fue
clonado en el pCJR24 el cual había sido previamente digerido con NdeI y XbaI, para conseguir el plásmido pCJR49.
65 El plásmido pCJR49 fue confirmado por su mapa de enzimas de restricción.
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Ejemplo 1m
5 Se utilizaron aproximadamente 5 µg de ADN de pCJR49 para transformar los protoplastos JC2 de S. erythraea
para dar una cepa en la que el plásmido está integrado dentro del cromosoma Se obtuvo el ADN total de varias colo-
nias y se analizó mediante hibridación de transferencia Southern para confirmar que el plásmido se ha integrado en el
JC2/pCJR49 de S. erythraea, el cual es inoculado en un caldo de soja tríptico, que contiene 5 µg/ml de tioestreptona e
incubado a 30ºC durante tres días. Se usaron 100 ml de este cultivo de semilla para inocular 2 L de un medio definido
10 de succionato de sacarosa que contiene 5 µg/ml de tioestreptona en 5 matraces de 2 L, cada uno conteniendo 500 mL
de medio junto con dos agitadores para ayudar en su dispersión y mezclado a 300 r.p.m. Después de 5 días más de cre-
cimiento, los cultivos fueron centrifugados y el pH del sobrenadante fue ajustado a pH 3. El sobrenadante se extrajo, a
continuación, tres veces con un volumen igual de acetato de etilo y el disolvente fue eliminado mediante evaporación.
Los productos fueron disueltos en metanol y analizados mediante GCMS en un Sistema GCQ Finnegan-MAT. El análi-
15 sis indicó que en comparación con los estándares sintéticos, estaban presentes las dos nuevas lactonas. Estos productos
eran δ-lactonas del ácido 4-metil-3-ceto-5-hidroxihexanoico y del ácido 4-metil-3-ceto-5-hidroxiheptanoico:
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25
30
Ejemplo 1n
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Ejemplo 2
Construcción de ERMD1 de S. erythraea, Portando un Gen de PKS Híbrido, en el cual el Didominio de Carga avr, es
Sustituido por el Didominio de Carga ery del NRRL 2338 de S.erythraea
5
(i) Construcción del Plásmido pAVLD
El plásmido pCRabc (Ejemplo 1) fue linealizado con BamHI y ligado a pIJ702, previamente digerido con BgIII.
La mezcla contenía el plásmido pAVLD deseado (Figura 5). La mezcla de ligación se usó para transformar el TG1
10 recO de E. coli y se comprobaron las colonias individuales por su contenido plasmídico. Se identificó al plásmido
pAVLD deseado (Figura 5), por su patrón de restricción.
15 Aproximadamente 5 a 10 µg de pAVLD, aislados del TG1 recO de E. coli (pAVLD) fueron transformados en
NRRL2338 de S. erythraea y se aislaron las colonias estables resistentes a la tioestreptona. Una de estas colonias
fue seleccionada y el ADN total fue digerido con PstI y analizado mediante hibridación Southern, empleando como
sonda el inserto procedente del plásmido pCRc, que contiene el fragmento del gen ery AI que codifica el dominio de
cetosintasa KS1. El análisis mostró que los fragmentos de PstI hibridados positivamente de 8,5 kbp, 4,8 kbp y 33 kbp,
20 indicaban la presencia de dos copias integradas consecutivamente de pAVLD (Figura 6).
Ejemplo 3
22
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y el análisis Southern también mostró que el sitio de integración era apropiado para generar un mutante capaz de
producir macrólidos alterados a través de módulo de carga ave.
Ejemplo 4b
5
Construcción de NRRL 2338/pND30 de S. erythraea
Se transformaron aproximadamente 5 µg del plásmido pND30 en los protoplastos NRRL 2338 de S. erythraea y
se aislaron las colonias resistentes a la tioestreptona. Se obtuvo el ADN total de varias colonias y se analizó mediante
10 hibridación Southern, para confirmar que el plásmido se hallaba integrado específicamente dentro de eryAI y el aná-
lisis Southern también mostró que el sitio de integración era apropiado para generar un mutante capaz de producir
macrólidos alterados a través de módulo de carga ave.
Ejemplo 5a
15
Preparación de Eritromicinas de 13-Isopropil y 13-Sec-butil, Usando el NRRL 2338/pIG1 de S. erythraea
Se inoculó el NRRL 2338/pIG1 de S. erythraea en un medio de agua corriente que contenía 50 µg/mL de tioes-
treptona y se dejó crecer durante cuatro días a 30ºC. Después de esto, se usaron 20 mL de micelio para germinar 500
20 mL de un medio de succionato de sacarosa que contenía 50 µg/mL de tioestreptona, en un matraz de 2L con un solo
agitador para reducir el aglutinamiento y se agitó a 280 r.p.m. Después de entre 3,5 y 6 días, el caldo fue filtrado para
retirar los micelios y, a continuación, se extrajo tres veces con un cuarto del volumen de acetato de etilo. Los extractos
combinados de acetato de etilo se secaron sobre sulfato de sodio anhídrido y el disolvente fue retirado mediante eva-
poración. El análisis de la mezcla del producto, usando GC y MS con electrospray, revelaron que del total de los 5-6
25 mg de productos macrólidos de 14 miembros, el componente principal era la eritromicina de sec-butilo D (aproxima-
damente 1,5 mg/L), con otros componentes presentes, que eran la eritromicina de sec-butilo B y la eritromicina de sec-
butilo A; eritromicinas de sec-butilo A, B y D; y pequeñas cantidades de eritromicinas naturales A, B y D. El NRRL
2338/pIG1 de S. erythraea produjo aproximadamente de 10 a 15 veces más de las nuevas eritromicinas de sec-butilo
e isopropilo, comparándose con la construcción equivalente de ERMD1 de S. erythraea (ver Ejemplo 2), mostrando
30 claramente la capacidad del promotor actI y su gen activador cognitivo actII-orf4, para potenciar la expresión de las
PKS de Tipo I. De nuevo, no se llevó a cabo ninguna complementación con ninguno de los ácidos isobutírico o 2-
metilbutírico. De esta manera, resulta que las unidades de iniciación de isobutirilo y 2-metilbutirilo son derivadas de
los precursores suministrados endógenamente.
35 Ejemplo 5b
El NRRL 2338/pND30 de S. erythraea fue inoculado enun medio de agua corriente que contenía 50 µg/mL de
40 tioestreptona y se dejó crecer durante cuatro días a 30ºC. Después de esto, se usaron 20 mL de micelios para germinar
500 mL de un medio de succionato de sacarosa que contenía 50 µg/mL de tioestreptona, en un matraz de 2L con
un solo agitador para reducir el aglutinamiento y se agitó a 280 r.p.m. Después de entre 3,5 y 6 días, el caldo fue
filtrado para retirar los micelios y después se extrajo tres veces con un cuarto del volumen de acetato de etilo. Los
extractos combinados de acetato de etilo fueron secados sobre sulfato de sodio anhídrido y el disolvente fue retirado
45 mediante evaporación. El análisis de la mezcla del producto, usando GC y MS con electrospray, revelaron que de un
total de 5 a 6 mg/L de productos macrólidos de 14 miembros, el componente principal era la eritromicina de sec-
butilo D (aproximadamente 1,5 mg/L), con otros componentes presentes que eran la eritromicina de sec-butilo B y la
eritromicina de sec-butilo A; eritromicinas de sec-butilo A, B y D; y pequeñas cantidades de eritromicinas naturales
A, B y D. El NRRL 2338/pND30 de S. erythraea produjo aproximadamente de 10 a 15 veces más de las nuevas
50 eritromicinas de sec-butilo e isopropilo, comparándose con la construcción equivalente de ERMD1 de S. erythraea
(ver Ejemplo 2), mostrando, claramente, la capacidad del promotor actI y su gen activador cognitivo actII-orf4, para
potenciar la expresión de las PKS de Tipo I. De nuevo, no se llevó a cabo ninguna complementación con ninguno
de los ácidos isobutírico o 2-metilbutírico. De esta manera, resulta que las unidades de iniciación de isobutirilo y 2-
metilbutirilo son derivadas de los precursores suministrados endógenamente.
55
Ejemplo 6a
Espectrometría de masas APCI (M + H)+ observada a m/e 758, requerido para C40 H72 NO12 -758.
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Ejemplo 6b
Un experimento similar al del ejemplo 6a, usando el cultivo NRRL/2338 pND30 de S. erythraea, produce el
compuesto ejemplificado en el ejemplo 6a.
25 Ejemplo 7a
Espectrometría de masas APCI (M + H)+ observada a m/e 744, requerido para C39 H70 NO12 -744
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25 Ejemplo 7b
Un experimento similar al del ejemplo 7a , usando el cultivo NRRL/2338 pND30 de S. erythraea, produce el
30 compuesto ejemplificado en el ejemplo 7a.
Ejemplo 8a
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Ejemplo 8b
40 Un experimento similar al del ejemplo 8a, usando el cultivo NRRL/2338 pND30 de S. erythraea, produce el
compuesto ejemplificado en el ejemplo 8a.
Ejemplo 9a
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ES 2 244 001 T3
Tiempo de retención de HPLC - Método A - 17,9 minutos.
Espectrometría de masas APCI (M + H)+ observada a m/e 730, requerido para C38 H68 NO12 -730
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Ejemplo 9b
Un experimento similar al ejemplo 9a, usando el cultivo NRRL/2338 pND30 de S. eryhtraea, produce el compuesto
ejemplificado en el ejemplo 9a.
55 Ejemplo 10a
El cultivo de NRRL 2338/pIG1 de S. erythraea fue inoculado en 1 L de un medio de agua corriente en un ma-
60 traz Fernbach de 2,8 L. Se añadió tioestreptona inmediatamente después de la inoculación. Después de 84 horas de
incubación a 29ºC, este matraz fue utilizado para inocular 8 L de un medio complementado de ERY-P (50 g/L de
Dextrosa, 30 g/L de harina Nutrisoy, 3 g/L de sulfato de amonio, 5g/L de NaCl, 6 g/L de CaCO3 , 10 g/L de sacarosa,
5 g/L sólidos de maíz empapado, 0,5 g/L de MgSO4 y 1 mL/L de P2000) en un recipiente de fermentación de 14 L. El
caldo se incubó a 28ºC, con una velocidad de aeración de 8 L/min. y agitándose a 800 r.p.m. y con un pH mantenido
65 entre 6,9 y 7,3 con NaOH o H2 SO4 (15%). Se añadió ácido metiltioláctico (3,2 mL) después de 24 y 48 horas y se
continuó la fermentación durante 142 horas. Se añadió después de 12 horas más, ácido metiltioláctico (1,6 mL). La
fermentación continuó durante 142 horas. Después de este tiempo, se centrífugo el caldo en su totalidad para obtener
36
ES 2 244 001 T3
el concentrado (34 L) el cual se cargó en una columna de resina XAD-16 (600 mL; Rohm and Hass). La columna de
resina fue entonces lavada con agua (1,8 L) y eluida con acetato de etilo (2,5 L). El acetato de etilo fue parcialmente
concentrado (a 250 mL) y después el producto de interés fue extraído con un tampón de fosfato de sodio, pH 3,5 (1,3
L). El producto fue transferido otra vez al acetato de etilo, ajustando el agua a pH 9 con hidróxido de sodio y después
5 mezclándolo con acetato de etilo (450 mL). La capa de acetato de etilo rica en eritromicina fue separada y evaporada
produciendo una goma (5,0 g) y después fue suspendida de nuevo en metanol al 20% (120 mL), que se cargó en una
columna de resina CG-161 (100 mL; Toso Haas). La columna de resina se eluyó secuencialmente con metanol al 20%
(3 x 100 mL), metanol al 40% (3 x 100 mL), metanol al 60% (3 x 100 mL), metanol al 80% (3 x 100 mL) y metanol
puro (4 x 100 mL). Las fracciones 2 y 3 del metanol puro, que contenían el producto de interés fueron evaporadas a
10 un estado sólido (220 mg) y después purificadas sobre una columna HPLC Kromasil de 10 µm de fase inversa (75 mm
x 25 cm) usando una fase móvil de acetonitrilo : acetato de amonio 0,05 M con un gradiente de ácido trifluoroacético
a una relación desde (32:68) hasta (38:62) a una velocidad de flujo de 215 mL/min. Las fracciones que contenían
el producto de interés, fueron combinadas (1,7 L) ajustadas a pH 9, con hidróxido de sodio y extraídas con cloruro
de metileno (300 mL). La capa de cloruro de metileno fue separada y evaporada a un estado seco, para obtener un
15 producto parcialmente puro. El paso de HPLC de preparación y el paso de extracción fueron repetidos para obtener la
13-(1-metiltio-etil)-eritromicina B pura (31 mg). La estructura del producto fue confirmada mediante espectrometría
de masas (MS) y espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear (NMR)(espectrómetro Bruker DMX 500 MHz)
como sigue:
Espectrometría de masas APCI (M + H)+ observada a m/e 746, requerido para C38 H70 NO12 S-764
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Ejemplo 10b
5 Un experimento similar al del ejemplo 10a, usando el cultivo NRRL/2338 pND30 de S. erythraea, produce al
compuesto ejemplificado en el ejemplo 10a.
Ejemplo 11
El cultivo de NRRL 2338 de S. erythraea fue inoculado en 50 mL de medio de agua corriente en un matraz Erlen-
meyer de 300 mL. Después de 48 horas de incubación a 28ºC, este matraz fue utilizado para inocular 50 L de un medio
de ERY-P en un matraz Erlenmeyer de 300 mL. El caldo fue incubado a 28ºC. Se añadió ácido ciclobutanocarboxílico
15 (20 mL) después de 24 horas y se continuó la fermentación durante 168 horas. Después de este tiempo, se ajustó el pH
del caldo en su totalidad a un pH de 8,5 con hidróxido de sodio acuoso y se extrajo con acetato de etilo (50 mL). El
extracto de acetato de etilo fue separado y concentrado hasta sequedad. La muestra fue disuelta de nuevo en metanol
(1 mL) por análisis de espectrometría de masas - HPLC. Esto confirmó la producción de 13-ciclobutil-eritromicina
B mediante el NRRL 2338 no transformado y no recombinante, tal y como se describe en el Ejemplo 7 en la cepa
20 diseñada genéticamente, que contenía el módulo de carga avr (construcción NRRL 2338/pIG1).
Espectrometría de masas APCI (M + H)+ observada a m/e 744, requerido para C39 H70 NO12 -744.
25
Ejemplo 12
30 El cultivo de NRRL 2338 de S. erythraea fue inoculado en 50 mL de un medio de agua corriente en un matraz
Erlenmeyer de 300 mL. Después de 48 horas de incubación a 28ºC, este matraz fue utilizado para inocular 50 L de un
medio de ERY-P en un matraz Erlenmeyer de 300 mL. El caldo fue incubado a 28ºC. Se añadió ácido ciclopropano-
carboxílico (20 mL) después de 24 horas y se continuó la fermentación durante 168 horas. Después de este tiempo, se
ajustó el pH del caldo en su totalidad a un pH de 8,5 con hidróxido de sodio acuoso y se extrajo con acetato de etilo
35 (50 mL). El extracto de acetato de etilo fue separado y concentrado hasta sequedad. La muestra fue disuelta de nuevo
en metanol (1 mL) por análisis de espectrometría de masas-HPLC.
Espectrometría de masas APCI (M + H)+ observada a m/e 730, requerido para C38 H68 NO12 -730
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Ejemplo 13a
Espectrometría de masas APCI (M + H)+ observada a m/e 760, requerido para C39 H70 NO13 -760
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Ejemplo 13b
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Ejemplo 14a
5 Se inocularon seis matraces Fernbach de 2800 mL con NRRL 2338/pIG1 de S. erythraea. Cada matraz contenía 1 L
de un medio de agua corriente con 50 mg de tioestreptona añadidos a cada matraz. Después de 24 horas de incubación
a 28ºC, se añadieron 200 ppm de ácido ciclopropanocarboxílico a cada matraz. Los matraces fueron incubados durante
90 horas y fueron compuestos dentro de una botella aspiradora estéril de 8 L. La botella aspiradora fue utilizada para
inocular 314 galones de un medio de ERY-P en un recipiente piloto de 500 galones. El caldo fue incubado entre 27ºC
10 y 29ºC a un pH que variaba entre 6,7 y 7,4, a una velocidad de aeración de 20 pies estándar cúbicos/min. y agitándose
a 175 r.p.m. Se añadió ácido ciclopropanocarboxílico (200 mg/L) después de 33 horas, 81 horas y 117 horas. La
fermentación continuó durante 198 horas. Después de este tiempo, se filtró el caldo en su totalidad sobre un filtro de
cerámica de 0,2 µm (filtro Estadounidense, 30 pies2 ). El filtrado se cargó en una columna de resina XAD-16 (12 L;
Rohm and Haas). La columna de resina fue eluida, a continuación, con acetato de etilo (60 L). El acetato de etilo fue
15 concentrado hasta una goma (302 g), a la que se le añadieron 2 L de cloruro de metileno. La solución de cloruro de
metileno resultante, fue lavada con 8 L de un tampón 250 mM de bicarbonato de sodio, pH 9. La capa de cloruro de
metileno rica en eritromicina fue separada y evaporada hasta una goma (200 g) y después suspendida en metanol al
40% (10 L), la cual fue cargada en una columna de resina CG-161 (9 L; Toso Haas). La columna de resina fue lavada
con metanol al 40% (30 L) y eluida secuencialmente con metanol al 75% (8 x 10 L) y metanol puro (3 x 10 L). Las
20 fracciones 5 a 8 de metanol al 75%, que contenían al producto de interés, fueron combinadas y evaporadas a 3,2 L.
El concentrado fue ajustado a pH 9 y se le añadió 0,95 L de cloruro de metileno. La capa de cloruro de metileno fue
separada y evaporada para obtener 12,4 g de una goma. Parte de la goma (seis gramos) fue purificada, adicionalmente,
mediante HPLC en una columna HPLC C18 Kromasil de 10 µm de fase inversa (75 mm x 25 cm) usando una fase
móvil de metanol: acetato de amonio 0,05 M con ácido trifluoroacético isocrático al 0,1% (50:50) a una velocidad de
25 flujo de 215 mL/min. Las fracciones que contenían el producto de interés, fueron combinadas (230 mL), evaporadas a
un concentrado (110 mL) y ajustadas a pH 9, con hidróxido de sodio y extraídas con cloruro de metileno (50 mL). La
capa de cloruro de metileno fue separada y evaporada hasta sequedad, para obtener 630 g del producto parcialmente
puro. Otra porción de la goma (un gramo) fue purificada adicionalmente mediante HPLC preparativa de fase inversa,
usando una columna C8 MetaChem Intersil de 10 µm (75 mm x 25 cm) usando una fase móvil de acetonitrilo : 0,05
30 M de acetato de amonio con un gradiente de ácido trifluoroacético a una relación desde (20:80) hasta (25:75) durante
50 minutos a una velocidad de flujo de 215 mL/min. Las fracciones que contenían el producto de interés (28 a 46
minutos) fueron combinadas, saturadas con bicarbonato de sodio y extraídas con cloruro de metileno. El cloruro de
metileno fue separado y evaporado hasta sequedad, obteniendo 361 mg del producto parcialmente puro. Una porción
de estos materiales parcialmente puros fue purificada adicionalmente mediante HPLC de fase inversa, tal y como se
35 ejemplifica por: una columna Phenomenex Prodigy de 10 µm de fase inversa (50 x 250 mm) usando una fase móvil
de metanol: acetato de amonio 0,05 M con ácido trifluoroacético isocrático al 0,1% (50:50) a una velocidad de flujo
de 100 mL/min. Las fracciones que contenían el producto de interés (27-31 minutos) fueron combinadas, saturadas
con bicarbonato de sodio y extraídas con cloruro de metileno. El cloruro de metileno fue separado y evaporado hasta
sequedad para obtener el producto parcialmente puro. El material fue purificado adicionalmente mediante HPLC de
40 fase inversa, usando una columna Phenomenex Prodigy de 10 µm de fase inversa (50 x 250 mm) usando una fase móvil
de metanol: acetato de amonio 0,05 M con ácido trifluoroacético isocrático al 0,1% (48:52) a una velocidad de flujo
de 100 mL/min. Las fracciones que contenían el producto de interés (41-45 minutos) fueron combinadas, saturadas
con bicarbonato de sodio y extraídas con cloruro de metileno. El cloruro de metileno fue separado y evaporado hasta
sequedad, obteniendo 13-ciclopropil-eritromicina A pura en forma de sólido (20 mg). La estructura del producto
45 fue confirmada mediante espectrometría de masas (MS) y espectrometría de Resonancia Magnética Nuclear (RMN)
(espectrómetro Bruker DMX 500 MHz).
