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Conocer y aplicar las técnicas de análisis instrumental, que son más comunes en los
laboratorios de las bodegas o asesorías vitivinícolas. Para ello hay que conocer el fundamento
teórico de las técnicas, además de saber interpretar los procedimientos de análisis y llevarlos
a la práctica.
Dado que estas técnicas analíticas están en constante evolución, es necesario insistir en que
hay que comprender a la perfección sus fundamentos teóricos. Esta circunstancia favorecerá
nuestra adaptación a los continuos avances en el equipamiento instrumental.
- Identificar las distintas técnicas de análisis instrumental, con aplicación en el ámbito del
análisis enológico.
- Conocer el fundamento y las especificaciones de cada técnica, para poder adecuarnos a los
cambios continuos de este tipo de técnicas, sin que sea necesario un periodo de formación
cada vez que se cambia el equipo o se mejora la técnica. Además un mismo tipo de equipo
puede ser utilizado para fines muy diferentes, según las necesidades.
- Aplicar estas técnicas en el laboratorio siguiendo los procedimientos, teniendo en cuenta el
código de buenas prácticas y obteniendo unos resultados acordes con el problema planteado.
- Llevar a cabo o establecer un programa de mantenimiento de estos equipos, de manera que
se garantice la fiabilidad de los resultados y la duración de los mismos.
ANÁLISIS INSTRUMENTAL
En los laboratorios enológicos cada vez hay menos material y equipos clásicos, que van siendo
sustituidos por aparatos e instrumentos electrónicos.
En efecto, los avances tecnológicos y los trabajos de investigación, nos demuestran que pese
a la elevada inversión inicial que supone la adquisición de equipos de análisis instrumental, su
rentabilidad es indiscutible siempre y cuando el volumen de muestras sea el suficiente.
La elección, mantenimiento y buen uso de los modernos equipos de análisis, requiere una
comprensión de cuales son los principios fundamentales en los que se basan. Sólo de esta
manera es posible aplicar los procedimientos con un espíritu crítico, eligiendo la mejor opción
y conscientes de que también tienen limitaciones. Además, en la mayoría de los casos, siguen
necesitando de un proceso de preparación de la muestra, lo que asocia el análisis
instrumental a los procesos habituales y clásicos de laboratorio.
Una de las ventajas de las técnicas instrumentales, es que van abriendo el camino a la
posibilidad de implantación de métodos automáticos de análisis. Por ejemplo, en el control
de materia prima en la recepción de una bodega, donde una sonda extrae una muestra y
analiza el contenido enazúcares, pH y testigos de podredumbre (actividad enzimática).
Las técnicas actuales de análisis instrumental son muchas y muy diversas, por lo que es
necesario centrarse en aquéllas que tienen una aplicación en los laboratorios enológicos. Aún
así debemos ser conscientes de que es un campo en constante evolución, lo que supone que
técnicas que hoy en día no son usuales en los laboratorios enológicos, en un futuro próximo se
pueden convertir en habituales.
CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS ANALÍTICAS INSTRUMENTALES
Ya que según la finalidad o información que se busca con el análisis, puedemos clasificar las
técnicas analíticas en cualitativas y cuantitativas y que, según cual sea la propiedad
medida, hablamos de análisis gravimétrico, volumétrico e instrumental.
El análisis instrumental puede tener una finalidad cualitativa, cuantitativa o ambas. Según
la propiedad que se va a medir y simplificando mucho, hablaremos de métodos ópticos,
métodos electroanalíticos y métodos cromatográficos.
Casi todos ellos tienen aplicación en el campo analítico de la enología, aunque no en los
laboratorios de control de una bodega o asesoría vitivinícola.
Es necesario fijar cuáles son las características de funcionamiento que necesitamos que
cumplan los instrumentos analíticos.
La manera más directa de hacerlo es, definir unos criterios cuantitativos que te permitan
saber y decidir si un determinado método instrumental, es el más adecuado para resolver el
problema analítico al que nos enfrentemos.
Los términos numéricos que definen estos criterios, son los parámetros de calidad para un
trabajo determinado y nos permiten elegir entre los métodos instrumentales disponibles,
descartando aquellos que no cumplan con estos parámetros. Los parámetros más importantes
son:
Los parámetros de calidad para evaluar la precisión, son términos estadísticos como la
desviación estándar, la desviación relativa de la media o la varianza.
- Exactitud: Entendida como la diferencia existente entre el valor medio del resultado
obtenido y el valor real de la magnitud medida. Para evaluarla es necesario recurrir
a patrones de referencia. Los parámetros de calidad para evaluar la exactitud se basan en
cuantificar el error sistemático. Se suelen corregir mediante calibración o mediante el ajuste
con un blanco.
- Sensibilidad: Entendida como la capacidad que tiene un equipo, para distinguir entre dos
muestras con características muy próximas. Los factores de calidad para evaluar la
sensibilidad, están asociados al resultado de la calibración, sobre todo a la pendiente de la
curva de calibración cuando es lineal.
Además de estos criterios, es necesario tener en cuenta la capacidad del equipo para ser
selectivo con el analito que se pretende determinar y, por supuesto, que permita adaptarse al
rango de concentraciones de las muestras para las que se destina.
Cuando son varios los equipos cuyos parámetros cumplen con los requisitos exigidos, se
pueden tener en cuenta otra serie de características como coste, rapidez, tamaño, etc. que
completarán el proceso de elección del equipo más adecuado.
ESTANDARIZACIÓN Y CALIBRACIÓN
- Calibración: Es un término definido por la norma ISO como "el conjunto de operaciones que
permiten establecer, en determinadas condiciones experimentales, la relación que existe
entre los valores indicados por un aparato o sistema de medida, con los valores obtenidos de
la medida de un valor conocido."
Ambas definiciones son muy semejantes, por lo que los términos de estandarización y
calibración son empleados en los laboratorios indistintamente, para comprobar la fiabilidad
de los resultados analíticos, sobre todo, en técnicas de análisis instrumental.
