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Hoje veremos:
- Cromatografias
- ELISA
- Citometria de fluxo
- Fraccionamento subcelular
Cromatografia
Cromatografia
12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
3- Fraccionamento com
(NH4)2SO4 0,445 32,5 23,3
(salting out)
4- Cromatografia de filtração em gel 0,135 29,5 70,0
Input Eluido
1 23 45 6
1, 4, 7- controlo
2, 5, 8- solubilização digitonina
3, 6, 9- solubilização desoxicolato/NP40
Imunoprecipitação
1- Marcadores
2- IP Anti-Pex14p DN
3- IP Anti-Pex14p Dig
4- IP IgG controlo Dig
Espectro
de massa
Obtendo a lista dos péptidos obtidos pela análise, é possível proceder a uma busca
em base de dados para identificar a proteína
MALDI-MS
GST
gene X
pGEX
prepare protein
express GST-fusion extract from brain
protein in E.coli
Extracto proteico
GST pull-down assay: Exemplo
ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
Vantagens da ELISA
Rápida e preciso
Análise histograma
FACS – Fluorescence activated cell sorting
Histograma Bidimensional
FACS – Fluorescence activated cell sorting
Exemplo: Imunofenotipagem (diagnóstico de
doenças associadas ao sistema imune, ex
leucemias,Processo
Imunofenotipagem: linfomas…)
de classificação de células do sistema imune baseado nas
suas diferenças estruturais e funcionais. O processo é comumente utilizado para analisar e
classificar linfócitos em sub-grupos baseados em antígenos cd pela técnica de citometria
de fluxo.
Centrifugação
diferencial
É possível
acrescentar um
passo adicional a
~3000g para
separar
mitocôndrias dos
lisossomas/peroxi
ssomas
Separação de moléculas por Sedimentação de
Equilíbrio ou Isopícnica (mesma densidade)
Gradientes de
Densidade
Coeficiente de sedimentação:
Unidade de Svedberg “S”
Coeficiente de sedimentação:
Unidade de Svedberg “S”
Peroxisomes
Lysosomes
Purificação de
organelos
T- Homogenizado total
A- 600g
B- 2300g
D- citosol (Sobrenadante 100000g)
E- 100000g
C- 12000g
Per- Fração C purificada através de
gradientes de densidades
RE Mit Per
Fracções E (100Kg), B
(2,3Kg), C (12Kg) do slide
anterior posteriormente
purificadas em gradientes de
densidades originando
respectivamente: