Cromatografía en columna

Las separaciones en cromatografía por columna pueden realizarse por reparto, adsorción o
intercambio iónico. Puede usarse cualquier medio adsorbente siendo los más generales son la
celulosa, gel de sílice, alúmina, oxido de magnesio, oxido de calcio y carbón activo (para
separaciones por adsorción y de intercambio iónico). En todos los casos solo puede obtenerse
óptimos resultados si se tiene cuidado en la selección del medio. El estado físico del adsorbente ha
de ser de tal manera que permite el empaquetamiento uniforme de la columna y el flujo libre de
disolventes a través de ella.

Llenado de columna

Las columnas cromatografías puede adquirirse en una gran variedad de tipos y tamaños, e incluso
muchas veces puede construirse con materiales sencillos de laboratorio.

El primer paso en el montaje de la columna cromatografíca es colocarse fija en posición vertical. A

continuación se pone en el fondo de la columna un pequeño disco de porcelana con varios
orificios (si es posible) y encima de este un poco de lana de vidrio. Este dispositivo retiene el
material solido de la columna, mientras que el líquido eluyente puede circular libremente.

El adsorbente puede introducirse en seco, pero lo más frecuente es agregarlo en forma de una
papilla con el eluyente. Antes de introducir el adsorbente se agrega en el interior de la columna un
poco de disolvente puro (de 2 a 4cm por encima de la lana de vidrio) y se elimina el aire que
puede permanecer retenido en las paredes, agitando por medio de una varilla larga de vidrio.

La papilla formada por el adsorbente y el disolvente se agrega lentamente en porciones, lo que

permite que se pose el adsorbente por la fuerza de gravedad, hasta alcanzar la altura deseada. Es
recomendable el golpear la columna durante el llenado con un tubo de goma para favorecer la
formación del lecho adsorbente. Finalmente se abre la llave inferior de la columna para que salga
el exceso de disolvente contenido. La altura del disolvente no debe de exceder de 2 a 5mm sobre
el sólido. Una vez realizado todo esto, la columna esta lista para introducir la muestra que se
desea separar.

Velocidad de flujo

Las velocidades de flujo dependen de muchos factores cuando menos sea el tamaño de las
partículas del adsorbente menor será la velocidad con la que el disolvente o la solución pasaran a
través de la columna. Por lo tanto el adsorbente no debe ser ni de grano muy grueso ni muy fino,
el diámetro medio de las partículas debe ser de unas 8-12 micras.

La aplicación de una succión suave o de cierta presión puede también acelerar la velocidad del
solvente a través de la columna.
La velocidad de separación de los componentes de una mezcla en una columna depende de la
velocidad de flujo del solvente se mantiene constante conservando el solvente a nivel constante
arriba de la superficie de la columna.

Tipos de elución

Elución: Proceso mediante el cual un solvente fluye a través de una columna de adsorbente,
produciendo separación de los componentes de la mezcla. El solvente que aparece en la parte
inferior de la columna de llama eluido y el solvente que pasa dentro de la columna es el eluyente.

Simple: La composición del eluyente no varía, no tiene que ser el solvente original usado para
empacar la columna, pero no debe ser muy diferente para provocar el enjuntamiento de las
cuentas de resinas de intercambio iónico.

Fraccionada: Se usa una mezcla de solventes o el solvente se cambia por completo. (Polaridad
diferente).

Por gradientes: El solvente se modifica gradualmente. Generalmente produce bandas más

concentradas que la elusión fraccionada o simple. Un gradiente lineal puede obtenerse usando un
dispositivo con cabeza de sifón, etc. En este caso se debe agitar el solvente de la cámara unida
directamente a la columna, con lo que se asegura una mezcla constante y uniforme, y con ellos un
gradiente lineal.

Análisis frontal: Únicamente se realiza en la cromatografía por adsorción. Aquí nunca ocurre una
separación completa, en lugar de usar un solvente como eluyente, la propia mezcla se agrega
continuamente en la columna hasta que esta se satura, la técnica es útil para determinar el
número de componentes que hay en una mezcla y la presencia de huellas de impureza en
sustancias por otra partes puras.

Elución y recolección de fracciones

Cuando la muestra aplicada a la columna es coloreada se observa fácilmente el proceso de la

separación, pero si las sustancias son incoloras se emplean dos procedimientos.