Los equipos se deben calibrar, ya que esta necesidad obedece a que los componentes
envejecen, a que el funcionamiento está condicionado por la humedad y temperatura de los
locales, así como por el trato de los operarios y operarias del laboratorio. Estos factores
hacen que sus funciones sufran un deterioro paulatino, lo que supone una pérdida de
fiabilidad de los resultados obtenidos. Para evitarlo se recurre al calibrado.
- Procedimientos absolutos: Se basan en relacionar la señal del aparato con una magnitud
física y realizar el ajuste de la escala o sistema de medida. La calibración de una balanza con
una pesa patrón o la de un refractómetro con agua destilada, son ejemplos de este tipo de
calibración.
- Procedimientos estequiométricos: Se trata de aplicar un mismo procedimiento analítico a
un patrón valorado y a una muestra con relación definida entre ellos. La valoración de un
reactivo para volumetría es un buen ejemplo.
- Procedimientos comparativos: Se aplica el mismo procedimiento a patrones y muestras,
relacionándolos mediante una función numérica o gráfica. Este procedimiento es el que se
aplica mayoritariamente en análisis instrumental. Los equipos de análisis están compuestos
por una serie de componentes con funciones específicas, que sería necesario calibrar
individualmente lo cual resultaría lento y costoso, por lo que se recurre a calibrar el equipo
en su conjunto. En muchos casos, la calibración del equipo es una parte del procedimiento de
análisis. En otros, los aparatos están equipados con sistemas de autocalibrado, introduciendo
una muestra patrón cada x muestras.
MÉTODOS ELECTROANALÍTICOS
Se trata de métodos que se basan en las propiedades eléctricas que presenta una disolución
del analito cuando forma parte de una celda electroquímica, por lo que también se
denominan electroquímicos de análisis. Al tratarse de procesos de oxidación - reducción.
Una celda electroquímica consiste en 2 electrodos, cada uno sumergido en una solución
electrolítica y unidos externamente mediante un conductor. Según la teoría de los procesos
redox, cuando ponemos en contacto dos electrolitos con potencial redox diferente, uno
actuará como oxidante y otro como reductor, generándose una transferencia de electrones,
cedidos por el reductor y aceptados por el oxidante. Si cerramos el circuito mediante un
puente salino, obtenemos una diferencia de potencial entre los electrodos, que es
proporcional a las concentraciones de los electrolitos (ecuación de Nerst).
Los aparatos de electroanálisis, amplifican la señal eléctrica generada, para relacionarla con
la concentración de un electrolito en disolución.
Los métodos electroanalíticos con más aplicación en enología, son los métodos
potenciométricos, ya que pueden ser usados tanto para poner de relieve el punto final de una
volumetría, como para una medida directa del pH o el potencial redox. Los equipos utilizados
se denominanpotenciómetros.
Para poder medir el potencial eléctrico de una disolución, necesitamos un sistema formado
por una celda electroquímica de potencial constante, de manera que al introducirlo en una
solución electrolítica, será cuando su potencial se modifique de forma proporcional a la
concentración de dicha solución.
Esta celda está formada por un electrodo indicador, sensible a un determinado tipo de iones
y un electrodo de referencia, de potencial fijo, unidos por un conductor e inmersos en
sendas soluciones electrolíticas. Mediante conductores metálicos se completa el circuito de
amplificación de la señal y salida a la pantalla informativa.
- Electrodos de referencia: Los más comunes son los de plata - cloruro de plata y el de
calomelanos.
DETERMINACIÓN DE PH
El concepto de pH es un término habitual en la vida cotidiana (pH de los productos higiénicos,
de los cosméticos, de los alimentos, del agua, etc). Para su determinación en una disolución,
vino, mosto o cualquier otro producto derivado, se utiliza un método potenciométrico,
denominándose pH-metro (también peachímetro) al equipo de medida del mismo.
Sustituyendo los valores de R, n y F, a 25ºC (298 K) y combinando con la definición de pH, nos
queda como E = -0,059 pH
Por lo tanto, para saber el valor del pH de una disolución, podemos recurrir a un
potenciómetro, pues existe una relación directa entre el potencial y el pH. Es importante
reseñar, que esta relación numérica depende de la temperatura, por lo que es necesario
indicarla para que el equipo realice la corrección correspondiente.
Debido a que el electrodo sufre una degradación paulatina, es necesario calibrarlo antes de su
uso. Para ello, se deben seguir las instrucciones de uso o la instrucción técnica
correspondiente, pues cada equipo lleva una secuencia de teclas o acciones diferentes. En
todo caso, deberemos de seleccionar la calibración con soluciones tampón de pH lo más
próximo posible al pH de la muestra.
Las soluciones tampón deben de ser trazables frente a SRM de NIST (Standard Reference
Materials del National Institute of Standards and Tecnology), con precisión ± 0.02,
encontrándose en el mercado en monodosis, cápsulas de soluciones concentradas o listas para
usar. Deberás controlar su fecha de caducidad y el certificado de análisis.
EL ELECTRODO DE VIDRIO Y REFERENCIA
Pero para poder actuar como electrodo indicador, necesita de un electrodo de referencia,
siendo en este caso el electrodo de calomelano el más usado.
El electrodo de vidrio, como electrodo indicador de pH, fue identificado por M. Cremer en
1906 y posteriormente por F. Haber (1909) y otros investigadores, que se dedicaron a
investigar sobre la composición del vidrio, intentando mejorar la sensibilidad a la variación de
pH modificando la composición del mismo. Pero su utilización como electrodo es posterior,
cuando se incorporó el tubo de vacío que permite la medida de las variaciones de potencial
generadas.
Los electrodos empleados en la actualidad tienen como base un vidrio altamente sensible.
En el interior del bulbo hay una disolución ácido clorhídrico diluido, saturado de cloruro de
plata, lo que constituye una disolución tampón de pH invariable.
En la estructura del vidrio existen iones de litio y sodio, que se pueden mover entre los
intersticios de la red tridimensional formada por grupos SiO46-. Estos iones monovalentes, son
los responsables de la conducción eléctrica en el seno del vidrio.
Este tipo de vidrio es higroscópico, por lo que debe de estar hidratado para que funcione
como sensor de pH. Al hidratarse se produce una reacción de intercambio entre los iones
monovalentes del vidrio y los cationes del agua.
Por lo tanto las posiciones de estos dos equilibrios están determinadas por las actividades
(concentraciones) de los hidrogeniones en las disoluciones interna y externa del electrodo, de
tal manera que la interfase en la que tiene lugar más disociación, se transforma en negativa
respecto a la otra superficie. De esta manera, se establece una diferencia de potencial entre
la interfase interna y externa, denominado potencial límite (El), que es el parámetro que
usamos para medir el pH con un electrodo de vidrio.
El papel del electrodo de plata / coluro de plata del electrodo de vidrio y el electrodo de
referencia externo al electrodo de vidrio, es el de servir de contactos eléctricos para poder
medir el potencial.
El potencial del electrodo de vidrio, será pues el resultante de los dos potenciales de las
interfases, el potencial del electrodo de plata/cloruro de plata interno y el
llamado potencial de asimetría.
El potencial de la interfase externa viene dado por la ecuación de Nerst para el sistema:
En las que k1 y k2 son constantes, a'1 y a'2 son las actividades del H+ en las interfases
externa e interna y a1 y a2 son las actividades del H+ en las soluciones externa e interna.
Para una membrana de vidrio polarizable homogénea, k1 y k2 son idénticas al igual que a'1 y
a'2. Teniendo en cuenta estos valores, el potencial del electrodo vendrá dado por la
expresión:
o lo que es lo mismo
y donde
Teniendo en cuenta estos dos potenciales, el potencial del electrodo de vidrio será:
donde
Evidentemente, para poder medir el potencial del electrodo de vidrio se necesita compararlo
con un electrodo de referencia, generalmente de calomelano, cuyo potencial es fijo e
independiente del pH. En los electrodos combinados, este electrodo se incluye en una misma
carcasa de vidrio o plástico, que incluso puede incluir también un sensor de temperatura.
Para usos industriales se usan electrodos separados.
Como es difícil valorar la variación de los valores de L, necesitamos calibrar los equipos de
medida frente a patrones de valor de pH conocido antes de usarlos.
Para medir el pH de un vino o un mosto, debemos de proceder con sutileza, pues a pesar de
ser una determinación sencilla, la exactitud de su resultado es de gran importancia para otros
aspectos enológicos. El procedimiento es el siguiente:
Material y reactivos:
- pH-metro que permita lecturas con aproximación de 0,01 unidades.
- Electrodo combinado para medida de pH.
- Sonda de temperatura.
- Soluciones tampón (estándar o buffer) de pH 4 y 7 con aproximación de 0.01 unidades.
- Agitador magnético.
Procedimiento de análisis:
1. Con vino y mosto opera directamente sobre el líquido. Si se trata de mosto concentrado,
diluye con agua destilada hasta 25 ± 0,5 ºBrix (25 % m/m en azúcares totales). En todo caso
debes de homogeneizar la muestra.
2. Llena un vaso de precipitado o el vaso específico del equipo con un volumen suficiente
para que cubra el orificio del puente salino del electrodo combinado. En caso de utilizar
agitador magnético, evita que el imán tropiece con el electrodo.
3. Pulsa el botón de lectura, esperando a que la lectura sea estable y anota la misma con dos
decimales.
4. Realiza la determinación por duplicado.
5. Lava el electrodo y la sonda, colocando después el tapón y el capuchón protector con
líquido de conservación, según indicaciones del fabricante.
Cálculos:
El resultado será la media aritmética de las dos lecturas, expresada con dos decimales.
Para comprobar el punto final de esta valoración, podemos utilizar un indicador como el azul
de bromotimol, pero la percepción del viraje del indicador no siempre es fácil de distinguir.
Piensa en que para que el ojo humano perciba un cambio de color, debe de existir una
proporción mínima de 1 a 10 del nuevo color sobre el inicial. Esta circunstancia implica que
en vinos tintos o vinos blancos y rosados con mucha intensidad colorante, el cambio de color
no se perciba con nitidez. Todo ello implica que el error de valoración aumenta.
El método oficial para la determinación de la acidez, nos dice que "la Acidez Total es la suma
de los ácidos valorables cuando se lleva el pH a 7, añadiendo una solución alcalina valorada".
Por lo tanto podemos proceder como sigue:
Material y reactivos:
- pH-metro que permita lecturas con aproximación de 0,01 unidades como mínimo.
- Electrodo combinado para medida de pH.
- Sonda de temperatura. (No es necesaria si el electrodo lleva incorporada la sonda).
- Soluciones tampón (estándar o buffer) de pH 4 y 7.
- Agitador magnético.
- Bureta de 25 ml, clase A (si es posible con banda azul), con soporte y pinza de sujeción.
- Vaso de precipitados de 50 mililitros.
- Disolución valorada de hidróxido de sodio 0,1 Normal.
Procedimiento de análisis:
1. Elimina el dióxido de carbono de la muestra, echando 50 ml de vino o mosto en un
kitasato. Agita a la vez que haces el vacío con un trompa de agua, durante unos minutos. Si se
trata de mosto concentrado, es suficiente con diluirlo a 25 ºBrix.
2. Monta la bureta y enrásala con la solución de valorada de NaOH 0,1 N.
3. Toma 10 ml de muestra y pásalas al vaso de valoración, añadiendo otros 10 ml de agua
destilada.
4. Coloca el vaso de precipitados sobre el agitador magnético e introduce un imán teflonado.
Acopla el electrodo y la sonda de temperatura, de manera que no toquen las paredes ni
tropiecen con el imán. Si el volumen no es suficiente para cubrir el orificio del puente salino,
añade más agua destilada. La bureta debe de verter en el vaso sin tocar al electrodo ni la
sonda.
5. Pulsa el botón de lectura continua del pH-metro y añade lentamente hasta pH 7.0.
6. Anota el volumen de NaOH 0,1 N consumido.
7. Realiza la determinación por duplicado, añadiendo más lentamente cuando se aproxime a
pH 7.0.
8. Retira y lava el electrodo y la sonda, colocando después el tapón y el capuchón protector
con líquido de conservación, según indicaciones del fabricante.
Cálculos:
si se utiliza factor
donde:
AT: Acidez total expresada en gramos de ácido tartárico por litro.
v: Media aritmética del volumen, en ml, de solución de hidróxido de sodio consumida.
