Desarrollo de Un Kefir de Leche

Desarrollo de un kefir de leche con microorganismos probióticos
Universidad de La Habana. Instituto

de Farmacia y Alimentos
Departamento de Alimentos
DESARROLLO DE UN KEFIR DE
LECHE CON MICROORGANISMOS
PROBIOTICOS
Tesis en opción al Título en Licenciatura en Ciencias
Alimentarias
Ana Ibis Cabrera Rodríguez

La Habana, 2013
Portada
Universidad de La Habana. Instituto
de Farmacia y Alimentos
Departamento de Alimentos
DESARROLLO DE UN KEFIR DE
LECHE CON MICROORGANISMOS
PROBIOTICOS
Tesis en opción al Título en Licenciatura en Ciencias
Alimentarias
Ana Ibis Cabrera Rodríguez
Tutores:
MSc. Tatiana Beldarrain Iznaga
Lic. Jorge Isaac López Pino
La Habana, 2013
Opinión de Tutor
El trabajo realizado por la alumna Ana Ibis Cabrera Rodriguez, en su totalidad, ha
sido excelente. La tarea asignada, una temática nueva para ella, fue asimilada con
interés y responsabilidad desde su inicio y mantenida durante el desarrollo de
otras etapas de investigación afines a la obtención del producto en estudio, el
Kefir, realizadas en nuestro Departamento. El trabajo presentado se corresponde
plenamente con los objetivos iniciales propuestos, en el cual la alumna desarrolló
de forma excelente, habilidades en una temática compleja y laboriosa.
La revisión bibliográfica fue exhaustiva y realizada con dedicación, pues recoge

todos los aspectos teóricos que sirven de base y fundamentación al trabajo
experimental.
Las técnicas empleadas se corresponden con las utilizadas en las plantas pilotos
del IIIA, y el método estadístico de análisis empleado fue el que se utiliza con
frecuencia en trabajos de investigación.
La compañera Ana Ibis trabajó con un grado de independencia satisfactorio y

mostró buenas habilidades e iniciativas en el desarrollo de las distintas tareas y
etapas ejecutadas. Para el análisis e interpretación de los datos recopilados en el
trabajo la diplomante empleó los conocimientos adquiridos durante la carrera. El
resultado obtenido en el trabajo tiene gran importancia social y con posibilidades
de implantación.
Por todo lo antes expuesto recomiendo al tribunal este trabajo de diploma para su
defensa para obtener el título de Licenciada en Ciencias Alimentarias y propongo
se le otorgue la máxima calificación. Se recomienda, además, su divulgación en la
Intranet.
• Msc Tatiana Beldarrain Iznaga (tatiana@iiia.edu.cu)
• Lic. Jorge Isaac López Pino (isaac@iiia.edu.cu)
La Habana, 13 de junio de 2013

Datos bibliográficos y licencia
DESARROLLO DE UN KEFIR DE LECHE CON MICROORGANISMOS
PROBIOTICOS / Ana Ibis Cabrera Rodríguez; MSc. Tatiana Beldarrain
Iznaga; Lic. Jorge Isaac López Pino -- Universidad de La Habana : Instituto
de Farmacia y Alimentos, Dpto. Alimentos, 2013. -- 66 pág. -- Universidad
de La Habana. Instituto de Farmacia y Alimentos. -- Tesina (Licenciatura en
Ciencias Alimentarias).
1. Ana Ibis Cabrera Rodríguez;

2. MSc. Tatiana Beldarrain Iznaga
3. Lic. Jorge Isaac López Pino
4. 641 Ciencia y Tecnología de Alimentos y Bebidas
Ana Ibis Cabrera Rodríguez, 2013

(lavoe@ifal.uh.cu)
Ana Ibis Cabrera Rodríguez autoriza la divulgación del presente trabajo de
diploma bajo licencia Creative Commons de tipo Reconocimiento No Comercial
Sin Obra Derivada, se permite su copia y distribución por cualquier medio siempre
que mantenga el reconocimiento de sus autores, no haga uso comercial de las
obras y no realice ninguna modificación de ellas. La licencia completa puede
consultarse en:
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/legalcode
Ana Ibis Cabrera Rodríguez autoriza al Instituto de Farmacia y Alimentos

adscrito a la Universidad de La Habana a distribuir el presente trabajo de diploma
con la licencia Creative Commons descrita anteriormente y a conservarlo a
perpetuidad en el repositorio institucional disponible en: http://revistas.mes.edu.cu
Pensamiento
Honrar a quien se lo merece
es honrarse a sí mismo.
José Martí
Dedicatoria
Dedicatoria
Este trabajo va dedicado con todo mi amor y devoción a mi hija que es mi más
bello tesoro y a mis padres que son la razón de mi existir.
Agradecimientos
Agradecimientos
A mi señor, que me guardó en su amor, me fortaleció y nunca me abandonó, siempre me
llevó en sus brazos y aún cuando creí que no escuchaba, el siempre respondió.
A mi bebita, que fue quien me dio el valor para continuar mis estudios
A mis padres, testimonio vivo de lo que soy.
A mi hermana, por su constante preocupación en mis exámenes y su incondicional apoyo.
A mis compañeros, de trabajo, que siempre tuvieron una palabra de aliento para
animarme.
A mis amigas Ismarays y Leyanis que siempre permanecen conmigo.
Un agradecimiento especial a mis tutores, en especial para Isaac que nunca me dejó sola,
que me aguantó durante todo este tiempo y me ayudó a que este trabajo fuera posible.
En fin, a todos aquellos que de una forma u otra me apoyaron y tuvieron fe en mi.
Gracias.
Índice
Índice
Desarrollo de un kefir de leche con microorganismos probióticos......................................................1
Portada............................................................................................................................................2
Opinión de Tutor..............................................................................................................................3
Datos bibliográficos y licencia.........................................................................................................4
Pensamiento...................................................................................................................................5
Dedicatoria......................................................................................................................................6
Agradecimientos..............................................................................................................................7
Índice...............................................................................................................................................8
Resumen....................................................................................................................................11
Introducción...............................................................................................................................12
Desarrollo...................................................................................................................................14
1-REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA .............................................................................................15
1.1- Probióticos. Aspectos generales..................................................................................15
1.2- Microorganismos usados como probióticos..................................................................15
1.2.1- Bacterias ...............................................................................................................16
1.2.2- Hongos ..................................................................................................................18
1.2.2.1- Mecanismos específicos de las levaduras probióticas.....................................22

1.3- 1.2- Aplicaciones de los microorganismos probióticos...............................................23
1.3.1- Beneficios que aportan a la salud..........................................................................24
1.3.1.1- Efectos sobre la digestibilidad de la lactosa.....................................................24

1.3.1.2- Efectos sobre las enfermedades gastrointestinales e infecciones del tracto
urogenital...................................................................................................................25
1.3.1.3- Efectos sobre la diarrea asociada a antibióticos..............................................25
1.3.2- Factores que afectan la viabilidad de los microorganismos probióticos.................26
1.4- Leches fermentadas.....................................................................................................26
1.4.1- Kefir........................................................................................................................27
1.4.2- Características del kefir..........................................................................................28

1.4.3- Características de los granos de Kefir....................................................................29
2-MATERIALES Y MÉTODOS...............................................................................................31
2.1- Materiales.....................................................................................................................31
2.2- Métodos de control utilizados.......................................................................................31
2.3- Caracterización de las cepas Saccharomyces cerevisiae sub boulardii P1y P2 del
banco de cepa del IIIA. ....................................................................................................31
2.3.1- Fermentación de carbohidratos..............................................................................32
2.3.2- Asimilación del Etanol. ..........................................................................................32
2.3.3- Asimilación en medio líquido del nitrato.................................................................33
2.3.4- Evaluación de las propiedades probióticas. ..........................................................33
2.3.4.1- Resistencia a antibióticos.................................................................................33

2.3.4.2- Capacidad para proliferar a diferentes pH.......................................................34
2.3.4.3- Capacidad de proliferar en presencia de bilis..................................................34
2.3.4.4- Multiplicación a las condiciones del organismo humano. ...............................35
2.3.4.5- Capacidad antagónica contra Escherichia coli y Staphylococcus aureus. ......35
2.4- Determinación de la dosis de empleo del probiótico ...................................................36
2.4.1- Características Físico Químicas, Microbiológicas y Sensoriales de la mejor

variante. .......................................................................................................................37
2.4.2- Determinación de la vida de anaquel.....................................................................38
2.5- Elaboración de la ficha de costo del producto..............................................................39
3-RESULTADOS Y DISCUSIÓN............................................................................................40
3.1- Resultados de la caracterización de Saccharomyces cerevisiae sub boulardii P1 y P2

del banco de cepas del IIIA..............................................................................................40
3.1.1- Fermentación de carbohidratos..............................................................................40
3.1.2- Asimilación del etanol.............................................................................................41
3.1.3- Asimilación del nitrato............................................................................................42
3.2- Propiedades probióticas...............................................................................................42
3.2.1- Resistencia a antibióticos.......................................................................................42
3.2.2- Crecimiento de los microorganismos a diferentes valores de pH...........................43

3.2.3- Capacidad de proliferar en presencia de bilis.........................................................44
3.2.4- Multiplicación a las condiciones del organismo......................................................45
3.2.5- Capacidad antagónica contra Staphylococcus aureus y Escherichia coli..............47
3.3- Elección de la mejor variante........................................................................................50
3.3.1- Caracterización de la mejor combinación...............................................................51
3.3.2- Vida de anaquel.....................................................................................................54
3.3.3- Costos....................................................................................................................55
CONCLUSIONES......................................................................................................................56
RECOMENDACIONES..............................................................................................................58
Referencias Bibliográficas..........................................................................................................59
ANEXO 1.- MEDIO UTILIZADO PARA LA FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS.............64
ANEXO 1.- SALIDA DEL PROGRAMA PLOTEO DE RIESGOS PARA ESTIMAR LA VIDA DE
ANAQUEL DE KEFIR................................................................................................................65
RESUMEN
El kefir es un producto tradicional de los países del Cáucaso. Es una leche
fermentada que contiene hasta un 2% de alcohol. Se caracteriza por presentar en
su microbiota una simbiosis entre bacterias lácticas y levaduras. En el Instituto de
Investigaciones para la Industria Alimentaria existe un banco de cepa de
levaduras, entre ellas Saccharomyces cerevisiae sub. boulardii, de la que se han
informado sus propiedades probióticas. El objetivo de este trabajo fue desarrollar
un kefir de leche con buena viabilidad y aceptabilidad con el empleo de
Saccharomyces cerevisiae sub. boulardii y Lactobacillus casei. Para cumplimentar
este objetivo se caracterizaron 2 cepas de Saccharomyces cerevisiae sub.
boulardii desde el punto de vista fisiológicas y sus aptitudes probióticas, se valoró
su capacidad antagónica contra Escherichia coli y Staphylococcus aureus y se
eligió la mejor combinación de Lactobacillus casei – Saccharomyces cerevisiae
sub boulardii a la cual se le determinaron las características físico- químicas,
microbiológicas, sensoriales, vida de anaquel y costos. Las 2 cepas de
Saccharomyces cerevisiae sub boulardii existentes en el banco de cepas del IIIA
se caracterizan por asimilar los carbohidratos ensayados, son resistentes a la
acción de antibióticos y toleran valores de pH de hasta 2,5. Además, son
resistentes a la acción de las secreciones biliares y pueden multiplicarse en las
condiciones de temperatura y pH del organismo humano. Poseen acción
antagónica contra Staphylococcus aureus y Escherichia coli. Por la aceptabilidad
sensorial obtenida así como por el equilibrio en la viabilidad, la combinación 1% de
L. casei-1% de Saccharomyces cerevisiae sub boulardii P1 es la mejor para
elaborar el kefir de leche. Por sus características probióticas el kefir de leche con
microorganismos adicionados tiene una vida de anaquel de 22 días y su costo es
de 50,28 MN/100 kg.
Palabras clave: kefir, S. cerevisiae sub boulardii, bacterias ácido-lácticas

