ENSAYO DE PROLIFERACIÓN CON CFSE

1.- Preparamos los tubos con 3 ml de medio de separación.

2.- Diluimos la sangre 1:1 con PBS 1X y homogeneizamos.

3.- Centrifugamos durante 30 min a 1800 rpm.

4.- Recogemos el halo blanquecino en un tubo aparte y añadimos PBS 1X.

5.- Hacemos un lavado centrifugando 10 minutos a 1800 rpm.

6.- Decantamos y resuspendemos el pellet en 900 µl de PBS 1X, 100 µl de STF y 0,5 µl de CFSE.

7.- Agitamos durante 5 minutos en oscuridad y a temperatura ambiente.

8.- Lavamos 2 veces con PBS 1X (centrifugando 10 min a 1800 rpm).

9.- Mientras se hace el último lavado, contamos con la cámara de Neubauer

10.- Ajustamos la concentración a 200.000 células en 200 µl (106 células/ml), resuspendiendo en

medio RPMI-1640 con STF 10%, P/S 1% y Glutamina 1%.

11.- Separamos la mitad del volumen en otro tubo y añadimos PHA a una concentración de 10
µg/ml (4 µl/pocillo).

12.- Sembramos 200 µl en una placa Costar de 96 pocillos.

13.- Guardamos las células en el incubador a 37ºC y 5% CO2.