50 Espectrometría de masas APCI (M + H)+ observada a m/e 746, requerido para C36 H66 NO13 -746.
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ES 2 244 001 T3
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Ejemplo 14b
45 Preparación de 13-ciclopropil-eritromicina B usando el NRRL 2338/pND30 de S. erythraea
Un experimento similar al del ejemplo 14a, usando el cultivo NRRL/2338 pND30 de S. erythraea, produce el
compuesto ejemplificado en el ejemplo 14a.
50 Ejemplo 15a
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ES 2 244 001 T3
Ejemplo 15b
5 Un experimento similar al del ejemplo 15a, usando el cultivo NRRL/2338 pND30 de S. erythraea, produce el
compuesto ejemplificado en el ejemplo 15a.
Ejemplo 16
El cultivo de NRRL 18643 de S. erythraea, un mutante eryF de S. erythraea (Science, 252:114, 5 de abril de
1991) fue inoculado en 1L de medio de agua corriente, en un matraz FernBach de 2,8 L. Se añadió ácido ciclopro-
panocarboxílico (200 mL) después de 24 horas de incubación a 28ºC, con una agitación a 200 r.p.m. Después de tres
15 (3) días completos de incubación, se usó un matraz para inocular 8 L de un medio ERY-P complementado (60 g/L
de cerelosa, 30 g/L de harina Nutrisoy, 3 g/L de (NH4 )2 SO4 , 5 g/L de NaCl, 6 g/L de sólidos de maíz empapado, 0,5
g/L de MgSO4 y 1 mL/L de P2000)en un recipiente de fermentación de 14 L. El caldo fue inoculado a 28ºC, con
una velocidad de aeración de 8 L/min. y agitándose a 800 r.p.m. y con un pH mantenido entre 6,9 y 7,3 con NaOH o
H2 SO4 (15%). Se añadió ácido ciclopropanocarboxílico (1,6 mL) después de 24 y 48 horas. La fermentación, que fue
20 hecha en duplicado, fue recogida después de 163 horas de tiempo de incubación total. Se ajustó el pH de todo el caldo
a pH 9 con hidróxido de sodio y el caldo fue extraído con acetato de etilo (16 mL). El acetato de etilo fue concentrado
hasta conseguir un aceite, en una unidad de rotoevaporación Buchi de 20 mL. El aceite fue disuelto, otra vez, con 500
mL de cloruro de metileno. Se añadieron quinientos mL de agua a este líquido y el pH de la fase acuosa fue ajustado
a 9 con hidróxido de amonio al 10%. Después de agitar vigorosamente, se recogió la capa de cloruro de metileno y se
25 evaporó en un matraz de rotoevaporación de 1L, para conseguir 11,0 g del residuo aceitoso. Este material fue disuelto
con 250 mL de una solución de metanol: agua al 4:6, y se cargó en una columna de resina CG-161 (Toso Haas) de
80 mL. Esta columna de resina fue lavada con 350 mL de una solución de metanol: agua al 4:6. A continuación, la
columna fue lavada brevemente a una velocidad de 8 mL/min. con una solución de metanol: agua al 7:3, hasta que las
impurezas coloreadas empezaran a eluirse de la columna (aproximadamente un lavado de 2 volúmenes del lecho). En
30 este momento se inició un procedimiento de gradiente de 1 L, con la concentración de metanol cambiando de 70% a
100%, por un periodo de 1 hora a una velocidad de flujo de 8 mL/min. La fracción que contenía el producto de interés
fue evaporada hasta sequedad y después purificada sobre una columna HPLC C18 Kromasil de 10 µm de fase inversa
(50 mm x 25 cm) usando una fase móvil de acetonitrilo: tampón consistente en acetato de amonio 0,01 M, ácido
trifluoroacético al 0,02% y acetonitrilo al 26% a una relación de (5:95) durante 50 minutos, a una velocidad de flujo de
35 120 mL/min. Esto fue seguido por un gradiente lineal de (5:95) a (33:67) por los siguientes 40 minutos. Las fracciones
que contenían el producto de interés, fueron combinadas (530 mL) ajustadas a pH 9 con hidróxido de amonio al 10%
y extraídas con cloruro de metileno (400 mL). La capa de cloruro de metileno fue separada y evaporada a un estado
seco, para obtener 6-desoxi-13-ciclopropil-eritromicina B pura (12 mg). La estructura del producto fue confirmada
mediante espectrometría de masas (MS).
40
Tiempo de retención de HPLC - Método B - 21,4 minutos.
Espectrometría de masa APCI (M + H)+ observada a m/e 714, requerido para C38 H69 NO12 S-714.
45 Ejemplo 17
El NRRL 18643 de S. erythraea fue inoculado a partir de un periodo de tres días en agar − YPD (extracto de
50 levadura Difco al 0,5%, Peptona Difco Bacto al 0,5%, dextrosa al 0,25%, MOPS al 0,5%, agar Difco Bacto al 1,7% y
pH ajustado a 7,0) en 250 mL de un caldo − YPD (extracto de levadura Difco al 0,5%, Peptona Difco Bacto al 0,5%,
dextrosa al 0,25%, MOPS al 0,5% y pH ajustado a 7,0) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL. El matraz fue incubado
a 225 r.p.m., 29ºC, durante 48 horas. Se inocularon 2,5 mL en un medio ERY-P (dextrosa al 5%, harina Nutrisoy a
3%, (NH4 )2 SO4 al 0,3%, NaCl al 0,5%, CaCO3 al 0,6% y el pH ajustado a 7,0) de 25 mL, e incubado a 225 r.p.m.,
55 29ºC por un total de 6 días. Se añadió ácido butírico al matraz a 24, 72 y 120 horas (400 ppm, 400 ppm, 200 ppm,
respectivamente). El pH del caldo completo fue ajustado, a continuación, a 9,1, usando NaOH 1N. La muestra fue
extraída dos veces con un volumen igual de acetato de etilo. Las fases de acetato de etilo fueron concentradas hasta
sequedad bajo nitrógeno (baño de agua a 50ºC), y después suspendidas de nuevo en 1,0 mL de metanol para el análisis
de espectrometría de masas HPLC. Esto confirmó la producción de la 6-desoxi-13-propil-eritromicina B.
60
Tiempo de retención de HPLC - Método C - 23,5 minutos.
Espectrometría de masa-APCI (M + H)+ observada a m/e 716, requerido para C38 H70 NO11 S-716.
65
45
ES 2 244 001 T3
Ejemplo 18
5 Se llevó a cabo un ensayo antibacteriano in vitro en un microtítulo y se interpretó de acuerdo con Performance
Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests - Sexta Edición; Approved Standard, publicado por las guías de
The National Comitee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Se obtuvieron las concentraciones inhibitorias mí-
nimas (MICs) en contra de varias bacterias. Por ejemplo, Estafilococo aureus B0CR5 (cepa susceptible al macrólido)
produjo valores encontrados en un rango de ≤ 0,1 a 1,56 µg/mL.
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ES 2 244 001 T3
REIVINDICACIONES
1. Compuesto de fórmula 1:
5
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30
35 R1 es (i) un grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxialquilo o alquitioalquilo C3− C8 alfa-ramificado, cualquiera
de los cuales pudiendo estar opcionalmente sustituido por uno o más grupos hidroxilo; (ii) un grupo cicloalquilal-
quilo C5 -C8 en donde el grupo alquilo es un grupo alquilo C2 -C5 alfa-ramificado; (iii) un grupo cicloalquilo C3− C8 o
cicloalquenilo C5 -C8 , cualquiera de los cuales pudiendo estar opcionalmente sustituido por uno o más hidroxilos, o
uno o más grupos alquilo C1− C4 o átomos de halógeno; (iv) o un anillo heterocíclico de 3 a 6 miembros que contiene
40 oxígeno o azufre, que pueda ser saturado, o total o parcialmente insaturado y que puede estar opcionalmente sustituido
por uno o más grupos alquilo C1 -C4 o átomos de halo; (v) fenilo el cual puede estar sustituido opcionalmente, con al
menos, un sustituyente seleccionado de los grupos alquilo C1 -C4 , alcoxi C1 -C4 y alquiltio C1 -C4 , átomos de halógeno,
trifluorometilo y ciano; (vi) un grupo con una fórmula (a) como se muestra abajo:
45
50
R2 es H u OH; R3 -R5 son cada uno, independientemente, H, CH3 o CH2 CH3 ; R6 es H u OH; y R7 es H, CH3 , o
CH2 CH3 ; R8 es H o desosamina; R9 es H, CH3 , o CH2 CH3 ; R10 es OH, micarosa (R13 es H), o cladinosa (R13 es CH3 ),
R11 es H; o R10 =R11 =O; y R12 es H, CH3 , o CH2 CH3 ; o cualquiera de los compuestos definidos arriba, modificados
60 reemplazando uno o más de los grupos que constituyen las posiciones del anillo 3, 5, 7, 9 y 11 con un grupo diferente
seleccionado de >C=O, >CHOH, =CH- y -CH2 -.
47
ES 2 244 001 T3
4. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 2, en donde R1 es ciclobutilo.
7. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde R1 es un grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxial-
quilo o alquitioalquilo C3 -C8 alfa-ramificado.
12. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde R1 es un anillo heterocíclico de 5 ó 6 miembros que
20 contiene oxígeno o azufre, que puede estar sustituido opcionalmente por uno o más grupos hidroxilo o grupos alquilo
C1 -C4 o átomos de halógeno.
16. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde R1 es un grupo de fórmula (a) en donde a y b son 0, c
30 y d son 1 y X es -CH2 -.
17. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde R1 es un grupo de fórmula (a) en donde a y b son 0, c
es 1, d es 2 y X es -CH2 -.
35 18. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde R1 es un grupo de fórmula (a) en donde a y b son 0, c
y d son 1 y X es 0.
19. Procedimiento para preparar un compuesto de fórmula 1 de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende
fermentar un organismo capaz de producir eritromicina caracterizado por el hecho de contiene una sintasa híbrida de
40 policétidos (“PKS”) en el que la molécula que se carga es el módulo de carga de la PKS productora de avermectina
de Streptomyces avermitilis, en presencia de un ácido carboxílico de fórmula R1 CO2 H, en donde R1 es como se ha
definido en la reivindicación 1 o una sal, éster o amida de la misma o un precursor oxidativo de la misma y aislar el
compuesto de fórmula 1.
45 20. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19, en donde el organismo es Saccharopolyspora erythraea,
el cual puede contener opcionalmente un plásmido integrado de manera efectiva, capaz de dirigir la biosíntesis de los
compuestos de la fórmula 1.
21. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20 en donde dicho organismo contiene un plásmido que con-
50 tiene un promotor de pKS Tipo II/gen activador.
22. Procedimiento para preparar un compuesto de fórmula 1 de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende
fermentar una Saccharopolyspora erythraea seleccionada de las cepas NRRL 2338, 18643 y 21484 en presencia de un
ácido carboxílico de fórmula R1 CO2 H en donde R1 es según se define en la reivindicación 1 o una sal, éster o amida
55 del mismo o un precursor oxidativo del mismo y aislar del compuesto de fórmula 1.
23. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22 en donde dicho organismo contiene un plásmido integrado
de manera efectiva, capaz de dirigir la biosíntesis de los compuestos de fórmula 1, conteniendo el plásmido el promotor
actI y a su gen activador cognitivo actII-orf4.
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24. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el organismo incluye un plásmido integrado de
manera efectiva seleccionado de pAVLD, pIG1, pND30, pCJR26, pCJR49, pC-AT12 y pC-ATX.
25. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el organismo es EMRD1 de S. erythraea, NRRL
65 2338/pIG1 de S. erythraea, NRRL 2338/pND30 de S. erythraea.
26. Composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de acuerdo
con la reivindicación 1, en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.
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27. Utilización de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-18 en la fabricación de una
composición para utilizar en el tratamiento de una infección bacteriana o una alteración relacionada con una infección
bacteriana o una infección protozoaria en un mamífero, pez o pájaro.
5 28. Utilización de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 27 en donde el medicamento está destinado al
tratamiento de una infección bacteriana en un mamífero, pez o ave.
29. Utilización de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 para la fabricación de una composición desti-
nada a mejorar un efecto de actuación seleccionado de aumento de peso o utilización de eficiencia de la alimentación
10 en un mamífero, pez o ave, producción de leche, etc.) en un mamífero.
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