Universidad Politécnica del Estado de Morelos

Actividad catalasa y tinción Gram

Borja Galván Grecia Athinai; Cruz Bahena Saray; Hernández Gil Karla Andrea;
Jiménez Chino Ana Laura
Ingeniería en Biotecnología 4º B

la decoloración y aparecen de color azul

INTRODUCCIÓN
La tinción es un proceso por el cual las
moléculas de un colorante se absorben a
una superficie. El uso de colorantes
permite cambiar el color de los
microorganismos y poder realizar la
observación en microscopio óptico. Dado
que las bacterias son casi incoloras, no
presentan contraste con el medio en el
cual se encuentran suspendidas y no
pueden observarse claramente sin algún
tratamiento previo. Las tinciones se
clasifican en:
Simple: el colorante utilizado sirve solo
para denotar la morfología celular.
Diferencial: el colorante utilizado pone de
manifiesto diferencias entre células
bacterianas o entre partes de una misma
célula, estas técnicas utilizan más de un
colorante o bien ciertos reactivos
complementarios para la tinción. (Hylary,
2014)
Tinción de Gram
Es definida como una tinción diferencial,
ya que utiliza dos colorantes y clasifica a
las bacterias en dos grandes grupos:
bacterias Gram negativas y bacterias
Gram positivas.
Los principios de la tinción de Gram
están basados en las características de
la pared celular de las bacterias, la cual
le confiere propiedades determinantes a
cada microorganismo.
Las bacterias Gram positivas poseen una
pared celular gruesa constituida por
peptidoglicano, pero no cuentan con
membrana celular externa. Las bacterias
G+ retienen el cristal-violeta después de
intenso /purpura.
La pared celular de las bacterias Gram
negativas está constituida por una capa
fina de peptidoglicano y una membrana
celular externa, cuyo componente
estructural único son los
lipopolisacáridos. Las bacterias G- no
son capaces de retener el cristal-violeta
después de la decoloración y son teñidas
de rojo con safranina. (Telmeds, 2016)
Las pruebas bioquímicas se emplean
para identificar de forma clara y precisa,
la presencia o ausencia de una enzima,
de un grupo de enzimas, o de una vía
metabólica completa en uno o más
microorganismos. (Gil, 2015)
Fundamento de la prueba de catalasa.
El peróxido de hidrógeno es el producto
final del metabolismo oxidativo de
carbohidratos, a esta vía metabólica
recibe el nombre de metabolismo
aerobio-oxidativo.
La acumulación del peróxido es muy
toxico por lo que la mayoría de las
bacterias aerobias y anaerobias
facultativas exceptuando a Streptococcus
sp. producen una enzima llamada
catalasa que degrada el peróxido de
hidrógeno obteniendo como productos
agua y oxígeno (UNAM, 2011).
El reactivo utilizado en la prueba es el
peróxido de hidrogeno al 3%. Si se
observa el burbujeo generalmente
intenso significa que hay producción de
oxígeno por lo tanto se entiende que hay
presencia de la enzima catalasa y que la
bacteria analizada es aerobia o
anaerobia facultativa.
Mac Conkey Agar. MATERIAL
Este medio se utiliza para el aislamiento 1 Asa bacteriológica
de bacilos Gram negativos de fácil
15 Porta objetos
desarrollo, aerobios y anaerobios
facultativos. Permite diferenciar bacterias 15 Cubre objetos
que utilizan o no, lactosa en muestras
clínicas, de agua y alimentos. Todas las 10 Pipetas Pasteur
especies de la familia 10 Bombillas para pipeta Pasteur
Enterobacteriaceae desarrollan en el
mismo. 1 Vaso de precipitado 100 ml