probiótico.
INTRODUCCIÓN
En la actualidad, el uso de los microorganismos con fines bioterapéuticos está
cobrando auge. Una de las terapias más extendidas es el empleo de
microorganismos para el tratamiento de patologías del tracto digestivo y se
destaca, entre ellos los microorganismos con acción probiótica. Se define como
producto probiótico a un complemento alimenticio a base de organismos vivos y
vitales que producen efectos beneficiosos sobre el organismo, mejorando el
equilibrio microbiano intestinal (Mateu, 2006; Barrera y col., 2008)
Aunque los microorganismos probióticos más utilizados son las bacterias lácticas,
se le reconocen propiedades probióticas, también, a determinadas especies de
levaduras como Saccharomyces cerevisiae sub. boulardii, que se ha empleado en
el tratamiento de diversas enfermedades (Czerucka y Rampal, 2002; Castro y
Rodríguez, 2005; Rodríguez y col., 2012).
Para que un microorganismo pueda ejercer su efecto probiótico, debe atravesar

las barreras del organismo teniendo capacidad de sobrevivencia a las condiciones
del tracto gastrointestinal. Este hecho implica que para que un microorganismo
sea empleado como probiótico, debe soportar la acción del bajo pH del estómago
y tolerar la presencia de bilis (Fragoso y col. 2001; Guerra, 2011; León, 2012).
Además, todo microorganismo probiótico debe multiplicarse de forma tal que
alcance la concentración necesaria para que tenga lugar su efecto. Durante la
historia se han realizado estudios del comportamiento de los microorganismos
probióticos en la elaboración de productos lácteos con resultados satisfactorios.
En el Instituto de Investigaciones para la Industria Alimentaria existe un banco de
cepas tanto lácticas como de levaduras que se reportan como probióticas.
Uno de los productos en los que se pueden emplear estos microorganismos

probióticos es el kéfir, producto tradicional de los países de la pendiente norte de
la cordillera del caucazo. Se obtiene por fermentación de la leche de vaca o de
oveja. Es una bebida carbonatada con un contenido de alcohol hasta de 2%.Para
producirlo se utiliza la microbiota que se presenta en formas de granos donde
viven en una estrecha y muy específica relación, simbiótica, varias levaduras y
bacterias. La microbiota básica de los granos de kéfir está compuesta por
bacterias acido acéticas, acido lácticas y levaduras.
Se han elaborado numerosos derivados lácteos con la inclusión de bacterias

probióticas: leches fermentadas, quesos, fórmulas infantiles, bebidas de jugos,
helado, y para ello se han empleado Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei,
Lactobacillus acidophillus así como la simbiosis de Lactobacillus acidophillus-
Streptococcus termophillus. En este sentido y con el objetivo de incorporar estos
microorganismos tan beneficiosos a los consumidores se trabaja en la elaboración
de un producto que por sus características sensoriales sea agradable y estimule al
consumo de otros microorganismos probióticos como las levaduras y el kéfir
ofrece estas ventajas. Por tanto es objetivo de este trabajo fue:
Desarrollar un kéfir de leche de buena viabilidad y aceptabilidad con

Saccharomyces cerevisiae sub boulardii y Lactobacillus casei como
microorganismos probióticos.
Para cumplimentar este objetivo se establecieron los siguientes objetivos

específicos:
• Caracterizar las cepas Saccharomyces cerevisiae sub boulardii del banco

de cepa del IIIA desde el punto de vista fisiológico y sus aptitudes
probióticas.
• Valorar la capacidad antagónica de Saccharomyces cerevisiae sub

boulardii contra Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
• Elegir la mejor combinación de L. casei-Saccharomyces cerevisiae sub

boulardii para Kefir de leche
• Determinar las características físico-químicas, microbiológicas,

sensoriales, vida de anaquel y costos de la mejor combinación del
producto.
DESARROLLO
Desarrollo de un kefir de leche con microorganismos probióticos 15
Capítulo 1
1- Revisión bibliográfica
1.1- Probióticos. Aspectos generales.
Los probióticos son microorganismos vivos que al agregarse como suplemento en
la dieta, favorecen la digestión y ayudan al mantenimiento del equilibrio de la
microbiota en el intestino (FAO, 2002; Sanders y col. 1999). Su efecto puede ser
potenciado mediante la inclusión adicional de ingredientes no digeribles de los
alimentos, denominados prebióticos. Los prebióticos afectan benéficamente al
huésped mediante una estimulación selectiva del crecimiento y/o la actividad de
una o un limitado grupo de bacterias en el colon. Los carbohidratos de cadena
corta como los mananooligosacáridos (MOS) y los fructooligosacáridos (FOS) son
conocidos prebióticos y se pueden obtener tanto de las plantas como de bacterias,
hongos y levaduras. Los prebióticos sirven como alimento (sustrato) para que los
organismos probióticos estimulen su crecimiento, proliferación y exclusión
competitiva de patógenos (Castro y Rodríguez, 2005).
1.2- Microorganismos usados como probióticos

Los productos probióticos constituyen uno de los subgrupos de alimentos
funcionales más destacados por su versatilidad funcional y gran aceptación por los
consumidores, lo que ha despertado un creciente interés comercial, tanto en la
industria farmacéutica como en la alimentaria. A través de los años han sido
utilizadas las bacterias principalmente aunque en los últimos tiempos el empleo de
levaduras, fundamentalmente de la especie S. cereviseae ha tomado auge.
Universidad de La Habana : Instituto de Farmacia y Alimentos, Dpto. Alimentos, 2013

1.2.1- Bacterias
Los probióticos más reconocidos son las bacterias acido-lácticas y las
bifidobacterias (Taranto y col., 2005). Enterococcus también se han propuesto
como microorganismos probióticos, sin embargo, por su patogenicidad potencial
así como por ser un género que presenta determinada resistencia a antibióticos,
este grupo no es recomendado para usarlo como probióticos (Topkins y col.
2008).
Entre las bacterias probióticas más comúnmente utilizadas mundialmente en las

industrias o laboratorios, se incluyen los lactobacilos como: L. acidophillus, L.
casei, L. bulgaricus, L. reuteri, L. plantarum; además de Bifidobacterias como: B.
bifidum, B. longum, B. breve, B. infanti, B. animalis, B. adolescentis y
Streptococcus termophillus mayormente utilizado en la fabricación de queso y
leches fermentadas (Charalampopoulus y Rastall, 2009).
Entre los requisitos exigibles a los microorganismos probióticos se encuentran: ser

de origen humano; demostrar un comportamiento no patógeno; exhibir estabilidad
ante los procesos tecnológicos (viabilidad y actividad), a la acidez gástrica y a los
ácidos biliares; adherirse al tejido epitelial del intestino; ser capaces de persistir,
aunque durante periodos cortos, al tracto gastrointestinal; producir sustancias
antimicrobianas (ácidos orgánicos, ácidos grasos, bacteriocinas); modular la
respuesta inmune e influir en la actividad metabólica (Dunne y col., 1999). En
cualquier caso, existen importantes excepciones y, además, su comportamiento
en el tracto gastrointestinal y sus efectos varían entre las distintas cepas
(Champagne y Møllgaard, 2008).
De hecho, muchos son incapaces de colonizar el intestino, ni siquiera

temporalmente, y ejercen sus efectos de modo local durante su paso por el

sistema gastrointestinal, por lo que deben ser ingeridos regularmente para que
persista cualquier propiedad favorable a la salud (Ouwehand y col., 2002).
Después del consumo de un alimento, el primer factor de estrés que tiene los
probióticos son las enzimas de la cavidad oral (amilasas y lisozimas) en un corto
período de tiempo (Gaskins y col., 2008). La primera línea real de defensa contra
bacterias que entran en el tracto gastrointestinal es el bajo pH de las secreciones
gástricas (pH=1). El tiempo de la residencia en el estómago puede ser de menos
de 1hr a varias horas, esto está en dependencia de los individuos, la dieta etc. El
pH en el estómago está en el más bajo nivel (pH 1,5), cuando el volumen de
comida es bajo y más alto mientras el volumen de comida se eleva (pH 5,5) (Rao,
2004).
Para los microorganismos que sobreviven las condiciones medioambientales del

estómago el próximo desafío es la secreción de la bilis y las sales biliares en el
duodeno. Además de las sale biliares, los probióticos necesitan sobrevivir, por
ejemplo, al jugo pancreático, proteasas e hidrolasas. En el íleon las condiciones
para la presencia bacteriana y crecimiento empiezan a mejorar y el número de
especie y de microorganismos presente puede ser alto (107-108 UFC/ml,
dependiendo del individuo). Aumenta significativamente la adhesión a la mucosa y
también, la colonización temporal. La mayoría de los lactobacilos ya ejercen el
efecto beneficioso en el ileon aunque se encuentran a menudo cantidades
superiores de bifidobacterias en el colon (Fernández y Fragoso, 2003).
Después de llegar al colon los probióticos también se deben adherir a la mucosa

del epitelio de la pared del colon y temporalmente colonizar esta región. Esta
habilidad es, probablemente, la que se une estrechamente a los efectos positivos
de los probióticos que por largos períodos persisten en el tracto intestinal y el

control y la regulación que estos muestran hacia otras bacterias potencialmente

patógenas al organismo humano (León, 2012).
Las condiciones que debe cumplir un cultivo probiótico son las siguientes (Taranto
y col., 2005):
a) Una vez administrado debe ser capaz de activarse, crecer rápidamente y

permanecer en el intestino durante un tiempo aceptable.
b) Debe ser resistente a los antibióticos presentes normalmente en los alimentos,

pero sensible a los utilizados en la terapia contra infecciones producidas por
bacterias lácticas (normalmente penicilinas o aminoglucósidos).
c) Ni las células, los productos de fermentación o los compuestos celulares

después de la muerte microbiana deben originar reacciones patogénicas, tóxicas,
alérgicas, mutagénicas o carcinogénicas.
1.2.2- Hongos
Los hongos filamentosos no han mostrado efectos probióticos, sin embargo, los
hongos unicelulares sí. Existen diferencias entre los agentes bioterapéuticos
bacterianos y los hongos unicelulares (levaduras) porque los primeros se
concentran en la función de promover la salud y se han utilizado con fines
terapéuticos preventivos, en cambio las levaduras tiene actividades específicas
como el efecto antisecretor y el efecto trófico que no se encuentran en los agentes
bacterianos y han tenido básicamente aplicaciones terapéuticas (Lynne y col,
1995; Surawicz, 2009).
Entre las principales especies de levaduras empleadas como probióticos se

encuentran las siguientes: Saccharomyces cerevisiae sub boulardii,
Kluyveromyces lactis y Kluyveromyces fragilis (Pérez, 2008; Surawicz, 2009). Se
ha informado que estas cepas son eficaces para prevenir la recurrencia de

diferentes tipos de diarrea y colitis en humanos (Kalpana y Gandhi, 2006;

Surawicz, 2009).
Las especies de levadura S. cerevisiae sub boulardii, K. fragilis y K. lactis son

consideradas microorganismos GRAS (Reconocido como Seguros) y se han
aprobado como aditivos alimentarios (Pérez, 2007).
En Indonesia fue usado un té como bebida a partir de frutas tropicales para curar
la diarrea; descubriéndose posteriormente que el agente responsable de detener
estos eventos era la levadura viva S. cerevisiae sub boulardii y no fue hasta
principios de los años 50 cuando se empleó en Francia para tratar un caso de
desorden diarreico (de Llanos, 2007). Numerosas cepas de esta especie se han
probado desde entonces empleando cultivos puros de células vivas, por su
eficacia en el tracto digestivo.
Es considerado primordial que la levadura permanezca metabólicamente activa

para que resulte funcional y estimule el crecimiento y la actividad bacterial para
degradar la fibra e incrementar la producción de ácidos orgánicos (acético,
propiónico y láctico) (Pérez, 2007).
Los productos probióticos son obtenidos como células viables y cuando alcanzan
el tracto gastrointestinal, provocan un balance en la microbiota intestinal, lo cual
mejora la utilización de los alimentos digeridos mediante metabolitos esenciales,
toxinas complejas u otros agentes inductores (Pérez, 2007).
El empleo de probióticos en el caso de las levaduras está dado por su capacidad

de colonización, la cual se produce a través de diferentes mecanismos. Desde el
punto de vista bioterapéutico, estos mecanismos se pueden clasificar como
farmacocinéticos (resistencia a acidez gástrica, proteólisis y capacidad de alcanzar
alta densidad de población en el tracto gastrointestinal) y farmacodinámicos
(antagonismo directo, efecto antisecretor y efecto trófico) (Pérez, 2008).

Asimismo se ha planteado que las levaduras juegan un papel importante en el

mantenimiento del potencial redox del estómago, el control de los niveles de
colesterol y también debido a que pueden llegar a tener entre 55-60% de su peso
total en proteínas, por lo que se han empleado mucho como fuente de alimento
tanto en humanos como en animales (pienso en forma de cápsulas peletizadas)
(Rubio y col, 2008)
Algunos autores han reportado, además, el uso de células de levaduras vivas

como agentes para detoxificar las micotoxinas y otras toxinas de origen bacteriano
como las secretadas por C. difficile y sus receptores en la mucosa del colon, así
como la toxina de Vibrio cholerae. Daños severos en órganos, debido a las dietas
que pudieran contener estas toxinas, fueron eliminados en presencia de S.
cerevisiae, proporcionando vitaminas, fuente de enzimas y proteínas (Pérez, 2007,
2008). Las levaduras tienen también efecto sobre Candida. krusei y C.
pseudotropicalis pero no sobre C. tropicalis (Castro y Rodríguez, 2005). Otros
efectos que han sido igualmente demostrados son la capacidad de reducir el
crecimiento de Candida albicans, Escherichia coli, Salmonella typhi, Shigella
flexnerii, Shigella dysenteriae, Vibrio cholerae, Salmonella enteritidis, y Clostridium
difficile (Kalpana y Gandhi, 2006).
Con relación a su taxonomía, Saccharomyces boulardii, presentaba un estado

taxonómico sin esclarecer hasta estudios moleculares recientes que sugieren que
es una subespecie de Saccharomyces cerevisiae (Kurtzman, 2003), se considera
como la representante más prominente de las levaduras probióticas dentro de la
comunidad de cepas bioterapéuticas de S. cerevisiae (Edwards-Ingram y col.,
2004).
El uso del término, agente bioterapéutico en lugar de probióticos denota que un

microorganismo tiene propiedades terapéuticas. Los agentes bioterapéuticos,

como en el caso de los probióticos, se deben dar en concentraciones suficientes

para ejercer propiedades terapéuticas, permanecer estables y viables antes de
usarse y sobrevivir en el ecosistema intestinal del hospedero para que puedan
ejercer su propiedades terapéuticas (Kalpana y Gandhi, 2006).
Otra de las potencialidad de la utilización de las levaduras es que benefician al

hospedero en varios aspectos como son, la modulación del sistema inmune y las
vías de transducción inducida por E. coli enteropatogénica, estimulan la actividad
de las enzimas digestivas, reducen la colonización de algunos enteropatógenos,
producen cambios favorables en la mucosa intestinal, pueden actuar como
probióticos o prebióticos (manano-oligosacáridos), son capaces de producir
minerales (por selección de cepas ricas en Selenio (Se) y cromo (Cr) o por
enriquecimiento del medio de cultivo con estos minerales), vitaminas
(hidrosolubles del complejo B) y enzimas (fitasas). También promueven el
crecimiento, mejoran la eficiencia alimenticia, mejoran la absorción de nutrientes
mediante el control de la diferenciación y proliferación de las células epiteliales del
intestino, eliminan y controlan microorganismos intestinales que producen
enfermedades subclínicas o clínicas y estimulan la inmunidad no específica y
específica en el intestino al adherirse a las microvellosidades intestinales y por
exclusión competitiva desplazan a numerosos microorganismos patógenos (Castro
y Rodríguez, 2005; Rubio, 2008).
Las levaduras no son huéspedes habituales de la biota microbiana digestiva en los

animales monogástricos, por lo cual circula a lo largo del tracto digestivo en forma
viva y activa sin adherirse a las paredes del mismo. Las cepas que no tienen
capacidad de adherirse al epitelio intestinal son eficaces como biorreguladores y
su acción depende de su capacidad de colonización a través de varios
mecanismos. Estos deben garantizar la diversidad de la biota en el intestino, a la

cual la cepa probiótica tiene que adaptarse y mantenerse estable y activa para
ejercer su acción y desarrollar, además, actividades específicas (Pérez, 2008).
1.2.2.1- Mecanismos específicos de las levaduras probióticas

Efecto antisecretor contra las toxinas
Las toxinas microbianas, por lo general, se unen a receptores específicos en

células epiteliales intestinales e inducen cambios que resultan en pérdida de agua
y electrolitos. El efecto antisecretor de la levadura está dado por la acción
específica sobre la unión de estos compuestos a su receptor intestinal o por su
degradación mediante actividad proteolítica de algunas de sus proteínas de
membrana (Pérez, 2008).
También se ha planteado que las proteasas producidas por levaduras,

generalmente son capaces de actuar en un amplio rango de valores de pH (4 a
11) y sobre una gran diversidad de sustratos, aunque son menos termoresistentes
que las proteasas bacterianas. Algunas levaduras segregan cantidades
apreciables de proteasas, pero las del género Saccharomyces tienen una baja
actividad de este tipo de enzimas (Pérez, 2008).
Se plantea que la levadura S. cerevisiae sub boulardii en altas concentraciones

tiene dos mecanismos de actividad antisecretora que actúan sobre las toxinas
bacterianas. Esta levadura produce dos proteínas de diferentes pesos
moleculares: 54 KDa y 120 KDa, respectivamente. Esta última no presenta
actividad proteolítica y compite específicamente contra la hipersecreción inducida
por V. cholerae y E. coli enterotóxica, reduciendo la formación de AMPc en las
células intestinales (Kalpana y Gandhi, 2006).

Efecto trófico en la mucosa intestinal
El efecto trófico de las levaduras está dado por estimulación de las actividades
enzimáticas y mecanismo de defensa intestinal, y se ha sugerido su efecto sobre
la expresión de algunas enzimas digestivas (tripsina, amilasa y lipasa) mediado
por la excreción de poliaminas. Para alcanzar una colonización efectiva y estable
de la microbiota digestiva en animales monogástricos y rumiantes se recomienda
la administración continuada del alimento con los probióticos. Estudios realizados
con S. cerevisiae no encontraron evidencias de adherencia permanente de la
levadura a la mucosa intestinal de ratones y humanos, sin embargo, detectó la
presencia de S. cerevisiae (BIOSAF SC47) en concentraciones significativas en
duodeno, ciego, colon y heces de lechones, aun después de 42 días de
postadministración, discrepando de los criterios anteriores (Pérez, 2008).
1.3- 1.2- Aplicaciones de los microorganismos probióticos

En la actualidad se encuentra en el mercado una amplia variedad de suplementos
probióticos que están disponibles en forma de polvo, cápsulas, tabletas, líquidos y
productos lácteos. Un yogurt, por ejemplo, tiene alrededor de 107
microorganismos (dosis 1 000 veces inferior a la utilizada en los ensayos clínicos),
mientras que los probióticos existentes en el mercado Europeo como ACTIMEL®
con Lactobacillus casei en una concentración alrededor de 1010 UFC/ml, ACTIF®
(6x109 de Lactobacillus gorbach y L. goldin) y NATURactiva® (más de 109 UFC·ml-
de Lactobacillus acidophillus) los cuales si corresponden con las dosis habituales
de probióticos utilizadas en los ensayos clínicos (Castro y Rodríguez, 2005).
En los últimos tiempos se han realizado investigaciones con relación al empleo de

la levadura S. cerevisiae sub boulardii como tratamiento a las afectaciones
gastrointestinales producidas por la administración prolongada de antibióticos del
tipo β-lactámicos en humanos, demostrándose su efectividad en un elevado

número de casos, logrando la disminución tanto de los síntomas como de la

severidad de los mismos (Lynne y col, 1995).
Una alta gama de productos comercializados en la actualidad, han elevado de

forma espectacular numerosas posibilidades de elaboración de alimentos
funcionales, apoyadas en la incorporación de una gran variedad de ingredientes
con actividad biológica, en la exclusión de constituyentes indeseados o en la
transformación de otros a un alimento convencional (Taranto y col., 2005).
Los alimentos funcionales, son aquellos que subsanan los requerimientos básicos
nutricionales, suministran bienes para la salud y disminuyen el riesgo de sufrir
enfermedades (Ley y col. 2006). Para ello se les agregan componentes
biológicamente activos, como minerales, vitaminas, ácidos grasos, fibra alimenticia
o antioxidantes, etc. (Wikipedia 2012/Alimentos funcionales).
1.3.1- Beneficios que aportan a la salud

Se ha demostrado que el consumo de alimentos con incorporaciones adecuadas
de microorganismos probióticos, son capaces de promover una amplia diversidad
de efectos benéficos en la salud del huésped ya que, además de brindar los
nutrientes necesarios ejercen efectos terapéuticos (Guarner, 2009).
1.3.1.1- Efectos sobre la digestibilidad de la lactosa.

