Conceptos de relajación en RMN

Oscar Millet
Unidad de Biología Estructural
CICbioGUNE

Curso Avanzado de Resonancia Magnética Nuclear, Jaca 2009

 Relajación: retorno de la magnetización
a la situación de equilibrio térmico

Situación de equilibrio térmico implica:

Ausencia de coherencias.

Restablecimiento de las poblaciones de equilibrio (Boltzmann).

Debido a que la emisión espontánea no es efectiva, en RMN la relajación

Se produce mediante campos magnéticos fluctuantes con la frecuencia
y la orientación adecuadas .
1. Fenomenología de la relajación en RMN
 Relajación: retorno de la magnetización
a la situación de equilibrio térmico

Observables
de relajación

Para un núcleo de espín ½ existen dos

observables independientes de relajación:

El tiempo de relajación longitudinal (T1)

El tiempo de relajación transversal (T2)

Para un núcleo con I = 1 hay 5 observables de relajación

 Relajación Longitudinal

Bo Bo Bo
Z Z Z

R1 = 1/T1

RF Relajación

En moléculas pequeñas T1 ≈ T2
Tiempo largo de reestablecimiento del equilibrio.
nOe de baja intensidad.

En moléculas grandes T1 >> T2.

Alta eficiencia en la transferencia del nOe.
Tiempo de relajación longitudinal (T1)
 Relajación Transversal
Bo Bo Bo
Z Z Z

R1 = 1/T2

RF
Relajación

Ausencia de
relajación

Presencia de Anchura de
relajación Línea espectral !!

Tiempo Frecuencia
Tiempo de relajación transversal (T2)
2. Mecanismos de relajación del espín nuclear
 Mecanismos de relajación en RMN

Interacciones entre el espín nuclear y el entorno (lattice) generan oscilaciones

del campo B0 que introducen los fenómenos de relajación.

Principales mecanismos de relajación:

Relajación dipolo-dipolo.
Anisotropía del desplazamiento químico.
Relajación cuadrupolar (I > ½).
Relajación paramagnética.
Anisotropía de desplazamiento químico
Interacción dipolo-dipolo
 Mecanismos de relajación y dinámica molecular

El movimiento Aparición de un
de la molécula campo
es responsable magnético
último del fluctuante
mecanismo

Movilidad y
flexibilidad molecular
Relajación
Relajación longitudinal (T1)
Relajación transversal (T2)

Observables
de relajación

Movilidad y
flexibilidad molecular

Reorientaciones de la molécula
Flexibilidad segmental
…
 Caracterización de los movimientos moleculares

La función de correlación

G (t ) = B (t ) ⋅ B (t + τ )

Se asume que la función de correlación cumple con una función exponencial:

G(t)=exp(-t/τc) τc= tiempo de correlación

Caracterización de los movimientos moleculares

La función de densidad espectral

∞
J (ω ) = 2 ⋅ Re ∫ G (τ ) ⋅e −iωτ dτ
0
 Caracterización de los movimientos moleculares

X(t) J(ω)
F = -kx

X ωo=(k/m)1/2

- Movilidad + Movilidad
J(ω)
1
H
J(ω)

1H
θ

15 N
15
N
ω (freq)
ω (freq)
Relajación longitudinal (T1)
Relajación transversal (T2)

Observables
de relajación

Teoría de BWR y ecuación master

Movilidad y
flexibilidad molecular

Reorientaciones de la molécula
Flexibilidad segmental
…
 La teoría de Bloch, Wagness y Redfield permite
obtener expresiones para los observables de relajación
Ejemplo: relajación del nitrógeno amida de una proteína

R1 = d2[J(wH - wN) + 3J(wN) + 6J(wH+ wN)] + c2J(wN)

R2 = (d2/2)[4J(0) + J(wH - wN) + 3J(wN) + 6J(wH + wN) + 6J(wH)] +

(c2/6)[4J(0) + J(wN)]

donde d2 = (1/10) γH2/γN2(h/2pi)2·(rNH-3)2 es la constante para la

interacción dipolar

y c2 = (2/15) wN2 (s|| - s^ )2 es la constante para la anisotropía de

desplazamiento químico

Estas expresiones dependen de una serie de frecuencias

determinadas 0, wH, wN, y las combinaciones lineales de las
mismas.
 Análisis de densidad espectral

J(ω)

ω (frequency)
R1 = 1/T1
R2 = 1/T2
R2Z = 1/T2Z
RZZ = 1/TZZ
R1H = 1/T1H
NOENH

J(0) J(wN) J(wH+N)J(wH)J(wH-N)

 Re-determinación
Mapeo de
de las velocidades
densidad
de relajación
espectral
3. Tipos de movimientos que
aparecen en biomoléculas e
información que se puede
extraer de la relajación
 Movimientos locales en proteínas y su relación con la RMN
Nature of Motion