En el medio de cultivo, las peptonas, 1 Piseta con agua destilada

aportan los nutrientes necesarios para el
2 Mechero Bunsen
desarrollo bacteriano, la lactosa es el
hidrato de carbono fermentable, y la 1 Microscopio Óptico
mezcla de sales biliares y el cristal
violeta son los agentes selectivos que Aceite de inmersion
inhiben el desarrollo de gran parte de la Papel Toalla
flora Gram+. Por fermentación de la
lactosa, disminuye el pH alrededor de la OTROS MATERIALES
colonia. Esto produce un viraje del color
1 Paquete de Algodón
del indicador de pH (rojo neutro), la
absorción en las colonias, y la 1 Paquete de Gasa
precipitación de las sales biliares.
Los microorganismos no fermentadores 1 Encendedor
de lactosa producen colonias incoloras 1 Marcador Indeleble “sharpie”
(Laboratorios Britania, 2017).
1 Masking Tape
1 Papel Aluminio
Objetivos:
Reactivos
General
Solución cristal violeta 2 1 0
Identificar el tipo de microorganismo
presente en las muestras dadas por el Solución yódica de Gram 1 1 0
profesor. Alcohol absoluto 0 3 0
Específicos Azul de metileno 1 1 0
-Realizar adecuadamente tinciones de Peróxido de hidrógeno 2 0 3
Gram, identificando cada una de las
muestras dadas.
-Cultivar las colonias dadas por estriado
en agar MacConkey.
-Comprobar la presencia de la enzima
catalasa en las muestras.
METODOLOGÍA TINCIÓN DE GRAM:
TINCIÓN 1. Cubrimos la preparación con cristal
violeta durante 1 minuto.
PROCEDIMIENTO:
2. Lo lavamos con agua del grifo por 5
Fijación de la muestra:
segundos, evitando que el chorro de
1. Lavamos perfectamente los agua cayera directamente sobre la
portaobjetos con agua y jabón; ya que preparación.
los lavamos, los limpiamos por ambos
3. Sacudimos el portaobjetos para
lados por si llegaban a contener grasa o
eliminar el exceso de agua.
algún residuo.
4. Cubrimos la preparación con lugol
2. Los secamos con papel toalla y
durante 1 minuto.
terminamos de limpiarlos pasándolos por
la flama del mechero 5 veces. 5. Lavamos con agua de grifo durante 5
segundos igual que en el paso 2.
3. Los dejamos enfriar, con la cara
flameada hacia arriba. 6. Aplicamos el alcohol para eliminar el
exceso de colorante. Y lo hicimos hasta
4. Con el marcador indeleble, marcamos
que ya no escurrió colorante de la
el lado flameado, que es el mismo en el
preparación.
que se encontró la tinción.
7. Lavamos con agua de grifo durante 5
5. El alambre del asa bacteriológica se
segundos igual que en el paso 2.
flameó totalmente hasta que se puso
rojo. Lo retiramos de la flama y se dejó 8. Cubrimos la preparación con safranina
enfriar sin que tocar ningún objeto. durante 1 minuto.
6. Con el asa, colocamos una gota de 9. Lavamos con agua de grifo durante 5
agua destilada en medio del segundos igual que en el paso 2.
portaobjetos.
10. Colocamos el portaobjetos sobre el
7. Flameamos nuevamente el asa, papel toalla y lo secamos colocándolo
tomamos una mínima cantidad de sobre el otra capa de papel toalla y
muestra extendiéndola hasta que se haciendo presión suavemente.
observó una capa fina apenas
11. Dejamos que la muestra se secó
perceptible.
totalmente antes de que realizáramos las
8. Se flameó el asa antes y después de observaciones al microscopio.
usarla.
9. Se dejó secar la preparación al aire.
10. Una vez seca, se fijó con calor,
pasando la lámina con la preparación
hacia arriba, tres veces por la flama.
11. Después de eso la preparación
estuvo lista para ser teñida.
PRUEBA CATALASA
PROCEDIMIENTO:
1. En un portaobjetos limpio se colocaron
con la ayuda de un asa bacteriológica, un
poco de una colonia joven lo que
significó que el tiempo transcurrido desde
la resiembra fue de aproximadamente de
48 h.
2. Posteriormente se colocamos unas
gotas de peróxido de hidrógeno al 3%
sobre la bacteria extendida en la placa.
Si la bacteria presentó efervescencia
después de que le aplicamos el peróxido
de hidrógeno, el resultado de la prueba
se consideró positivo, de lo contrario, el
resultado se consideró negativo.
RESULTADOS
Las tres muestras se realizaron por
triplicado, mismas que dieron positivo
(Tabla 1) a la prueba de catalasa.
Tabla 1.- Prueba de catalasa
Muestra Actividad
1 +++--
2 ++++-
3 +++++
Tabla 2. Morfología microscópica
Muestra Morfología
1 Bacilos Gram (-)
2 Bacilos Gram (-)
3 Cocos Gram (-)
Después de 24 hrs hubo crecimiento de
las muestras 1 y 2 en agar selectivo
MacConkey (Tabla 3)
Tabla 3.- Morfología macroscópica
Muestra Resultado de
crecimiento
1 Rosadas mucosas
2 Rosadas mucosas
3 No hubo crecimiento
DISCUSIÓN
Las bacterias gram-positivas y gram-
negativas tiñen de forma distinta debido
a las diferencias constitutivas en la
estructura de sus paredes celulares. L as
Gram positivas poseen una capa gruesa
de peptidoglicán y carecen de membrana
externa, mientras que las Gram
negativas tienen una capa más delgada
de peptidoglicán y poseen una
membrana externa. Los microorganismos
identificados en las muestras 1 y 2
fueron bacilos Gram negativos ya que al
hacer la tinción de Gram estas retuvieron
un color rojo-rosado (Figura 1) y la
muestra 3, retuvo un color violeta- azul lo
que indica ser un organismo Gram
positivo (Figura 2).
Figura 1.- Muestra 1
 concentración de la enzima, cuando hay
suficiente sustrato. A más bajas
concentraciones de sustrato, algunas
moléculas de enzima permanecen
ociosas. Al aumentar el sustrato, más y
más moléculas de enzima trabajan. Esto
sucede en las muestras, ya que la
actividad enzimática de la enzima
catalasa depende de la concentración de
sustrato agregado (H2O2) y de la
cantidad de enzima (colonia de la
muestra).

El agar MacConkey utilizado en la

separación de las bacterias
fermentadoras de lactosa de aquellas
Figura 2.- Muestra 3
que no la fermentan, contiene sales
Las pruebas bioquímicas permiten biliares y cristal violeta, que ejercen una
determinar las características inhibición significativa sobre las bacterias
metabólicas de las bacterias objeto de Gram positivas. La lactosa y el indicador
identificación. Algunas de estas pruebas rojo neutro permiten comprobar la
son técnicas rápidas, ya que evalúan la degradación de este disacárido; las
presencia de una enzima preformada y colonias lactosa positivas (Escherichia
su lectura varía entre unos segundos coli) aparecen rojas con halo turbio; las
hasta unas pocas horas. Otras pruebas lactosa negativas (Salmonella spp.) son
requieren para su lectura el crecimiento incoloras (Stanchi, 2007)
del microorganismo con una incubación
Se observó un crecimiento de colonias
previa de 18 a 48h; a este grupo
agrupadas, medianas, circulares,
pertenecen la mayoría de las pruebas
convexas, con bordes redondeados,
que detectan componentes metabólicos
lactosa positivas lo que les da coloración
o aquellas que determinan la sensibilidad
rosada (Figura 3).
de un microorganismo a una sustancia
dada tras cultivo en medios de
identificación que contienen el sustrato a
metabolizar.
La catalasa como parte del sistema
antioxidante está involucrada en la
destrucción del H2O generado durante el
metabolismo celular. Esta enzima se
caracteriza por su alta capacidad de
reacción pero relativamente poca
afinidad por el sustrato (Srivastava y Figura 3.- Crecimiento de colonias en agar
MacConkey
Ansari).
La tasa de una reacción o su velocidad
(v) es directamente proporcional a la
CONCLUSIÓN
De acuerdo a los resultados obtenidos en
las pruebas bioquímicas (prueba de
catalasa y agar MacConkey) y tinción de
Gram, los microorganismos
probablemente presentes en la muestra
1 y 2 son E. coli y K. pneumoniae ya que
dieron positivo en la prueba de agar
MacConkey y catalasa y se observó
morfología de bacilos Gram negativos.
Con respecto a la muestra 3, no se pudo
identificar el microrganismo debido a que
no hubo crecimiento en el agar
MacConkey, sin embargo la prueba de
catalasa dio positivo y en la tinción se
observaron cocos Gram positivos.
BIBLIOGRAFÍA
Gil. (23 de Noviembre de 2015).
microbitosblog. Obtenido de
http://microbitosblog.com/2011/09/
27/pruebas-bioquimicas-primarias/
Hylary, Q. (29 de Octubre de 2014). Métodos
y Técnicas de Tinción. Obtenido de
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pot.mx/2014/10/metodos-y-
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Obtenido de BritaniaLab:
http://www.britanialab.com.ar/esp/
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Srivastava, S., & Ansari, N. (s.f.). The
peroxidatic and catalitic activity of
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Stanchi, O. (s.f.). Microbiología Veterinaria.
Buenos Aires: Intermedica.
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http://www.telmeds.org/wp-
content/uploads/2016/11/Tincion-
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UNAM. (2011). facultad de quimica UNAM.
Obtenido de Uso de Pruebas
Bioquímicas y Técnicas Rápidas para
la Caracterización:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/a
rchivero/Practica6.2PruebasBioquimi
cas_21633.pdf