N: Concentración Normal (equivalentes/litro) del hidróxido de sodio.
f: Factor de corrección para la concentración.
75: Peso equivalente del ácido tartárico (o 49 en el caso del ácido sulfúrico, en caso de
expresarla en este ácido).
Otra diferencia con respecto al uso del pH-metro, es que los métodos de análisis no se basan
en valoraciones a un valor final de potencial, sino que es necesario calcular el punto de
equivalencia dentro del intervalo. El procedimiento para el sulfuroso libre y total es el
siguiente:
Material y reactivos:
- Potenciómetro con lecturas en milivoltios y electrodo combinado para medida de potencial.
- Agitador magnético e imán teflonado.
- Bureta de 25 ml, clase A (si es posible con banda azul), con soporte y pinza de sujeción.
- Vaso de precipitado de 50 mililitros.
- Solución Patrón de 220 milivoltios tamponada a pH 7,0.
- Ácido sulfúrico 1/3 (670 ml de agua destilada + 330 ml de ácido sulfúrico concentrado).
- Solución valorada de yodo 0,02 N.
- NaOH 1 N. (40 gramos de NaOH por litro de agua destilada).
Procedimiento de análisis:
4. Monta la bureta y enrásala con la solución valorada de yodo 0,02 N.
5. Toma 10 ml de muestra y pásalas al vaso de valoración, añadiendo 5 ml de ácido sulfúrico
1/3.
6. Coloca sobre el agitador magnético e introduce un imán. Acopla el electrodo de manera
que no toque las paredes ni tropiece con el imán. Si el volumen no es suficiente para cubrir el
orificio del puente salino, añade agua destilada. La bureta debe verter en el vaso sin que
alcance al electrodo.
7. Pulsa el botón de lectura continua del potenciómetro y añade lentamente la solución
valorada de yodo 0,02 N hasta que se produzca un incremento brusco del potencial.
8. Anota el volumen de yodo 0,02 N y continúa añadiendo un par de mililitros más, por si no
se trataba del punto de equivalencia. Sea V' el volumen de yodo consumido.
9. Toma otros 10 ml de vino y mézclalos con 10 ml de NaOH 1N. Espera 15 minutos. Vierte, de
golpe, 5 ml de ácido sulfúrico 1/3 y procede de igual forma que el anterior. Sea V' el volumen
de yodo consumido.
10. Realiza la determinación por duplicado, añadiendo la solución de yodo más lentamente,
cuando se aproxime al salto de potencial de la valoración anterior. Sería interesante que
comprobaras el resultado, con la aplicación de hoja de cálculo.
11. Retira y lava el electrodo y la sonda, colocando después el capuchón protector con líquido
de conservación, según indicaciones del fabricante.
Cálculos:
SO2 libre (mg/L)=V x 64 o SO2 Total(mg/L)=V' x 64 donde V y V' son los volúmenes de Yodo
N/50 consumidos.
AUTOMATIZACIÓN DE LOS MÉTODOS POTENCIOMÉTRICOS
Pero eso no es todo, pues el hecho de que sea un equipo el que detecte el punto final de la
volumetría, permite abordar la idea de automatizar el proceso en mayor o menor medida.
Así, por una parte se han diseñado dosificadores automáticos de gran precisión y exactitud,
mediante bombas peristálticas u otros mecanismos, que sustituyen con éxito a las buretas, y
por otra evitan la manipulación de los reactivos valorantes.
Al intervenir menos los operarios de laboratorio, se eliminan los posibles errores que se
puedan cometer en la manipulación. Piensa en el cierre y apertura de las llaves de la bureta,
en la realización del enrase de la misma, en la lectura del volumen consumido, etc.
Otro aspecto que se automatiza es la detección del punto final, de tal manera que es el
propio equipo quien detiene el proceso, sin la duda que pueda generar la interpretación del
mismo.
Con todo ello se logran componer equipos conocidos como valoradores automáticos o
también titradores, aunque esta denominación proviene de una adaptación de la lengua
inglesa y a pesar de que su uso está extendido, es un término que no figura en el diccionario
de la RAE.
Con este tipo de equipos, la realización de los procedimientos es más fácil y rápida, lo que
supone una reducción del coste por análisis, siempre que se supere un número de muestras
determinada y variable para cada equipo.
Las formas más conocidas de esta energía, son la luz y el calor radiante. Otras, son los rayos X
o la radiación ultravioleta, tantas veces mencionada en relación a la capa de ozono o a los
problemas cutáneos que provoca, por no hablar de las microondas ya establecidas en nuestra
vida cotidiana.
Pero una radiación electromagnética, puede comportarse simultáneamente como una onda y
como un haz o paquete de partículas, llamadas fotones. Esta dualidad onda corpúsculo fue
causa de numerosos estudios que, a la postre, concluyeron en las ecuaciones que las
caracterizan. Así, podemos decir que la energía transportada por un fotón, es proporcional a
la frecuencia de la onda asociada, a través de la constante de Max Planck.
Considerando la radiación como una onda, podemos decir que su frecuencia está relacionada
con la longitud de onda a través de una constante, que es la velocidad de la luz en el medio,
según la expresión:
Por esta expresión llegariamos a la conclusión de que cuanto menor es la longitud de onda de
una radiación electromagnética, mayor será su frecuencia y por lo tanto será mayor la
energía asociada.
Desde el punto de vista analítico, existen diversos criterios de clasificación de los métodos
basados en el uso de la radiación electromagnética. Teniendo en cuenta las técnicas
utilizadas en la actualidad en enología, te proponemos la siguiente clasificación:
- Técnicas espectroscópicas: Cuando se basan en los efectos que provoca la radiación sobre
los analitos y que dependerá de la naturaleza y características de la radiación y del analito.
La interacción entre la materia y la radiación de estas regiones del espectro, con más o
menos restricciones, está regulada por la ley de Beer.
Por supuesto que existen desviaciones de este comportamiento, pero la puesta a punto de los
métodos analíticos, suele ser suficiente para evitar su incidencia.