La intolerancia a la lactosa exhibida por gran parte de la población mundial adulta
consta entre el 50 y el 70% de los habitantes en distinto grado, y está determinada
por la genética de la persona que la padece. Ésta se debe al decremento de la
actividad de la enzima lactasa en la mucosa intestinal. La lactosa que no es
digerida por el organismo, es productora de un efecto osmótico en la luz intestinal
y al arribar al intestino grueso, se fermenta mediante el ecosistema nativo, lo que
da lugar a la síntesis de ácidos grasos de cadena corta como lo son el acetato,

lactato, butirato y gases como dióxido de carbono (CO2), metano (CH4) y
hidrógeno (H2). Sus síntomas típicos son el dolor abdominal, flatulencia y diarrea.
La incorporación de probióticos en la dieta de forma continuada, bien liofilizados o

como leche fermentada, contribuye a sintetizar la enzima β-galactosidasa por el
paciente pudiéndose hidrolizar la lactosa y adsorber sus constituyentes,
disminuyendo el efecto de estos síntomas (McFarland, 2007).
1.3.1.2- Efectos sobre las enfermedades gastrointestinales e infecciones

del tracto urogenital.
La ingesta continuada de probióticos, hace posible que éstos intervengan en la
biodisponibilidad de nutrientes al organismo, lo cual logra facilitar la ruptura de
proteínas presentes en la leche, alcanzando la liberación de grandes cantidades
de calcio y magnesio a diferencia de cuando no se ingieren probióticos. Éstos,
están involucrados en la síntesis de vitaminas del complejo B, folatos y además,
algunas cepas tienen la capacidad de ejercer un efecto estabilizador en la
microbiota intestinal aumentando así, la resistencia contra infecciones intestinales,
como la prevención y tratamiento de diversas formas diarreicas. Son productores
de sustancias antimicrobianas que actúan en contra de bacterias presentes en la
microbiota normal del intestino, como: E. coli, Streptococcus, Clostridium difficile,
Bacteroides fragilis y Salmonella e inhiben la actividad enzimática bacteriana de β-
glucoronidasas, β-glucosidasas, ureasas, hidrolasa glicólica fecal, nitro-reductasa
y actividades trípticas (Hibberd, 2009).
1.3.1.3- Efectos sobre la diarrea asociada a antibióticos

La diarrea asociada a antibióticos ocurre en, aproximadamente, el 20% de los
pacientes tratados con éstos, y la causa es un desequilibrio microbiano que lleva a
una disminución de la microbiota endógena, responsable de la resistencia a la
colonización y de la capacidad fermentativa del colon. En muchos casos se debe a

la proliferación de Clostridium difficile. Se han observado efectos terapéuticos

positivos y concluyentes tras la administración oral de S. boulardii (Surawicz y col.
1989; McFarland y col. 1995; Surawicz, 2009), que posiblemente actúe reduciendo
los niveles de C. difficile, sus toxinas o la secreción intestinal de éstas. La eficacia
terapéutica de otros probióticos no ha sido tan bien establecida.
1.3.2- Factores que afectan la viabilidad de los microorganismos

probióticos
Existen varios factores causantes de la pérdida de la viabilidad de los
microorganismos probióticos lo cual conlleva a que, si se tiene un alimento de
procedencia probiótica, este pierda sus características funcionales una vez
anulada la existencia de estos microorganismos por lo que culminaría su vida útil
de consumo, ya que dejaría de caracterizarse como probiótico y por tanto no tenga
la facultad de brindar sus propiedades favorecedoras a la salud. Entre los factores
que pueden afectar la viabilidad se encuentran: la acidez de los productos a los
que se es incluido, acidez producida durante el almacenamiento (también
conocida como post-acidificación), nivel de oxígeno presente en los productos a
los que se someten, infiltración de oxígeno a través del empaque, sensibilidad
frente a substancias antimicrobianas producidas por las bacterias de las leches
fermentadas en los casos donde se añadan probióticos a este tipo de productos,
variaciones bruscas de la temperatura, el pH del medio en donde se encuentren,
la falta de nutrientes en la leche, entre otros (Charalampopoulos y Rastall, 2009).
1.4- Leches fermentadas

Los productos lácteos preparados por medio de la fermentación del ácido láctico, o
una combinación de esta y fermentación con levadura (Kefir) se le denomina como
leche fermentada o acidificada. Este nombre genérico deriva del hecho de ser la
leche la materia prima que se inocula con un cultivo de fermentos que convierte

parte de la lactosa en ácido láctico. En ese proceso de convención se produce

también otras sustancias tales como el anhídrido carbónico, ácido acético,
diacetilo, acetaldehído, y algunas otras que le confieren a distintos productos
características de sabor fresco y aroma. Los microorganismos en la producción de
Kefir producen también alcohol etílico. (Manual de Industrias Lácteas, 1996)
La transformación de la lactosa en ácido láctico trae consigo un efecto

conservador en la leche, es por esto que existe la necesidad de producir estos
fermentos ya que el bajo pH de la leche fermentada o acidificada inhibe el
crecimiento de bacterias responsable de la putrefacción y de otros organismos
perjudiciales. Algunas personas pueden consumir muy pocos volúmenes de leche
natural debido a que carecen de la enzima lactasa, por ello la lactosa no será
descompuesta en el proceso digestivo en azúcares más simples. Sin embargo
pueden tomar productos acidificados en los que la lactosa ya ha sido parcialmente
desdoblada por las enzimas bacterianas (Requena y col 2005)
1.4.1- Kefir
El kefir no es organismo concreto, sino una aglomeración de bacterias y levaduras
que forman una asombrosa biomasa con unas cualidades especiales y
excepcionales. Hace que la leche sea más nutritiva y digestiva además de
conferirle sus propiedades medicinales. Tiene muy buenas propiedades
terapéuticas, es un buen conservador de los alimentos refrigerados y mejora los
métodos de fermentación.
En el Kefir se produce una doble fermentación en el intercambio con la leche

(alcohólica y láctica) provocando la descomposición de la lactosa en ácido láctico
que impide que los alimentos se deterioren en el intestino y favorece el equilibrio
en la microbiota intestinal. También hace que sus proteínas, la albúmina y caseína
sean más asimilables, incrementando su valor biológico (Zittlau, 2004)

Se produce una peptonización, en cuyo proceso se pierde calcio mientras que se

origina una hidrólisis. Se forman además, diferentes sustancias, como ácidos
láctico y carbónico, butírico y acético. La acidez propia en el kéfir no neutraliza la
del estómago, consiguiendo coagular la caseína (Anón, 2012).
Parte de sus principios medicinales se asimilan en el estómago y van directamente

a la sangre, es un alimento predigerido a causa de la fermentación, mientras que
otros alimentos tienen que ser digeridos produciéndose a veces indeseables
fermentaciones intestinales. Puede reemplazar completamente a la leche materna
de los bebes e impide las náuseas durante los embarazos (Anón, 2012).
El Kefir se ha utilizado para combatir la anemia, paliar la acidez estomacal,

previene la osteoporosis y la arterioesclerosis, además activa el hígado y facilita la
eliminación de orina (prevención de cálculos renales), se emplea igualmente para
combatir la fatiga y el agotamiento crónico, evita infecciones intestinales y
fortalece el sistema inmunológico en general (Zittlau, 2004).
1.4.2- Características del kefir.

Es unos de los productos lácteos acidificados más antiguos, procedente de la
leche de cabra, de vaca o de oveja, se produce en diferentes países, aunque la
mayor parte en Rusia. Este es un producto viscoso, homogéneo de una superficie
brillante. Su pH es de 4,3 a 4,4. Para producir este tipo de producto se utiliza un
cultivo especial al que se le nombra granos de Kefir (Fig 1) los cuales constan de
proteínas, polisacáridos y una mezcla de diferentes tipos microorganismos tales
como levaduras y bacterias formadoras de aromas y ácido láctico. Las levaduras
representan alrededor del 5-10% de toda la microbiota. (Manual de la Industria
Láctea ,1996)

Fig 1: Microfotografía electrónica de granos de kefir
1.4.3- Características de los granos de Kefir

Los granos de kéfir tienen forma de masa semisólida elástica y amarillenta, con
una textura rugosa que recuerda al cerebro, a la coliflor y algunos corales, con un
tamaño de unos 15-20 mm de diámetro. Son insolubles en agua y en la mayoría
de los disolventes. Cuando se remojan en agua los granos se hinchan y su color
cambia a blanco. Durante la fermentación las bacterias producen ácido láctico y
las levaduras alcohol y anhídrido carbónico a partir de la lactosa. Debido al
metabolismo de las levaduras tiende a descomponerse, de donde el Kéfir toma
su especial aroma a levadura. El contenido de alcohol, ácido láctico y anhídrido
carbónico se controla a partir de la temperatura a incubar durante el proceso de
producción (Zittlau, 2004)
-Lactobacilos: Bacterias productoras de ácido láctico.
-Acetobacterias: Bacterias productoras de ácido acético.
-Levaduras: Se ha reportado la presencia de diferentes cepas de S. cerevisiae,

En el intercambio entre la leche y el Kefir se produce una doble fermentación en la

que se transforman los azucares y proteínas de la leche en:
-Gas carbónico (CO2) y etanol (gracias a la acción de las levaduras).
-Ácido acético. Muchos bacilos producen diacetilos, un aroma deseable en gran

variedad de productos de fermentación. El diacetilo es el responsable del
refrescante sabor de la leche fermentada con kéfir.
-Ácido láctico: Producido por la acción de las bacterias lácticas que reducen y
transforman la lactosa, en ácido láctico, responsable de su acidez (pH 4,2-4,6);
esto hace el kefir mucho más asimilable que la leche y que puedan tomarlo los
intolerantes a la lactosa.
-Coagulación de las proteínas. Transforma la albúmina y la caseína (fermentación

hidroalcohólica), haciéndolas mucho más digeribles.
Las bacterias utilizan la lactosa como fuente de energía y la transforman

produciendo ácido láctico, diacetilos y acetaldehído por la fermentación y la
degradación de proteínas. Todas estas sustancias contribuyen en algún grado al
sabor y aroma del producto. (Kaewprasert y Poosaran, 2009)

Capítulo 2
2- Materiales y Métodos
Esta investigación se realizó en el Instituto de Investigaciones para la Industria
Alimentaria en la Dirección de Ciencias (IIIA)
2.1- Materiales
Para llevar a cabo los experimentos se trabajó con levaduras del banco de cepas
del IIIA, a las que se identificó previamente. También se utilizó la bacteria ácido
láctica Lactobacillus casei.
2.2- Métodos de control utilizados

Las cepas de levadura se activaron en caldo extracto de malta a una temperatura
de 37 ± 1ºC por 16-24 h. Se tomó 0,5ml del cultivo con la cepa en 10 ml de caldo
extracto de malta para garantizar que existieran aproximadamente 10 9 UFC/ml y
se comprobó por conteo en cámara de Neubawer (Uribe, 2007). Luego se pasó a
inocular en la leche este cultivo al 10%.
Para activar cada cultivo láctico, se tomaron 10mL y se inocularon en 100 mL de

leche descremada en polvo (con 10% de sólidos totales) y se incubaron por
separado a una temperatura de 37ºC por 16 a 18 h.
2.3- Caracterización de las cepas Saccharomyces cerevisiae sub

boulardii P1y P2 del banco de cepa del IIIA.
Para este trabajo se utilizaron 2 cepas de Saccharomyces cerevisiae sub boulardii
que están disponibles en el banco de cepas del Instituto de Investigaciones para la
Industria Alimentaria. Se emplearon estas debido a que se ha informado por
numerosos autores sus características probióticas (Champagne y Møllgaard,

2008). A las mismas se les evaluaron sus características fisiológicas y sus

aptitudes probióticas.
Con el fin de determinar sus características fisiológicas, se realizaron a P1 y P2,

pruebas de asimilación y fermentación de compuestos carbonados, pruebas de
asimilación de nitrógeno y crecimiento en etanol como única fuente de carbono
(Collins, 1999; Vaugham-Martini y Martini, 1999; Linares y Solís, 2001; García,
2006).
2.3.1- Fermentación de carbohidratos

Para evaluar la capacidad de asimilación y fermentación de carbohidratos con
producción de CO2, se preparó una solución al 2 % de cada uno (Glucosa,
Lactosa, Maltosa, Galactosa, Melizitosa, D(+)Trealosa, Raffinosa, L(+)Ramnosa,

L(-)Sorbosa y D(-)Manitol) (Kurtzman y Fell, 1999). En 10 mL de cada una (que
contenían tubos Durham) se añadió 0,5 mL de cada cultivo de levadura con una
concentración de 109 UFC/mL y se mantuvieron a 37 ºC durante 21 días. La
fermentación de carbohidratos se interpretó como positiva si aparecía producción
de CO2 y la asimilación cuando apareció turbidez. Se tomó como control negativo
del crecimiento, la solución de azúcar al 2% sin inocular (Lodder, 1971; Vaughan-

Martini y Martini, 1999). Se hicieron 5 repeticiones de este experimento.
2.3.2- Asimilación del Etanol.

Se midió la asimilación del etanol como fuente de carbono. Para ello se empleó el
método descrito por Lodder (1971). Se activaro las levaduras en caldo nutriente,
se inocularon 0,1 mL en la solución de etanol (Anexo 1). Se utilizó como control
un tubo sin inocular. Se incubó por tres semanas a 37 0C. Se interpretó como
positivo a la prueba la aparición de turbidez en los tubos.

2.3.3- Asimilación en medio líquido del nitrato.

Se basa en la habilidad de algunas cepas de utilizar el nitrato como fuente de
nitrógeno. Es un criterio de identificación taxonómica. Para ello se disolvieron
11,7g de caldo nutriente en 100 mL de agua destilada y se le adicionó 0,78 g de
KNO3 , se calentó la solución para lograr una completa disolución; previamente se
distribuyó en tubos de ensayo utilizando 0,5ml de esta disolución en 4,5ml de agua
destilada sellado con tapón de algodón y se esterilizó en autoclave a temperatura
de 1210C durante 15 minutos. Estos tubos se inocularon con 0,5ml de una
solución que contenía 109 UFC/ml se incubaron durante una semana a 37 0C y
finalmente fueron revelados con ácido sulfanílico. Para lo cual se disolvió 8g de
ácido sulfanílico en un litro de ácido acético al 5N (una parte de ácido acético
glacial en 2,5 parte de agua destilada) (Atlas, 2006). Se utilizó como control un
tubo sin inocular.La aparición del color rojo o rosado indica la presencia de nitrito y
el positivo de la prueba.
2.3.4- Evaluación de las propiedades probióticas.

Para la evaluación de las propiedades probióticas de las 2 cepas analizadas se
determinó la resistencia a la acción de los antibióticos, la capacidad de tolerar
bajos valores de pH, la acción de bilis y la capacidad de proliferar a las
condiciones del organismo.
2.3.4.1- Resistencia a antibióticos

Para la determinación de la resistencia a antibióticos se empleó el método de
difusión en Agar Mueller-Hinton (Biocen, Mayabeque). Se tomaron alícuotas de 1
mL de un cultivo de 24h de cada levadura en Caldo Extracto de Malta. Los
antibióticos probados fueron Clotrimoxazol (25 µg), Ampicillina (20 µg),
Kanamicina (30 µg), Aztreonam (30µg), Augmentin (30 µg), Metronidazol (50 µg),
Meropenem (10 µg), Fosfomicin (200 µg) y Amoxicillina (30 µg), se incubaron

durante 48 h a 37 ºC. La resistencia a la actividad de los antibióticos se evaluó

como la diferencia entre el diámetro del halo de inhibición y el del disco del
antibiótico ensayado (Cona, 2002).
2.3.4.2- Capacidad para proliferar a diferentes pH

Para determinar la capacidad de las cepas de levadura de proliferar a diferentes
pH, se evaluaron valores de pH de 2,5 y 3,5 por ser el rango de pH del estómago
(Gotcheva y col., 2002). Además, se determinó el crecimiento de la cepa a pH 7
que es el valor del intestino delgado y el colon, donde prolifera y ejerce su acción
mayoritariamente este microorganismo. Se tomó como referencia el pH óptimo de
crecimiento del género Saccharomyces: 4,7.
Se partió de un cultivo incubado durante 24 h para garantizar que estuvieran en

fase de crecimiento exponencial. Se tomó 1ml de cada una y se inoculó a 10ml de
Caldo Extracto de Malta ajustado a los diferentes valores de pH. Para ajustar el pH
de cada variante, se empleó Ácido láctico (0,1025N) y NaOH (0,1196N). Las
variantes se incubaron a 37ºC por ser la temperatura óptima de crecimiento de
este género, durante 24 h. Se determinó a cada variante la concentración
celular/mL mediante conteo directo en cámara de Neubawer. En cada caso se
realizaron tres réplicas por cada valor de pH ensayado.
2.3.4.3- Capacidad de proliferar en presencia de bilis

Para establecer la capacidad de proliferación en presencia de bilis se determinó el
crecimiento a diferentes concentraciones de bilis fresca (Fragoso y col, 1999). Se
inoculó la cepa en erlenmeyers que contenían 10ml de Caldo Extracto de Malta; a
partir de este cultivo se incubarán al 1% erlenmeyers conteniendo 250 ml de Caldo
Extracto de Malta con diferentes concentraciones de bilis fresca (0.5, 1 y 2%)
(Fragoso y col, 1999). Como referencia se tomó el medio sin la adición de bilis y
tanto el control como los tratamientos se incubaron a 37 ºC durante 16 h.

Posteriormente se determinó a cada variante la concentración de células/mL de

medio de cultivo realizando conteos en cámara de Neubawer. Se realizaron tres
réplicas por cada concentración de bilis ensayada.
2.3.4.4- Multiplicación a las condiciones del organismo humano.

Se inoculó primeramente las cepas de levaduras en erlenmeyers con 10mL de
Caldo Extracto de Malta y se incubaron durante 24 horas a 37ºC; a partir de este
cultivo se inoculó al 1% erlenmeyers que contenían 250mL de este mismo medio
ajustado a pH 7. Se incubaron a 37ºC durante 24 h y cada 2 h se extrajeron
alícuotas de 5mL de cada frasco y se determinó la concentración celular por
conteo directo en cámara de Neubawer. Se hicieron 3 réplicas y los resultados se
procesaron mediante un ANOVA de clasificación simple y prueba de rangos
múltiples de Duncan mediante el programa SPSS 18 para Windows.
2.3.4.5- Capacidad antagónica contra Escherichia coli y Staphylococcus

aureus.
Para evaluar el efecto antagónico de Saccaromyces cerevisiae sub boulardii sobre
el desarrollo de Staphylococcus aureus y Escherichia coli “in vitro”, se empleó el
método de dilución en caldo. Para ello se inoculó la levadura al 1% en Caldo
Extracto de Malta, se adicionó 1ml de cada cultivo diana por separado y se incubó
a 37ºC durante 24 h. Cada 4 h se midió la concentración de cada patógeno
mediante método de placa vertida en medios selectivos (Agar Violeta Rojo Bilis
para Escherichia coli y Agar Baird Parker para Staphylococcus aureus ) y conteo
en cámara de Neubawer. Se realizaron 3 réplicas experimentales de esta prueba y
los resultados se procesaron mediante un análisis de varianza de clasificación
simple y prueba de rangos múltiples de Duncan (p ≤ 0,05) mediante el paquete
estadístico SPSS 11.5 para Windows.

2.4- Determinación de la dosis de empleo del probiótico

Se realizó un diseño factorial con 4 niveles para cada levadura. Los niveles
elegidos fueron: 0,5, 1, 1,5 y 2 %, mientras que Lactobacillus casei se mantuvo en
todos los casos al 1%. Los niveles de los factores se seleccionaron según los
valores experimentales informados en la literatura (Kaewprasert y Poosaran,
2009).
La tecnología empleada fue la desarrollada en trabajos anteriores (Kaewprasert y

Poosaran, 2009).
Para el procesamiento estadístico de los resultados se realizó un análisis de

varianza de clasificación doble con un nivel de confianza del 95 %. Los factores
analizados fueron dosis de empleo y cepa de levadura. Las variables de respuesta
fueron: aceptabilidad y viabilidad de los microorganismos inoculados. Las
variantes preparadas fueron:
var 1: 1% BAL/0,5 % Saccharomyces cerevisiae sub boulardii P1
var 2: 1% BAL/1 % Saccharomyces cerevisiae sub boulardii P1
Se aplicó test de rangos múltiples de Duncan (para p<0,05) para determinar las
diferencias estadísticas entre las variantes. Se realizaron 3 réplicas de este

experimento y para el procesamiento estadístico de los resultados se empleó el

paquete estadístico SPSS 11,5 para windows.
Para elegir la mejor variante se tuvo en cuenta la de mayor aceptabilidad por los
jueces así como la de mayor viabilidad de los microorganismos inoculados. Para la
aceptabilidad, los jueces evaluaron la calidad general del producto mediante una
escala de intensidad de aceptación, con el empleo de una escala hedónica de 7
puntos (7: me gusta extremadamente, 1: me disgusta extremadamente) (Espinosa,
2007) y tomaron en cuenta que el kefir es una leche fermentada con ligero olor y
sabor a fermentación alcohólica, acética y láctica, con un aroma fresco ligero a
levadura.
2.4.1- Características Físico Químicas, Microbiológicas y Sensoriales

de la mejor variante.
Con el fin de conocer la calidad del producto desarrollado, se realizó una
caracterización físico-química, microbiológica y sensorial. Los análisis físico-
químicos a realizar fueron:
• pH (por potenciometría)
• sólidos totales (NC-ISO-3728, 2006)
• acidez total, expresada en % de ácido láctico (NC 85-04).
• viscosidad: mediante viscosímetro Brookfield (Análisis de baja viscosidad) a

