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Importancia de las técnicas moleculares en la

Fisiología Vegetal 
Dr. Jorge Ariel Torres
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Ing. en Biotecnología
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lisa Juárez Gómez
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11/Agosto/10
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stas nuevas técnicas moleculares en la actualidad le han permitido a los científicos tener
un gran avance en el área de la medicina y en el de la investigación, ya que gracias al
desarrollo de estas técnicas se ha logrado llevar a cabo la producción de medicamentos y
para combatir una serie de enfermedades, que afectan desde hace tiempo tanto a los
animales como a las plantas.
stas técnicas son de relevante importancia en las plantas ya que con ellas podemos
conocer más de su funcionamiento, de sus posibles usos y sobre todo de cómo tratar a
cada uno de estos organismos.
Hoy en día se están realizando experimentos y estudios con estas técnicas empleando
microorganismos como . coli y ciertas levaduras, con tal de prevenir enfermedades,
mejorar la producción y proporcionar una mejor calidad de vida tanto en plantas como en
otros organismos.

Técnicas moleculares
Clonación Molecular

n esta técnica se utilizan células hospedadoras, bacterias por lo general, insertándose el

ADN deseado y cuando esta se reproduce hará múltiples copias de ese ADN.
Una vez aislado el ADN hay que insertarlo en el ADN bacteriano, para ello se utilizan los
vectores de clonación o de clonado. stos vectores son pequeños moléculas de ADN que
tienen capacidad de autorreplicación del ADN de la célula huésped, como plásmidos,
bacteriófagos y cósmidos.
l gen deseado debe ser insertado en los vectores. stos llevan además unos genes
llamados marcadores que sirven para detectar o identificar las células que han
incorporado los vectores. stos marcadores son genes de resistencia a antibióticos (si se
inserta en una bacteria) o genes de bioluminiscencia (si se inserta en una eucarionte). Los
plásmidos naturales no tienen estos marcadores, sino que se añaden artificialmente.

Para insertar el vector en el ADN de la célulahuésped se corta el ADN del vector y el que
contiene el gen deseado con la misma restrictasauniéndose con la ligasa. Así se obtiene
un ADN recombinante.

Una transformación es la introducción de un ADN extraño en bacterias, ya sea de forma

natural o por vectores, si el vector es un virus la transformación se llama transducción. Si
se hace en un eucarionte se llama transfección, y si se inserta en las células germinales
de estos se llama transgénesis y los descendientes de estos organismos, los conocemos
comúnmente como transgénicos u organismos modificados genéticamente (OMG).

Ya transformadas las bacterias, se transfieren a un medio de cultivo para que se

multipliquen. Al mismo tiempo se replican los vectores de clonado y así se obtienen
múltiples copias del gen deseado. Cada grupo de bacterias que proceden de una sola,
llevarán ese vector y ese gen, este grupo constituye un clon. Así se obtienen tantos
clones como fragmentos de ADN se hayan insertado en las bacterias. l conjunto de
clones obtenido se denominabiblioteca genómica o genotecas.

Secuenciación de ADN

Son los métodos y técnicas bioquímicas cuyo propósito es el de determinar el orden de

los nucleótidos en un oligonucleótido de ADN. stos son los métodosmás usados para
realizar este proceso:

Œ Secuenciación de Maxam-Gilbert

ste método se basa en la modificación del ADN y la escisión de bases especificas.

n este se presenta un marcaje radiactivo en uno de los extremos y la purificación del
fragmento de ADN que se desea secuenciar. l tratamiento químico genera rupturas
en una pequeña proporción de uno o dos de los cuatro nucleótidos en cada una de las
cuatro reacciones. Generándose una serie de fragmentos marcados a partir del final
marcado radiactivamente hasta el primer lugar de "corte" en cada molécula. stos
fragmentos se separan por tamaño mediante electroforesis en gel, separando los
productos de las cuatro reacciones en cuatro carreras distintas, pero una al lado de la
otra. Se realiza una autoradiografia, para visualizar los fragmentos generados en cada
reacción, lo que proporciona una imagen de una serie de bandas oscuras
correspondientes a los fragmentos marcados con el radioisótopo, a partir de las cuales
se puede inferir la secuencia.

Œ Secuenciación de Sanger

Para este método es necesario contar con una hebra molde de ADN de cadena
sencilla, un cebador de ADN, una ADN polimerasa con nucleótidos marcados
radiactivamente o mediante fluorescencia y nucleótidos modificados que terminan la
elongación de la cadena de ADN. La muestra de ADN se divide en cuatro reacciones
de secuenciación separadas que contienen los cuatro desoxinucleótidos estándar y
una ADN polimerasa. n cada reacción se añade solo uno de los cuatro
didesoxinucleótidos, estos terminan la elongación de la cadena al carecer un grupo 3'-
OH que se necesita para la formación del enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos
durante la elongación de la cadena de ADN. La incorporación de un
didesoxinucleótido en la cadena naciente de ADN termina su extensión, lo que
produce varios fragmentos de ADN de longitud variable. Los didesoxinucleótidos se
añaden a concentraciones lo suficientemente bajas como para que produzcan todas
las posibilidades de fragmentos y al mismo tiempo sean suficientes para realizar la
secuenciación.

Los fragmentos de ADN sintetizados y marcados de nuevo son desnaturalizados por

calor y separados por tamaño mediante electroforesis en gel de poliacrilamida - urea.
Cada una de las cuatro reacciones de síntesis se corre en carriles individuales se
visualizan las bandas de ADN mediante autoradiografía o luz ultravioleta, y la
secuencia de ADN se puede leer directamente a partir de la placa de rayos X o de la
imagen del gel.
 Œ Secuenciación por terminador fluorescente

staa secuenciación se lleva a cabo en una sola reacción, marcándose cada uno de
los cuatro didesoxinucleótidos que terminan la cadena con un colorante fluorescente
diferente, con fluorescencias a diferentes longitudes de onda.apesar de que este
método es muy rápido y mucho menos costoso que los anteriores produce alturas y
formas de picos desiguales en los registros de secuencia de ADN del cromatograma
tras la electroforesis capilar.

La Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)

l objetivo de esta técnica es el de amplificar o crear copias múltiples del ADN, sin utilizar
un organismo vivo, tal como la 
o una levadura. También se emplea en la detección
de enfermedades hereditarias, la identificación de huellas digitales genéticas, diagnóstico
clínico, análisis forense del ADN, detección de patógenos en el hombre, animales,
plantas, y alimentos, e investigación en biología molecular.

l procedimiento requiere una plantilla de ADN que puede estar presente en la muestra
en pequeñas cantidades, dos primers oligonucleótidos que flanquean las secuencias de la
plantilla de ADN que va a ser amplificado; y una ADN-polimerasa estable el
calentamiento3
Los ensayos de PCR constan de 30 ciclos, donde cada ciclo consiste en una fase de
desnaturalización, en donde la doble hebra de ADN es fundida en hebras únicas; una fase
de alineación, en donde los primers se unen a las secuencias blanco en las hebras
separadas; y una fase de extensión, en donde la síntesis de ADN procede de los primers
a partir de cada hebra de la plantilla de ADN, generando dos nuevas copias de la doble
hebra de la plantilla original. Después de cada 30 ciclos, una sola copia inicial de la
plantilla de ADN puede llegar a ser amplificado hasta 1 billón de copias.

Utilización de marcadores moleculares

Con el uso de estos marcadores podemos identificar la presencia de genes y sus

respectivas expresiones. Los Marcadores Moleculares son la principal herramienta
utilizada hoy en día en microorganismos, plantas y animales para:

- Caracterización de germoplasma
- Identificación de genotipos y determinación de pureza
- Análisis de diversidad genética en animales, plantas superiores, patógenos y
plagas (virus, hongos, insectos, nemátodos)
- Selección asistida (resistencia a enfermedades, calidad proteica de cereales, etc.)

- Aislamiento y caracterización de genes específicos para usar en Mejoramiento

Genético por Transgenia
xisten dos tipos de marcadores moleculares: los marcadores bioquímicos y los
marcadores de ADN. Y estos pueden ser los RFLPs (restricted fragment length
polymorphisms) y los RAPDs (random amplified polymorphic DNA). stos marcadores
han permitido el confeccionar mapas de ligamiento de alta densidad en el genoma.

Determinación de un mapa génico

La elaboración de los mapas génicos consiste en determinar las posiciones relativas de

los genes en un cromosoma y la distancia entre ellos. Los mapas de genes pueden ser
"mapas genéticos o de ligamiento", los cuales determinan una distancia estadística entre
dos genes, o pueden ser un "mapa físico", el cual determina la distancia entre dos genes
por los nucleótidos o pares de bases del ADN.

Fuentes de información

ΠMolecular genetics of plant development, byStephen H. Howell, Cambridge

University Press, 1998 - 365 páginas.
ΠPlant growth and development, by Lalit Mohan Srivastava, Academic Press, 2002 -
772 páginas
Œ Importancia y uso actual de las técnicas moleculares en el análisis y tipificación de
patógenos. Obtenida el día: 11/Agosto/10. De:
http://www.monografias.com/trabajos45/tecnicas-moleculares/tecnicas-
moleculares.shtml
Œ IngenieríaGenética. Obtenida el día: 11/Agosto/10. De:
http://www.monografias.com/trabajos5/ingen/ingen.shtml