A pesar de que los equipos actuales llevan incorporado un procesador que realiza los cálculos
y nos da el resultado directamente en una pantalla, en las unidades que se prefiera, es
interesante que construyas la curva de calibrado con las lecturas de patrones y compruebes la
linealidad de la misma, mediante el coeficiente de correlación.
CURVA DE CALIBRADO
1. En una hoja de Excel registramos los datos de la curva de calibrado, poniendo los valores
de la concentración de los patrones en una columna y los valores de la absorbancia de cada
lectura en otra columna diferente.
2. Una vez introducidos los datos, buscamos la representación gráfica de los mismos, para lo
cual vamos a la barra de herramientas superior y hacemos clic en Insertar, seleccionando
insertar Gráfico.
3. Se abrirá el asistente para gráficos, donde deberemos seleccionar el tipo de gráfico, que
para este caso será XY (Dispersión). En el subtipo de gráfico, seleccionaremos "Dispersión.
Compara pares de valores".
Tendremos que introducir el Rango de datos, tal y como se muestra en el ejemplo, señalando
en qué columnas y líneas están los datos. También se puede hacer arrastrando el cursor con
el ratón.
5. Haciendo clic en Serie, podemos observar y cambiar cuales son los datos que aparecerán
en el eje X y en el eje Y, así como dar nombre a la serie.
En las casillas correspondientes, podemos añadir los nombres del Gráfico, del eje X y del eje
Y. También podemos modificar el aspecto y las divisiones de los ejes y del área de trazado.
7. El siguiente paso nos lleva a decidir la ubicación del gráfico, en una nueva hoja o en la
misma en la que se encuentran los datos.
8. Una vez que tenemos el gráfico, podemos modificar su aspecto, pinchando con el botón
derecho del ratón sobre las distintas partes del gráfico (ejes, área de gráfico, rótulos, etc),
buscando el aspecto que más nos guste.
9. Si hacemos clic con el botón derecho sobre los puntos de la serie de datos, nos aparecerá
un cuadro de diálogo como el siguiente:
10. Haciendo clic sobre Agregar línea de tendencia, nos aparecerá otro cuadro de diálogo en
el que seleccionaremos Tipo Lineal.
11. En la pestaña de Opciones, marcamos la casilla que nos permite Presentar la ecuación y
el valor de R cuadrado en el gráfico. Además nos permite fijar los valores de extrapolación
hacia delante y hacia atrás.
12. De esta manera obtendremos la ecuación de la recta de calibrado, que nos permitirá
realizar los cálculos con los valores de la absorbancia de las diferentes muestras analizadas.
Para que la ecuación se aproxime a la de una recta y por lo tanto se cumpla la ley de Beer, el
coeficiente R cuadrado tiene que tener un valor próximo a 1.
Ejemplo:
- Lectura de absorbancia de la muestra A: 0,387
- La ecuación de la recta de calibrado es: y = 0,001x - 0,0007 y R cuadrado es 0,999.
- Sustituyendo en la ecuación: 0,387 = 0,001x - 0,0007, por lo que el valor de la concentración
de la muestra A será de x = (0,387 + 0,0007) / 0,001 = 387,7 ppm de Fe.
ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA-VISIBLE
Se denomina región visible del espectro, porque es la región, que es capaz de percibir el ojo
humano, desde las radiaciones de 700 nm de longitud de onda, correspondientes al color rojo
hasta los 380 - 400 nm del violeta y azul. Por debajo empieza el ultravioleta, no visible para
los humanos, pero sí para los insectos.
Cuando una radiación de la región visible interacciona con la materia, es capaz de provocar,
en algunos casos, excitación electrónica y tránsitos de los electrones a orbitales de mayor
energía. Pero dado que los distintos estados energéticos están cuantificados, la energía
aportada ha de ser justamente la adecuada. Para lograr una cantidad de energía
determinada, seleccionaremos cual es la longitud de onda de radiación que la aporta.
Por lo tanto, la puesta a punto de los procedimientos analíticos, empiezan por buscar la
especie absorbente y la longitud de onda a la cual presentan una buena absorción y que será
específica para cada especie.
Una vez solventada esta fase, se debe encontrar una relación numérica entre la lectura y la
concentración del analito (ley de Beer), realizando una curva de calibrado con una serie de
disoluciones patrón de diferentes concentraciones, pero todas ellas próximas a la del analito.
Para el utravioleta necesitamos cubetas de cuarzo, mientras que para el visible el vidrio es
suficiente (también puede utilizarse cuarzo en el visible). En la actualidad existen materiales
plásticos válidos para ambas regiones (las de plástico normal sólo se pueden usar para el
visible).
Lo ideal es que las lecturas de las soluciones patrón y la solución del analito se hagan con la
misma cubeta, eliminando así una posible causa de error, aunque también puedes usar
cubetas plásticas desechables contrastadas.
Son muchos los procedimientos espectroscópicos diseñados para enología, incluso varios para
un mismo parámetro, por lo que, a continuación, veremos solamente algunos de ellos, a modo
de ejemplo.
Fundamento teórico:
El método analítico se fundamenta en la oxidación del ácido L(-) málico (en forma de L-
malato) a oxalacetato, catalizado por la enzima L-malato deshidrogenasa (L-MDH) en
presencia de NAD.
El NADH presenta un máximo de absorción a 340 nm, por lo que puede ser cuantificado por
espectrofotometría de absorción ultravioleta - visible, a esta longitud de onda.
Material y reactivos:
- Espectrofotómetro ultravioleta visible para lectura a 340 nm.
- Cubetas contrastadas de 1 cm.
- Pipetas automáticas reguladas a 10 µl, 200 µl, 900 µl y 1000 µl.
- Material general de laboratorio y preparación de muestra.
- Kit de reactivos para determinación enzimática de ácido L-málico.
- Agua bidestilada.
- Solución patrón de ácido L(-)málico de 0,2 gramos por litro.
Procedimiento de análisis:
1. Al ser un método enzimático los tiempos y secuencias deben de ser muy rigurosos, según
instrucciones del kit.
2. Enciende el equipo con suficiente antelación para que la señal sea estable (normalmente
30 minutos).
3. Selecciona una longitud de onda de 340 nanómetros.
4. Prepara 4 patrones por dilución, entre 0,03 y 0,3 gramos de ácido L(-)málico por litro.
5. Centrifuga el vino o mosto a 3.000 rpm durante 3 minutos.
6. Diluye la muestra (hasta que contenga menos de 2 gramos de ácido L(-)málico por litro).
7. Prepara 1 cubeta contrastada para el blanco, cuatro para los patrones y dos para la
muestra (duplicado).
8. Añade los reactivos del kit en el orden y la secuencia de tiempos indicado en las
instrucciones.
9. Ajusta el equipo a cero de Absorbancia con la cubeta del blanco. Realiza las lecturas de los
patrones y las muestras para analizar. La Absorbancia de las muestras debe ser intermedia a
la de los patrones.
10. Limpia todo el material, cuidando que no queden restos en el equipo de medida.
Cálculos:
a. Si tu equipo tiene autocalibrado, aplica la expresión que figura en las instrucciones del kit:
C = 0,473 · ΔA ·f, donde ΔA es la diferencia de Absorbancia antes y después de añadir L-
MDH, C mayúscula es la concentración en gramos de ácido L(-) málico por litro y f es el factor
de dilución de la muestra.
Traza la recta promedio o realiza el ajuste por mínimos cuadrados. Con la lectura de la
Absorbancia de la muestra, busca en la gráfica el valor correspondiente a la concentración de
la misma. Compara el resultado con el obtenido mediante la fórmula. Puedes recurrir de
nuevo al para saber más del apartado.
DETERMINACIÓN DE LAS CARACTARÍSTICAS CROMÁTICAS
El color de los vinos es una característica importante en la fase visual de la cata, debido a
que puede llevar asociado muchas connotaciones sobre el estado del vino. Pero desde el
punto de vista cuantitativo, es conveniente que seber que no hay un criterio demasiado
uniforme al respecto. El método de referencia busca una definición del color, basado en el
diagrama tricromático de la Comisión Internacional del Alumbrado (CIE), mientras que el
método usual aplicable a vinos tintos y rosados, se basa en la definición de intensidad
colorante y la tonalidad.
Fundamento teórico:
- Se trata de un método espectrofotométrico, en el que la intensidad colorante se define
como las suma de las Absorbancias obtenidas, en cubetas de 1 cm, a las longitudes de onda
de 420, 520 y 620 nm, mientras que la Tonalidad se expresa como la relación entre la
Absorbancia a 420 nm y la Absorbancia a 520 nm.
Material y Reactivos:
- Espectrofotómetro ultravioleta - visible para lectura desde 300 a 700 nm.
- Cubetas contrastadas de 0.1, 0.2, 0.5 y 1 cm.
- Centrífuga que permita 3000 rpm.
- Matraz kitasato y trompa de agua para generar vacío.
- Agua destilada
Procedimiento de análisis:
1. Clarifica el vino por centrifugación a 3000 rpm, 3 minutos o fíltralo por membrana.
2. Elimina el dióxido de carbono, si lo hubiese, agitando mientras se hace vacío.
3. Elige la cubeta en función del vino (el camino óptico de la cubeta, es decir su espesor,
entre 0,1 y 1cm), de manera que permita una lectura de Absorbancia entre 0,3 y 0,7.
4. Para cada longitud de onda, ajustar a 0 de Absorbancia con agua destilada.
5. Realiza la lectura de Absorbancia de las muestras, después de ajustar a 0, a las longitudes
de onda de 420, 520 y 620 nm.
6. Lava el equipo y limpia los posibles vertidos o salpicaduras.
Cálculos:
- Si utilizas cubetas que no sean de 1 cm, deberás dividir las lecturas entre el camino óptico
utilizado (en cm).
Fundamento teórico:
Se trata de un método espectrofotométrico, en el que el Índice de Polifenoles Totales (IPT) se
obtiene de la lectura de la Absorbancia a 280 nm de una dilución 1/50 o 1/100 del vino
limpio. A 280 nm es la longitud de onda en la que absorben los anillos bencénicos,
componentes de los compuestos fenólicos.
Material y Reactivos:
- Espectrofotómetro ultravioleta - visible para lectura desde 220 a 700 nm.
- Cubetas contrastadas de 1 cm.
- Centrífuga que permita 3000 rpm.
- Matraz kitasato y trompa de agua para generar vacío.
- Agua destilada
Procedimiento de análisis:
- Clarifica el vino por centrifugación a 3000 rpm, 3 minutos o fíltralo por membrana.
- Elimina el dióxido de carbono, si lo hubiese, agitando mientras se hace vacío.
- Prepara una dilución con agua destilada, 1/100 para vinos tintos y 1/10 para vinos blancos.
- Selecciona una longitud de onda de 280 nm, ajusta a cero con agua destilada y lee la
Absorbancia de la dilución 1/10 o la 1/100.
- Lava el material y limpia el espectrofotómetro de posibles derrames o salpicaduras.
Cálculos:
El Índice de Polifenoles Totales (IPT) viene dado por la expresión:
siendo f el factor de dilución.
También podríamos determinar antocianos y otros parámetros, pero los procedimientos de
trabajo con el espectrofotómetro son todos muy semejantes.
ESPECTROSCOPIA INFRARROJA
La región del infrarrojo comprende las radiaciones con una longitud de onda entre 0,78 y 1000
µm y que se divide en 3 subregiones que son el Infrarrojo cercano, medio y lejano. En
procedimientos analíticos, se suele trabajar entre 2,5 y 25 µm, aunque ya se están utilizando
longitudes de onda mayores.
A estas ventajas, debemos añadir que las actuales técnicas analíticas en infrarrojo, no suelen
necesitar muchos reactivos, ni un proceso de preparación de la muestra (acaso alguna
dilución), lo cual disminuye el coste y el tiempo por análisis.
Existen otra serie de técnicas analíticas, cuyo fundamento está también relacionado con la
luz, como son las técnicas refractométricas y turbidimétricas.
Teniendo en cuenta las aplicaciones en el ámbito de la enología, vamos a exponer las técnicas
basadas en:
Refracción de la luz:
Por ejemplo observado un objeto semisumergido en el agua, como los remos de una
embarcación y la sensación que percibes es que parece que se deforma. Pues ese efecto
óptico se debe a la refracción.
Este cambio de dirección también ocurre en un mismo medio al cambiar la temperatura, pues
una variación de la misma implica un cambio de la densidad, lo que provoca que la luz se
transmita a una velocidad distinta en función de la densidad de cada medio.
Primera ley: El rayo de luz incidente, el refractado y la normal están en el mismo plano.
Segunda ley: Si i es el ángulo del rayo incidente y r el ángulo del rayo refractado con
respecto a la normal, n1 el Índice de Refracción del medio 1 (aire en el dibujo) y n2 el Índice
de Refracción del medio 2 (agua en el dibujo), se cumple que
Cuando un rayo de luz atraviesa una solución coloidal, con partículas en suspensión, una parte
de la radiación es transmitida, mientras que otra fracción es esparcida en todas las
direcciones debido al choque con las mismas. Este fenómeno se conoce como efecto Tyndall.
Este efecto, es el que nos permite ser capaces de percibir un haz luminoso a través de una
solución con partículas en suspensión, o simplemente a través del aire con polvo en
suspensión, como un rayo de sol cuando entra en una habitación oscura.
Si en lugar de una suspensión, se tratase de una solución verdadera, no podrías percibir dicha
trayectoria.
Podemos decir que la denominada luz de Tyndall o luz difusa, se debe a un fenómeno físico,
prácticamente independiente de cual sea la composición química de las partículas en
suspensión.
REFRACTOMETRÍA
El Índice de Refracción del agua en relación con el aire a 20ºC, es 1,333. Si en el agua
disolvemos, por ejemplo sacarosa, el índice de refracción de la disolución será mayor que el
del agua pura y aumentará a medida que aumenta la cantidad disuelta. Así, es posible
relacionar el contenido en azúcares de una disolución con el Índice de Refracción.
Basándose en esta relación, se fabrican equipos con distintas escalas adaptadas al tipo de
muestra. Para enología están graduados en Grados Baume, Grados Brix o en Grado alcohólico
probable, que nos permiten hacer una lectura directa a partir de una pequeña fracción de
mosto, siendo común su uso para control de maduración. Con los nuevos refractómetros
digitales, eres tú quien selecciona la escala de lectura. Existen diferentes tablas que
relacionan unas unidades con otras, pero las relaciones aproximadas entre estas escalas
podemos calcularlas con las fórmulas siguientes:
El valor del Índice de Refracción varía con la temperatura, por lo que tienes dos alternativas:
hacer la lectura cuando la muestra a 20 ºC o utilizar un refractómetro equipado con un
sistema de compensación de temperatura, que en la actualidad son la mayoría.
La visión del trayecto de un rayo de sol entre las nubes o las bonitas fotografías de un bosque
con niebla: Estas impresionantes imágenes, se deben a un fenómeno de dispersión o
esparcimiento de la luz.
Estas técnicas son utilizadas en análisis enológico para la determinación de la turbidez de las
suspensiones. Son de gran interés en los procesos de clarificación, en los procesos que tienen
presencia de lías, etc.
Los métodos turbidimétricos nos permiten determinar turbiedades midiendo la luz esparcida,
por comparación con patrones de referencia, que son soluciones coloidales muy estables. Uno
de los más utilizados es el compuesto por una suspensión de formacina.
DETERMINACIÓN DE LA TURBIDEZ
En la actualidad el mercado exige vinos limpios y sin sólidos en suspensión, sea cual sea su
naturaleza, lo cual obliga a que las técnicas de clarificación tengan una especial importancia
en los procesos de elaboración.
Es importante que te asegures de que las cubetas o viales están contrastadas, pero de todas
formas es conveniente que realices periódicamente la comprobación.
Para ello, llena la cubeta con una muestra, elige la función de medida continua y vete
girando la cubeta o vial durante una vuelta completa, prestando atención a la lectura de la
pantalla. La posición que coincida con la lectura más baja, es la que debes de usar para la
lectura, por lo que debes de marcarla en la cubeta y en el equipo (si no tiene marca).
MÉTODOS DE SEPARACIÓN
Dentro de la química analítica, los métodos para análisis pueden conseguir una mayor o
menor selectividad, pero es muy difícil, por no decir imposible, encontrar un método
específico para un analito determinado.
Así, en la mayoría de las situaciones, antes de realizar el análisis nos vemos obligados a
separar el analito de otros componentes, para evitar las posibles interferencias.
Sin duda, el modo más común para realizar separaciones analíticas es la cromatografía, que
agrupa un gran número de métodos y que permite separar componentes estrechamente
relacionados en mezclas complejas.
La cromatografía se caracteriza por una fase móvil, una fase estacionaria y un sistema de
detección.
Estos métodos tienen en común, que la muestra se disuelve en una fase móvil, que puede ser
un gas, un líquido o un fluido supercrítico. Esta fase móvil se hace pasar a través de una fase
estacionaria inmiscible, que se mantiene fija en una columna o sobre una superficie sólida.
Ambas fases son elegidas con el objeto de conseguir que los distintos componentes de la
muestra atraviesen a distinta velocidad la fase estacionaria. Al final de la columna o placa se
consigue que los componentes lleguen separados.
Los métodos cromatográficos se clasifican según el tipo de fase móvil, estacionaria y el tipo
de equilibrios que se establecen entre ambas.
Las técnicas cromatográficas "sencillas" cada vez se usan menos, mientras que los equipos
modernos es poco probable, a no ser una bodega de dimensiones importantes, pues a pesar
de sus interesantes aplicaciones, el coste y el mantenimiento son elevados.
Si consideramos también el sector de las industrias derivadas, sobre todo el de los destilados
y licores, las técnicas cromatográficas cobran especial relevancia, aunque es necesario
matizar de nuevo, que sólo los laboratorios especializados o las grandes destilerías son
capaces de rentabilizar la elevada inversión.
La cromatografía es una técnica de separación y que para que se convierta en una técnica
analítica completa, necesita que un sistema de detección identifique y cuantifique los
distintos componentes de la muestra después de la separación.
El detector elegido será aquél que mejor se adapte a las características físico-químicas del
analito y, a nivel general, los sistemas de detección usados en cromatografía son técnicas
analíticas en sí.