30 rpm con una temperatura de 20 ºC.
• porcentaje de etanol. Se midió en HPLC, usando una columna ODS (C-18)

(SHIMADZU, Kyoto) y un detector de índice de refracción. La fase móvil fue
5 mM H2SO4 a una velocidad de flujo de 0.75 mL/min. El volumen de la

muestra fue de 20 μl, la que se sometió a centrifugación (12 000 rpm, 15

min) y se filtró por un tamaño de poro de 0.45 μm.
Los análisis microbiológicos realizados fueron:
• viabilidad de microorganismos probióticos (en agar para conteo en placas

(ACP) suplementado con 10% de sólidos totales de leche descremada en
polvo, 37 ºC, 48 h)
• concentración de levaduras (por conteo directo en cámara de Neubawer)
• conteo de hongos y levaduras totales (NC-ISO 7954, 2011)
• conteo de coliformes fecales (NC-ISO 4831, 2010)
• coliformes totales (NC-ISO 4832, 2010)
Los análisis sensoriales se realizaron mediante una evaluación descriptiva

cualitativa por un panel de 7 jueces entrenados para la cata de productos lácteos.
En este tipo de análisis se hace una descripción de todas las características del
producto a analizar.
2.4.2- Determinación de la vida de anaquel

Para la determinación de la vida de anaquel, el producto se almacenó durante 30
d a 4 ±1ºC. Las evaluaciones se realizaron 2 veces cada semana y las variables
respuesta analizadas fueron:
• viabilidad de microorganismos probióticos (en ACP suplementado con 10%

de sólidos totales de leche descremada en polvo, 37 ºC, 48 h)
• concentración de levaduras (por conteo directo en cámara de Neubawer)
• evaluación de aceptación/rechazo por jueces sensoriales.

Las variantes se almacenaron a temperaturas entre 2 y 4 º C y HR de 95 ±2 %.

Para el estudio de vida de anaquel se tomó como criterio de rechazo la evaluación
microbiológica. El producto se considera probiótico cuando los conteos de
probióticos estaban en 107 UFC/mL. Los resultados obtenidos se procesaron

como datos incompletos de fracaso por el método de Ploteo de Riesgos,
admitiendo 5 % de unidades deterioradas (Herrera, 1998).
2.5- Costo del producto.

Para determinar el costo del producto, se tuvieron en cuenta los costos de cada
materia prima y su índice de consumo. El cálculo se hizo por cada 100 kg de
producto.

Capítulo 3
3- Resultados y Discusión
3.1- Resultados de la caracterización de Saccharomyces
cerevisiae sub boulardii P1 y P2 del banco de cepas del IIIA
3.1.1- Fermentación de carbohidratos
El comportamiento fermentativo de la cepa P1 y P2 con distintos azúcares (Tabla
1) mostró que P1 fue capaz de asimilar todos los azúcares ensayados durante el
experimento. Para el caso de la fermentación es posible detectar que esta cepa
solo fue capaz de degradar completamente hasta CO 2 y agua, tres de los
azúcares propuestos, los que fueron: Glucosa, Galactosa y Raffinosa.
Tabla 1. Comportamiento de las cepas P1 y P2 frente a carbohidrato
Azúcares Saccharomyces cerevisiae sub boulardii

probados P1 P2
Asimilación Fermentación Asimilación Fermentación
Glucosa + + + +
Lactosa + - - -
Maltosa + - - -
Galactosa + + + -
Melizitosa + - + -
D(+)Trealosa + - - -
Raffinosa + + + -
L(+)Ramnosa + - - -
L(-)Sorbosa + - - -
D(-)Manitol + - - -
Leyenda: +: positivo; -: negativo
Respecto a la cepa P2 con distintos azúcares, se puede apreciar que la misma

fue capaz de asimilar solamente cuatro de los azúcares ensayados durante el
experimento: la Glucosa, la Galactosa, la Melizitosa y la Raffinosa. Para el caso de

la fermentación, esta cepa solo fue capaz de degradar completamente hasta CO2
y agua, la Glucosa.
Las levaduras pueden, a partir de diferentes fuentes de carbono, realizar la

fermentación o respiración lo cual es utilizado como un criterio taxonómico. La
habilidad de las levaduras de fermentar un compuesto carbonado depende de tres
factores: la presencia o ausencia de sistemas de transporte que median en la
toma de los azúcares, la concentración de oxígeno y la presencia de un sistema
enzimático que lleva acabo la hidrólisis y/o media en la ruptura glicolítica
anaerobia hasta etanol y CO2 (Deak y Beuchat, 1987).
3.1.2- Asimilación del etanol

La cepa P1 fue capaz de utilizar más activamente el etanol como única fuente de
carbono para su crecimiento, mostrando una apreciable turbidez en todos los
tubos mientras que la cepa P2 por el contrario mostró una ligera turbidez del
medio durante la realización del ensayo, manifestando mayores dificultades para
la asimilación del etanol y su empleo como única fuente de carbono.
El etanol es un compuesto altamente tóxico para la vida de los microorganismos,

sin embargo existen numerosas cepas de levaduras que no solamente pueden
vivir en ambientes con una concentración elevada de etanol, sino que además son
capaces de utilizar este compuesto como única fuente de carbono y realizar una
degradación parcial o total del mismo. Las levaduras del género Saccharomyces
se caracterizan por una elevada tolerancia al etanol destacándose dentro del
mismo las cepas de la especie Saccharomyces cerevisiae, las que son
ampliamente utilizadas en la industria para la producción de bebidas alcohólicas
como el vino, cerveza, ron y otros (Uribe, 2007; Andrade-García, 2009). Por esta

razón no es raro que estas cepas empleadas en nuestro estudio sean capaces de
crecer y desarrollarse en presencia de etanol como única fuente de carbono.
3.1.3- Asimilación del nitrato

Es posible apreciar que ninguna de las dos cepas fue capaz de asimilar el nitrato
de potasio como fuente de Nitrógeno y reducirlo hasta nitrito. Este resultado se
corresponde con lo planteado por Lodder, 1971, el cual plantea que ninguna de las
cepas del género Saccharomyces no son capaces de reducir el nitrato para
formar nitrito.
La habilidad o inhabilidad de utilizar el nitrato ha sido utilizado como un criterio de

clasificación de las levaduras, el cual tiene un valor particular en taxonomía,
muchos géneros tienen la característica de no utilizar el NO3 como son:
Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia y Debaryomyces. Otros géneros como:
Hansenula y Citromyces, todas sus especies son capaces de utilizar el nitrato
como fuente de Nitrógeno. Además los géneros Candida y Torulopsis presentan
especies nitrato positivo y negativo. La habilidad de utilizar el itrato depende de la
acción secuencial de una serie de sistemas de reductasas que median en la
reducción asimilativa del nitrato a otros compuestos más reducidos, la ausencia o
una baja actividad uno o varios de estos sistemas puede traer la inhabilidad de
utilizar el nitrato (Lodder, 1971).
3.2- Propiedades probióticas

3.2.1- Resistencia a antibióticos
Las cepas de Saccharomyces cerevisiae sub boulardii mostraron resistencia a los
antibióticos ensayados, se encontró sólo una pequeña inhibición en el caso de
fosfomicina para P2. La cepa Saccharomyces cereviseae sub boulardii es sensible
a la acción de medicamentos fungicidas y fungistáticos como metronidazol, pero

de forma general es resistente a la acción de los antibióticos (Golledge y Riley,

1996; Mateu y col., 2006). Este hecho posibilita que la levadura pueda ser ingerida
por personas que estén consumiendo estos antibióticos sin que esto afecte la
proliferación y colonización de la cepa. (Golledge y Riley, 1996).
Esta resistencia a la acción de los antibióticos, especialmente los β- lactámicos, ha

sido muy estudiada por numerosos autores y se ha planteado su empleo para
contrarrestar la terapia prolongada con este tipo de medicamentos que causa
afectaciones en el tracto gastrointestinal, logrando contener y controlar infecciones
por Clostridium difficile y C. perfringens de forma exitosa y mejorar la calidad de
vida de los pacientes que reciben una terapia con antibióticos por un tiempo
prolongado (Lynne y col 1995; Kotowsa y col., 2005; Johnson y col., 2007;
Surawitz, 2009).
3.2.2- Crecimiento de los microorganismos a diferentes valores de

pH
Las cepas P1 y P2 fueron capaces de crecer en todos los valores de pH
ensayados (Tabla 2). Al realizar el análisis estadístico se demostró que no existen
diferencias significativas entre los valores de concentración celular obtenidos para
p≤ 0,05. Además, desde el punto de vista microbiológico se considera que valores
de concentración celular que se encuentran dentro de un mismo orden de
potencia no guardan diferencias.
Las levaduras, como grupo microbiano, tienen la capacidad de crecer a pH ácidos

(Brock y Madigan, 1991). Loourens- Hatting y col, 2001, afirman que la cepa
Saccharomyces cerevisieae sub boulardii es capaz de sobrevivir durante el paso a
través del tracto gastrointestinal y establecerse en él. Este hecho posibilita que las
levaduras con acción probióticas sean utilizadas con este propósito, puesto que
pueden resistir y proliferar durante su tránsito por el medio ácido del estómago y

establecerse finalmente en diferentes áreas del intestino delgado y el colon donde

ayudan con la absorción de nutrientes y evitan la adhesión y crecimiento de
microorganismos patógenos que causan cuadros de disentería como E.coli,
Salmonella, Shigella y otras bacterias enteropatógenas (Johnson y col., 2007).
Tabla 2. Influencia del pH sobre la concentración celular de las cepas P1 y P2 (log

UFC/mL) (n=3)
pH P1 P2
2,5 7,58 (a) 7,53 (a)
3,5 7,62 (a) 7,56 (a)
4,7 7,63 (a) 7,54 (a)
7 7,65 (a) 7,56 (a)
Letras diferentes indican diferencias significativas según ANOVA (p≤0,05).
3.2.3- Capacidad de proliferar en presencia de bilis

Como se aprecia en la tabla 3, los resultados demuestran que las cepas P1 y P2
son capaces de resistir el ataque de las sales y las enzimas presentes en la bilis,
puesto que no se encontraron diferencias significativas (p<0,05) entre los
tratamientos con las bilis y el control sin estas. La resistencia a la acción de las
sales biliares y otras enzimas presentes en las secreciones biliares se debe
principalmente a la presencia en la pared celular de las levaduras de numerosos
polisacáridos y oligosacáridos complejos que impiden la acción de estas sobre la
membrana citoplasmática que si es más rica en lípidos y proteínas y por tanto
susceptible a la degradación (Rodríguez y col, 2008).
Gotcheva y col. (2002), al estudiar la resistencia a la acción de la bilis en cepas de

levaduras pertenecientes al género Candida, muestran que estas permanecen
viables a un gran número de concentraciones ensayadas, las cuales se analizaron
con valores entre 0,1 y 2% con un aumento da 0,1% cada vez.

Tabla 3. Crecimiento de las cepas P1 y P2 a diferentes concentraciones de bilis

fresca (log UFC/mL)
Concentración de bilis fresca (%) P1 P2

0 7,60 (a) 7,54 (a)
0,5 7,53 (a) 7,51 (a)
1 7,51 (a) 7,53 (a)
2 7,49 (a) 7,54 (a)
Letras diferentes indican diferencia significativa (p≤0,05).
El efecto de las bilis sobre la supervivencia de los microorganismos depende de la

concentración de las bilis y de las propiedades específicas de cada cepa
(Gotcheva y col, 2002 ).Du-touit y col (1999), plantean que la resistencia a la
acción de las bilis por las levaduras están relacionadas con la actividad de una
enzima denominada sal-biliar hidrolasa que contribuyen a hidrolizar la bilis
conjugada, reduciendo su efecto tóxico.
3.2.4- Multiplicación a las condiciones del organismo

La Fig. 2 muestra como se multiplican las cepas P1 y P2 en las condiciones de pH
y temperatura semejantes a las del organismo humano.
La curva de crecimiento de esta levadura se corresponde con el patrón de

crecimiento típico de los cultivos microbianos (Brocks y col., 2006). Durante las
primeras 5 h se observa una fase de lento crecimiento debido a la adaptación de
cada cepa a las condiciones de cultivo, siguiéndole una fase de aceleración de
crecimiento durante las siguientes 5 h en las que sus sistemas enzimáticos se
activan rápidamente y comienza la expresión de numerosas enzimas que ayudan
al desarrollo del microorganismo y el aprovechamiento de los nutrientes presentes
en el medio de cultivo con mayor facilidad. En las sucesivas 4 h. tiene lugar la
fase exponencial de crecimiento donde el cultivo muestra su máxima velocidad de

crecimiento puesto que en este momento la maquinaria biosintética y enzimática

se encuentra en sus máximos niveles de expresión llevándose a cabo un
vertiginoso proceso de multiplicación y división celular en la población.
En las 2 h subsiguientes a esta etapa se aprecia una desaceleración del

crecimiento hasta que el cultivo alcanza su concentración máxima y a continuación
se establece un equilibrio entre el número de células muertas y las nuevas que se
generan alrededor de las 18 h. Pasadas las 24 h las cepas comienzan un proceso
de envejecimiento en el cual el número de células que se forman no es capaz de
sustituir al número de las que muere y comienza la fase de aceleración negativa
que conlleva a la muerte de la población horas después.
Fig 2: Velocidad de multiplicación de las cepas de levadura P1 y P2 a pH 7 y 370C (log

UFC/mL)
Tanto la cepa P1 como P2 se multiplicaron hasta una concentración máxima de 8

unidades log, por tanto, pueden ser empleadas como microorganismos probióticos
puesto que para que un microorganismo pueda ejercer su efecto beneficioso en el
organismo debe alcanzar una concentración celular mínima de 10 7 células/ml para

lograr una colonización efectiva en el tracto gastrointestinal luego de pasar por los
bajos valores de pH estomacal, así como la acción de las sales biliares y la
competencia de la microbiota autóctona (Sullivan y Nord, 2002).
3.2.5- Capacidad antagónica contra Staphylococcus aureus y

Escherichia coli
La Fig. 3 muestra la capacidad antagónica de P1 contra Staphylococcus aureus.
Como se puede observar, este microorganismo no es capaz de competir contra P1
y a las 16 h no se encontró presencia de Staphylococcus aureus.
Fig 3: Antagonismo entre Saccharomyces cerevisiae sub boulardii P1 y Staphylococcus

aureus
La Fig 4 muestra el antagonismo entre P2 y Staphylococcus aureus. Como se

puede observar sucede lo mismo que al emplear P1, que a las 16 h el
microorganismo patógeno no se encontró. Se sabe que las levaduras no producen
sustancias antimicrobianas que pudieran difundir el medio, como hacen las BAL, y
de esta manera contrarrestar la acción de los patógenos (Domitille y col., 2005).
Las levaduras compiten por sitios de adherencia, lo que las hace más resistentes

al ambiente gastrointestinal y de esta maera su multiplicación será más fructífera

en comparación con los patógenos (Rubio y col., 2008).
Fig 4: Antagonismo entre Saccharomyces cerevisiae sub boulardii P2 y Staphylococcus

aureus
Respecto a P1 (Fig 5) y P2 (Fig 6) contra Escherichia coli, se observa como a las

4 h la concentración del patógeno disminuyó en 3 unidades log y la relación entre
cada cepa de Saccharomyces cerevisiae sub boulardii evaluada fue de 12:1 para
la cepa P1 y de 10:1 para P2.
S. cerevisiae, para adherirse a las células epiteliales del intestino emplea

manoproteínas de la membrana celular (adhesinas) (Tuitte, 1991; Giannasca y
col., 1996; Verstrepen y Klis, 2006). Una vez adherida ejercen parte de su efecto
probiótico impidiendo la unión de las bacterias patógenas al competir con estas
por sustrato y los sitios de afiidad. Rubio y col., (2008) observaron que después de
24 h de incubación a 37°C las células de Saccharomyces cerevisiae sub boulardii
forman agregados que evitarían in vivo la adherencia de los patógenos al epitelio
gastrointestinal.

Fig 5: Antagonismo entre Saccharomyces cerevisiae sub boulardii P1 y Escherichia coli
Fig 6: Antagonismo entre Saccharomyces cerevisiae sub boulardii P2 y Escherichia coli
Saccharomyces cerevisiae sub boulardii P1 y P2 son una opción favorable para

usar en alimentos ya que son capaces de inhibir Staphylococcus aureus antes de
las 16 h y Escherichia coli antes de las 4 h.

3.3- Elección de la mejor variante

El análisis de varianza demostró que existen diferencias significativas (para
p<0,05) entre las variantes (Tabla 4) para la aceptabilidad.
Tabla 4. Resultados medios de la aceptabilidad sensorial (n=3)
Combinación Aceptabilidad
1% BAL/0,5 % S. cerevisiae sub boulardii P1 1,37 (0,12)a
1% BAL/1 % P1 5,70 (0,10)d
1% BAL/1,5 % P1 4,40 (0,10)c
1% BAL/2 % P1 1,27 (0,06)a
1% BAL/0,5 % P2 1,27 (0,15)a
1% BAL/1 % P2 5,63 (0,21)d
1% BAL/1,5 % P2 4,17 (0,15)b
1% BAL/2 % P2 1,27 (0,06)a
Letras diferentes en la columna significan diferencias significativas para p <0,05. () desviación
estándar.
Se observa que las variantes 1 % L. casei/1% de levadura (var 2 y 6) poseen más

aceptabilidad que el resto de las combinaciones probadas. Aunque no existieron
diferencias significativas entre ellas, los jueces sensoriales prefirieron la variante 1
% L. casei/1% de Saccharomyces cerevisiae sub boulardii (var 2) ya que tenía un
mejor acabado, con un sabor más fresco y mayor equilibrio entre las 3
fermentaciones: alcohólica, acética y láctica. En el resto de las variantes (1,3,4,5,7
y 8), la acidez y el sabor alcohólico que le transmitió al kefir la combinación L.
casei-Saccharomyces cerevisiae fue la causa tendencia al rechazo por parte del
los consumidores.
Respecto a la viabilidad (Tabla 5), existen también diferencias sigificativas entre

las variantes (para p < 0,05).

Tabla 5. Resultados medios de la viabilidad (log UFC/mL)(n=3)
Variante Viabilidad
1% BAL/0,5 % S. cerevisiae sub boulardii P1 2,23 (0,31)a
1% BAL/1 % P1 7,57 (0,21)c
1% BAL/1,5 % P1 6,57 (0,21)b
1% BAL/2 % P1 6,50 (0,10)b
1% BAL/0,5 % P2 1,73 (0,67)a
1% BAL/1 % P2 7,30 (0,20)c
1% BAL/1,5 % P2 6,33 (0,15)b
1% BAL/2 % P2 6,50 (0,10)b
Letras diferentes en la columna significan diferencias significativas para p <0,05. () desviación
estándar.
Como se puede observar, las variantes 1 y 5 fueron las de menores viabilidades,

significativamente diferentes al resto. La 2 y la 6 fueron las de mayores
viabilidades (7 unidades log) y se encontró que había equilibrio 1:1 entre la BAL y
la levadura inoculada. Esto no ocurrió en las variantes a las que se inoculó mayor
concentración de S. cerevisiae sub boulardii (var 3,4,6,7) en las que la alta
viabilidad obtenida fue por la presencia de levadura.
Por la aceptabilidad sensorial obtenida así como por el equilibrio en la viabilidad, la
combinación 1% de L. casei-1% de Saccharomyces cerevisiae sub boulardii P1 es
la mejor para elaborar el kefir de leche.
3.3.1- Caracterización de la mejor combinación

La Tabla 6 muestra la calidad física y química de las variantes elegidas 1% L.
casei-1% Saccharomyces cerevisiae sub boulardii P1.

Tabla 6. Resultados medios de la caracterización física y química de la mejor

variante (n=3)
Acidez
Sólidos Concentración
Combinación pH (% ácido láctico viscosidad
totales etanol (% v/m)
m/m)
L. casei- P1 4,75 7,44% 1,50% 210 mPa/s 0,5
L. casei-P1: L. casei- S. cerevisiae sub boulardii P1; L. casei-P2: L. casei-S. Cerevisiae
sub boulardii P2
El pH obtenido es propio de kefir y algunos autores informan valores de 4,2
(Kaewprasert y Poosaran, 2009). El Codex para leches fermentadas y dentro de
ellas el kefir exige mínimo 0,6 % de acidez expresada como % ácido láctico (m/m)
(Codex Stan 243, 2003). Respecto a la concentración de etanol, en este producto
se acepta hasta 2 %.
Con relación al pH, los cambios debido a la acidez láctica ocurren después que se
inoculó la BAL, o sea, después de las 15 h de fermentación con la levadura
(Kaewprasert y Poosaran, 2009). El pH decrece durante el almacenamiento en
otras leches fermentadas porque las bacterias ácido-lácticas metabolizan la
lactosa presente en el medio (Katsiari y col., 2002; Rao y col., 2004). En kefir
García y col. (2006) informaron que el empleo de Lactococcus spp. y
Lactobacillus spp. pueden producir ácido láctico durante las primeras 24 h de
fermentación en kefir de leche y reportaron valores de hasta 4,24.
Respecto a la concentración de etanol, se obtuvo 0,5 % (v/m) (Fig 7) y en este

producto se acepta hasta 2 %. Según la técnica empleada, el etanol elude a los 21
min y el resto de los picos obtenidos en el cromatograma podrían ser los ácidos
presentes en el producto.

Fig 7: Cromatograma para el % de etanol obtenido de la combinación 1% L. casei/ 1% de

Saccharomyces cerevisiae sub boulardii P1
Con respecto a las características microbiológicas, la viabilidad, ambas

combinaciones de kefir tenían una viabilidad de BAL y de levaduras de 7,54 para
L. casei-Saccharomyces cerevisiae sub boulardii P1, en la misma unidad
logarítmica de los aerobios mesófilos (7 unidades log) mientras que no se
encontró presencia de coliformes, coliformes fecales ni hongos filamentosos, lo
que avala la calidad general del producto.
Respecto a la evaluación sensorial, el producto presentaba un olor a fermentación

alcohólica débil, un ligero olor a vinagre y un aroma fresco, ligero a levadura.
Con respecto a las características microbiológicas, específicamente la viabilidad,

fue de 7,54 para L. casei-Saccharomyces cerevisiae sub boulardii P1, en la misma
unidad logarítmica que los aerobios mesófilos (7 unidades log) mientras que no se
encontró presencia de coliformes, coliformes fecales ni hongos filamentosos, lo
que avala la calidad general del producto.

Respecto a la evaluación sensorial, los jueces describieron al producto como

viscoso, homogéneo de una superficie brillante, de sabor fresco y ácido con un
ligero aroma a levadura.
3.3.2- Vida de anaquel

La Fig 8 muestra la viabilidad de los microorganismos inoculados durante el
almacenamiento. Como se puede observar, a los 22 d, los conteos microbianos
estaban en 7 unidades log por lo que el producto ya no posee la cualidad para
considerarse probiótico. El Codex para leches fermentadas y dentro de ellas el
kefir exige mínimo 107 UFC/mL de producto.
Fig 8: Resultados medios de la viabilidad de los microorganismos en kefir.
Por su parte la evaluación sensorial mostró que los jueces no rechazaron el

producto en los 30 d evaluados.
La Tabla 7 muestra la salida correspondiente al experimento y puede observarse

que los percentiles indican las durabilidades a obtener para cada porcentaje de
unidades defectuosas que se admita, con la diferencia que aquí también se dan
los límites de confianza, en este caso se consideran los límites inferiores para

reportar la vida de anaquel del producto, esto con el fin de obtener un margen
mayor de confianza (Anexo 2).
Tabla 7. Resultados de la estimación de la vida de anaquel de kefir (días)
Percentil (%) valor Límite inferior Límite superior

5 20,47 11,87 35,31
10 20,81 13,84 31,29
La prueba de bondad de ajuste de Kolmogorov - Smirnov indicó que en todos los

casos la distribución probabilística de los tiempos de fallos puede ser descrita por
la “Ley de Weibull” y tomando el límite inferior para un percentil del 10 % y el límite
inferior, el kefir tiene una vida de anaquel de 13 d a temperaturas entre 2 y 4 ºC y
HR de 95 ±2 % .
Por sus características probióticas el kefir de leche con microorganismos

adicionados tiene una vida de anaquel de 13 d.
3.3.3- Costos
La tabla 8 muestra el costo unitario para el kéfir con la mezcla de 1% L.
casei/1%S. cerevisiae sub. boulardii. Como se puede observar, el costo es de
50.28 pesos/100 kg de producto,
Tabla 8.- Costo unitario del kéfir con probióticos (para 100 kg)
Producto Peso (Kg) Costo unitario (MN) Costo

LDP 10 4,72 47,2
Sacarosa 5 0,61 3,05
Cultivo 0,00032 83,43 0,03
Costo Total (CUP) 50,28

CONCLUSIONES
Se desarrolló un kéfir de leche con buena viabilidad, aceptabilidad por los jueces
sensoriales, de excelente calidad físico-química, microbiológica y sensorial con
Saccharomyces cerevisiae sub boulardii y Lactobacillus casei como
microorganismos probióticos.
Las 2 cepas de Saccharomyces cerevisiae sub boulardii existentes en el banco de

cepas del IIIA se caracterizan por asimilar los carbohidratos ensayados pero son
fisiológicamente diferentes ya que P1 fue capaz de fermentar y asimilar un mayor
número de compuestos carbonados que P2. Ninguna de las cepas ensayadas
utilizó el nitrato de potasio como fuente de nitrógeno.
Las cepas se pueden utilizar como probiótico porque son resistentes a la acción
de 9 antibióticos, son capaces de vencer las barreras del tracto gastrointestinal al
tolerar valores de pH =2,5, son resistentes a la acción de las secreciones biliares y
puede crecer y multiplicarse de manera satisfactoria en condiciones de
temperatura y pH semejantes a las del interior del tracto gastrointestinal de los
seres humanos y se logran conteos del orden de 7 unidades logarítmicas.
Saccharomyces cerevisiae sub boulardii P1 y P2 tienen acción antagónica contra

Staphylococcus aureus que lo inhibe antes de las 16 h y contra Escherichia coli
que la inhibe antes de las 4 h.
Por la aceptabilidad sensorial obtenida así como por el equilibrio en la viabilidad, la

combinación 1% de L. casei-1% de Saccharomyces cerevisiae sub boulardii P1 es
la mejor para elaborar el kefir de leche.
El kéfir desarrollado con el empleo de 1%Lactobacillus casei/1% Saccharomyces
cerevisiae sub boulardii P1 obtenido tuvo una acidez de 1,5%, una viscosidad de
210mPa/s, 7,44% de sólidos totales, un pH de 4,75, y 0,5 % de etanol. Se

caracterizó por tener una elevada viabilidad de bacterias acidolácticas y levaduras

así como bajos conteos de coliformes, coliformes fecales ni hongos filamentosos.
Con relación a la evaluación sensorial, el producto presentó un débil olor a

fermentación alcohólica, un ligero olor a vinagre y un aroma fresco, ligero a
levadura.
Por sus características probióticas el kefir de leche con microorganismos

adicionados tiene una vida de anaquel de 13 d y su costo es de 50,28 MN/100 kg.

RECOMENDACIONES
Probar otras bacterias ácido lácticas probióticas con las cepas de Saccharomyces
cerevisiae sub boulardii

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ZITTLAU J. (2004) El Gran Libro del Kefir. ISBN: 9788477209836

ANEXO 1.- MEDIO UTILIZADO PARA LA FERMENTACIÓN

DE CARBOHIDRATOS
-100ml de agua destilada.
-0.1g (NH4)2SO4.
-0.1g K2H2PO4.
-0.05 MgSO4 x 7H2O.
-Etanol al 3%.

ANEXO 1.- SALIDA DEL PROGRAMA PLOTEO DE

RIESGOS PARA ESTIMAR LA VIDA DE ANAQUEL DE
KEFIR


Desarrollo de Un Kefir de Leche

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Desarrollo de un kefir de leche con microorganismos probióticos

Universidad de La Habana. Instituto

Ana Ibis Cabrera Rodríguez

Ana Ibis Cabrera Rodríguez

La revisión bibliográfica fue exhaustiva y realizada con dedicación, pues recoge

La compañera Ana Ibis trabajó con un grado de independencia satisfactorio y

• Msc Tatiana Beldarrain Iznaga (tatiana@iiia.edu.cu)

• Lic. Jorge Isaac López Pino (isaac@iiia.edu.cu)

La Habana, 13 de junio de 2013

1. Ana Ibis Cabrera Rodríguez;

Ana Ibis Cabrera Rodríguez, 2013

Ana Ibis Cabrera Rodríguez autoriza al Instituto de Farmacia y Alimentos

Honrar a quien se lo merece

A mis padres, testimonio vivo de lo que soy.

A mi hermana, por su constante preocupación en mis exámenes y su incondicional apoyo.

A mis amigas Ismarays y Leyanis que siempre permanecen conmigo.

Datos bibliográficos y licencia.........................................................................................................4

1.1- Probióticos. Aspectos generales..................................................................................15

1.2- Microorganismos usados como probióticos..................................................................15

1.2.1- Bacterias ...............................................................................................................16

1.2.2- Hongos ..................................................................................................................18

1.2.2.1- Mecanismos específicos de las levaduras probióticas.....................................22

1.3.1- Beneficios que aportan a la salud..........................................................................24

1.3.1.1- Efectos sobre la digestibilidad de la lactosa.....................................................24

1.4- Leches fermentadas.....................................................................................................26

1.4.2- Características del kefir..........................................................................................28

2.2- Métodos de control utilizados.......................................................................................31

2.3.1- Fermentación de carbohidratos..............................................................................32

2.3.2- Asimilación del Etanol. ..........................................................................................32

2.3.3- Asimilación en medio líquido del nitrato.................................................................33

2.3.4- Evaluación de las propiedades probióticas. ..........................................................33

2.3.4.1- Resistencia a antibióticos.................................................................................33

2.4.1- Características Físico Químicas, Microbiológicas y Sensoriales de la mejor

2.4.2- Determinación de la vida de anaquel.....................................................................38

2.5- Elaboración de la ficha de costo del producto..............................................................39

3.1- Resultados de la caracterización de Saccharomyces cerevisiae sub boulardii P1 y P2

3.1.1- Fermentación de carbohidratos..............................................................................40

3.1.2- Asimilación del etanol.............................................................................................41

3.1.3- Asimilación del nitrato............................................................................................42

3.2- Propiedades probióticas...............................................................................................42

3.2.1- Resistencia a antibióticos.......................................................................................42

3.2.2- Crecimiento de los microorganismos a diferentes valores de pH...........................43

3.2.4- Multiplicación a las condiciones del organismo......................................................45

3.2.5- Capacidad antagónica contra Staphylococcus aureus y Escherichia coli..............47

3.3- Elección de la mejor variante........................................................................................50

3.3.1- Caracterización de la mejor combinación...............................................................51

3.3.2- Vida de anaquel.....................................................................................................54

Palabras clave: kefir, S. cerevisiae sub boulardii, bacterias ácido-lácticas

Para que un microorganismo pueda ejercer su efecto probiótico, debe atravesar

Uno de los productos en los que se pueden emplear estos microorganismos

Se han elaborado numerosos derivados lácteos con la inclusión de bacterias

Desarrollar un kéfir de leche de buena viabilidad y aceptabilidad con

Para cumplimentar este objetivo se establecieron los siguientes objetivos

• Caracterizar las cepas Saccharomyces cerevisiae sub boulardii del banco

• Valorar la capacidad antagónica de Saccharomyces cerevisiae sub

• Elegir la mejor combinación de L. casei-Saccharomyces cerevisiae sub

• Determinar las características físico-químicas, microbiológicas,

1.2- Microorganismos usados como probióticos

Universidad de La Habana : Instituto de Farmacia y Alimentos, Dpto. Alimentos, 2013

Entre las bacterias probióticas más comúnmente utilizadas mundialmente en las

Entre los requisitos exigibles a los microorganismos probióticos se encuentran: ser

De hecho, muchos son incapaces de colonizar el intestino, ni siquiera

Universidad de La Habana : Instituto de Farmacia y Alimentos, Dpto. Alimentos, 2013

Para los microorganismos que sobreviven las condiciones medioambientales del