Local or overall unfolding Rotational diffusion Bond librations

Enzyme kinetics Turn reorientation (slow) Turn reorientation (fast)

S-S flipping Side-chain rotameric jumps

Aromatic ring flips

Time scale

103 100 10-3 10-6 10-9 10-12

NMR parameter

NH exchange T2, T1rho T1, T2, nOe

Chemical shift J

Dipolar couplings
 Movimientos locales en proteínas y su relación con la RMN
Nature of Motion

Local or overall unfolding Rotational diffusion Bond librations

Enzyme kinetics Turn reorientation (slow) Turn reorientation (fast)

S-S flipping Side-chain rotameric jumps

Aromatic ring flips

Time scale

103 100 10-3 10-6 10-9 10-12

NMR parameter

NH exchange T2, T1rho T1, T2, nOe

Chemical shift J

Dipolar couplings
Movimientos globales

Difusión
translacional

Difusión rotacional

Tiempo de correlación (tc):

Tiempo requerido por la molécula
para rotar 1 radián alrededor de
un eje de coordenadas.
 Movimiento global versus movilidad interna

Movimientos internos
Bo

Reorientación global

Para que se puedan caracterizar es preciso que esxista independencia

entre los dos movimientos. Esta condición se suele satisfacer cuando
los movimientos son de escalas de tiempo muy diferentes
 1. Determinación del tensor de difusión rotacional.

El cociente de R2/R1 es muy poco sensible a los movimientos internos.

TENSOR (Dominique Marion):

http://www.ibs.fr/ext/labos/LRMN/softs/tensor/ObtainingTensor.html

QUADRIC (Art Palmer):

http://www.hhmi.umbc.edu/toolkit/analysis/palmer/quadric.html

ROTDIF (David Fushman):

http://www.vsnmr.org/FushmanLab/pdsw.html
 Prolato:
Dpar
Dpar > Dper

Dper

Los enlaces N-H de la α-helice son colineares a

Dpar y, por tanto, modulados por Dper. Muestran
valores grandes de R2/R1 (o del τc local).

Los enlaces N-H pertenecientes a hojas β son

perpendiculares a Dpar y, por lo tanto,
modulados por Dpar. Muestran valores
pequeños de R2/R1 (o del τc local).
 2. La aproximación del modelo libre

Si existe total independencia entre los movimientos internos y la

reorientación global:
G(t)=G(t)over· C(t)int = exp(-t/tc)·[(S2+(1-S2)*exp(-t/ti)]

Parámetros Función Función de Observables

de ajuste de densidad Experimentales
(S2, τc, τe) autocorrelación espectral R1, R2
 El parámetro de orden
generalizado (S2)

S2 oscila entre 0 y 1:

S2 = 0 reorientación libre del vector.

S2 = 1 rigidez total.

S2 se puede convertir en un ángulo

de reorientación promedio:

1
H

Ω = θ, φ
15
N

GCN4-58 complejada con DNA

 Movimientos locales en proteínas y su relación con la RMN
Nature of Motion

Local or overall unfolding Rotational diffusion Bond librations

Enzyme kinetics Turn reorientation (slow) Turn reorientation (fast)

S-S flipping Side-chain rotameric jumps

Aromatic ring flips

Time scale

103 100 10-3 10-6 10-9 10-12

NMR parameter

NH exchange T2, T1rho T1, T2, nOe

Chemical shift J

Dipolar couplings
Efecto del intercambio en el espectro de RMN

1.5ppm 1.0ppm
H H

Componente de baja freq. = 1.5ppm

FT Componente de alta freq. = 1.0ppm

1.5ppm 1.0ppm
 Intercambio lento: Kex << Δω

1.5ppm 1.0ppm

H H

Componente baja freq. = 1.5ppm

Suceso de intercambio

FT Componente alta freq. = 1.0ppm

 Intercambio rápido: Kex >> Δω

1.5ppm 1.0ppm

H
H

FT
Promedio de ambas conformaciones

1.25ppm
1.5ppm 1.0ppm

H
H

FT
Promedio de ambas conformaciones

1.25ppm
Intercambio intermedio: Kex ≈ Δω

Límite del intercambio lento

Intercambio intermedio

Límite del intercambio rápido

Intercambio intermedio
Caracterización del intercambio químico por RMN
R2 = R2(intrínseco) + Rex

Una frecuencia de pulsos baja permite observar el intercambio

Una frecuencia de pulsos alta elimina la componente del intercambio

 El intercambio químico conformacional en la escala del
microsegundo-milisegundo acostumbra a analizarse siguiendo
un modelo de dos estados

A B

Parámetros que se pueden extraer:

kex = kon + koff
pA y pB
Δω entre A y B