Los equipos que se basan en técnicas cromatográficas de separación y que llevan asociado un
sistema de detección se denominan cromatógrafos.
Si al final de la fase estacionaria colocamos un detector que sea sensible a la presencia de los
componentes del analito y representamos su señal en función del tiempo, se obtiene un
gráfico con una serie de picos, cada uno de los cuales corresponde a un componente. Este
grafico se denomina cromatograma y en su interpretación se obtienen los resultados
analíticos, tanto cualitativos como cuantitativos.
Una de estas causas de errores, se debe a que se trabaja con volúmenes muy pequeños, del
orden de los µL, por lo que un pequeño error en la dosificación, implica un error importante
en el resultado. Para minimizar este error se pueden usar dos métodos:
- Método del estándar o patrón interno: Se introduce en cada muestra y en cada patrón de
calibrado una cantidad exactamente medida de una sustancia patrón interno, de manera que
el detector compare el pico de las muestras y patrones de calibración con el patrón interno.
- Método de la normalización de áreas: Se basa en esperar a que todos los componentes
atraviesen la fase estacionaria. El detector determine cada analito por la relación del área
del pico correspondiente con respecto al área total.
Con un cromatógrafo de gases, podemos disponer de los datos del contenido de residuos de
productos fitosanitarios, en el momento de la recepción de uvas en la bodega, pudiendo
discriminar la materia prima por este parámetro. Esto puede contribuir a un uso más racional
de estos productos.
A continuación se describe, aunque sea de forma muy resumida, las características de los
cromatógrafos de gases y sus aplicaciones en enología.
Los detectores más usados en cromatografía de gases son el de ionización de llama, como el
representado en el esquema y el de conductividad térmica, aunque ya se utilizan otros más
modernos como el detector de captura de electrones o el de emisión atómica. El
acoplamiento de la cromatografía de gases con la espectroscopia Infrarroja con Transformada
de Fourier, o con la espectrometría de masas, ofrece un amplio campo de posibilidades
analíticas, eso sí, a un elevado coste.
El procedimiento de trabajo para cromatografía de gases, se limita a:
1. Sigue el protocolo de preparación de la muestra, eliminando aquellas interferencias o
diluyendo hasta los rangos permitidos.
2. Prepara el cromatógrafo, controlando la presión y flujo de los gases, así como la
temperatura del horno y espera a que la señal del detector sea constante. Atención al uso de
los gases, pues sin ser alarmistas, su manejo obliga a ser muy rigurosos con los protocolos de
seguridad y buenas prácticas.
3. Añade una cantidad exacta de patrón interno a los patrones y muestras y las inyectas
secuencialmente en el cromatógrafo, esperando el tiempo necesario para permitir
la elución total de la muestra anterior. Deberás inyectar cantidades del orden de 1 µL.
4. Anota o registra los resultados y seguir el protocolo de limpieza y apagado del equipo.
En este tipo de técnicas, la disolución diluida de la muestra, se sitúa sobre el plano que
contiene la fase estacionaria en forma de mancha o banda, a corta distancia de uno de los
extremos del plano.
Una vez seca la mancha se introduce en el eluyente, manteniendo todo el sistema en una
cámara cerrada.
En la Cromatografía de Capa Fina, se utiliza sílice o celulosa y resulta más rápida, eficaz y
versátil. Se dispone en el mercado de placas preparadas en diferentes dimensiones y con
diversas fases estacionarias.
Para revelar los distintos componentes sobre el papel o la capa fina, se recurre a procesos de
tinción nebulizados o incorporados en la fase estacionaria. Es común incorporar fluoresceína y
una vez finalizada la cromatografía, se localizan las manchas bajo una luz utravioleta.
ÁCIDOS MÁLICO Y LÁCTICO POR CROMATOGRAFÍA PLANA
Mediante esta técnica podemos detectar la presencia de los ácidos málico y láctico, además
del tartárico. La determinación semicuantitativa o aproximada es posible, pero exige muy
buena mano.
Material y productos:
- Equipo para cromatografía plana (cubeta, capilares, secador, etc).
- Papel Watman nº 1.
- Ácido acético al 50%
- n-butanol.
- Azul de bromofenol.
Procedimiento:
1. Prepara el eluyente de la fase móvil, mezclando 100 ml de una disolución de azul de
bromofenol de 1g/L en n-butanol con 40 ml de una disolución de acético en agua al 50%.
2. Llena la cubeta con el eluyente hasta una altura de 2 centímetros, tápala y déjala durante
una hora, para lograr saturar la atmósfera con los vapores del eluyente.
3. Prepara una tira de papel Watman nº1 de altura en función del tipo de cubeta que
dispongas (20 cm).
4. Con un lápiz, traza una línea horizontal a unos 3-4 cm del borde inferior de la hoja. Marca
tantos puntos como muestras más patrones tengas.
5. Prepara un patrón de cada ácido, tartárico, málico y láctico (un gramo por litro).
6. Aplica las muestras y los patrones usando un capilar diferente para cada uno de ellos. Seca
después de la aplicación y repite la aplicación sobre el mismo punto, 5 ó 6 veces, secando
cada vez. De esta manera se concentra la mancha.
7. Introduce la tira de papel con las manchas, de manera que éste se sumerja en el eluyente,
pero sin que se mojen las manchas. Procura que quede vertical, usando pinzas o apoyando
sobre la pared.
8. Tapas la cubeta y esperas a que el eluyente ascienda hasta 3/4 de la altura total. (4-5
horas).
9. Saca el papel con cuidado, marca el frente del eluyente y déjalo secar al aire, mejor
colgado.
10. Una vez seco, observarás diversas manchas, que interpretarás como sigue:
Interpretación:
- Tomando como base el punto en el que aplicaste el vino, en la vertical te aparece una
primera mancha que corresponde al ácido tartárico. Esa mancha se debe de corresponder en
altura con el patrón del mismo ácido.
- Un poco más arriba, te aparece una mancha amarilla correspondiente al ácido málico, si
está presente. Esta mancha se corresponderá con la del patrón correspondiente.
Por encima, puede aparecer otra mancha debida a los ácidos láctico + succínico, que se
corresponderá con su patrón.
en 9:25
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