Eluir y secar de la columna el cuerpo del adsorbente, con mucho cuidado para evitar que se
desmorone, ya que el disolvente se ha evaporado de la columna se corta esta en rodajas, se extrae
con disolvente cada rodaja y se analiza el compuesto (extracto). Antes de cortar la columna, si los
compuestos no son coloreados se aprieta contra ellos una tira de papel para que adsorba un poco
de disolvente. El papel una vez seco se pulveriza con un revelador que indica la posición de cada
uno de los compuestos, el papel se coloca de nuevo al lado de la columna y así sabemos que
componente contiene cada sección de la columna.

Para un numero grande de fracciones se usa un colector automático de fracciones (disco en el que
se coloca una serie de tubos, el disco gira). En el contador de gotas (aparato), las gotas del
eluyente pasan a través de un rayo de luz que activa una célula fotoeléctrica. El aparato puede
ajustarse de tal manera que pase un número fijo de gotas antes del cambio de tubo. Los
contadores de gotas son apropiados para recoger pequeñas fracciones.

Adsorción: Es la retención de una especie química por parte de los puntos activos de la superficie
de un sólido quedando delimitado el fenómeno a la superficie que separa las fases o superficie
interfacial.

Absorción: Es la retención de una especie química por parte de una masa, y debido a la tendencia
que esta tiene a formar mezcla con la primera, absorción pura o a reaccionar químicamente con la
misma, absorción con reacción química, considerando ambas como un fenómeno másico y no
superficial.

Fase estacionaria.

Consiste en partículas generalmente sólidas, pequeñas y con una superficie microporosa de forma
que presenta un amplio desarrollo superficial. Puede estar empaquetada en forma de columna o
extendida en forma de capa. En ocasiones es necesario un tratamiento químico de la fase
estacionario para conseguir unas partículas de tamaño y poro adecuado.

Fase móvil.

Puede ser un líquido o un gas, y su función es transportar a los componentes de la mezcla a través
del sistema cromatografico.

Grado de resolución

En el parámetro que expresa el grado de separación que se puede obtener en un sistema

cromatografico para dos componentes dados. Relaciona la capacidad separadora de un sistema
cromatografico para dos componentes.

𝑡𝑅𝐸−𝑡𝑅𝐴  Rs=resolución
Rs=  tRA y tRB = tiempos de rotación de
1/2(𝜎𝐴+𝜎𝐵) los componentes A y B.
 𝜎𝐴 𝑦 𝜎𝐵 son las anchuras de los
picos del cromatograma

Coeficiente de partición o de reparto de un componente (k)

Se define como el cociente entre la concentración de componente presente en la fase estacionaria

y la concentración de componente presente en la fase móvil:

𝐶𝑠
K=
𝐶𝑚 Cs
K representa la m de la gráfica Cs/Cm

Cm
Objetivos

Realizar procesos de deshidratación, extracción y separación de diferentes pigmentos del

jitomate, mediante técnicas cromatografías que permitan identificar los colores presentes en
estas.

Construir la columna, apoyándonos de la investigación previa de la cromatografía en columna.

Separar por medio de cromatografía en columna los pigmentos de jitomate.

Hipótesis

Si al haber realizado la cromatografía de capa fina obtuvimos los pigmentos generados por el
jitomate, entonces con ayuda de la cromatografía de columna podremos observar la separación
de los componentes del extracto de nuestra muestra

Crromatografia en columna

Se hace la preparacion de la columna

Se agrega la muestra en la columna

Se recoge cada una de las fases en

diferentes francos (Matraz
Erlenmeyer)

Se comprueba que en la bureta el

pigmento que incolor.
Metodología

Columna

Se coloca en una bureta una “galleta” de algodón, este no deberá tapar a la bureta. Luego se le
agregara 1cm de NaCl a la bureta.

Se agregan 20ml de eluato ( ) y 6g de gel sílice a la bureta se vuelve agregar arena o NaCl,
1cm. Se deja caer el disolvente en un matraz Erlenmeyer, hasta tener aprox. 2mm de disolvente.

Se agrega el disolvente con ayuda de una pipeta

Se abre la llave hasta que baje el pigmento, recordando no dejar secar la columna. Se rellena la
columna con el eluato y se recoge el eluato o mejor dicho, la fracción 1 en un matraz Erlenmeyer.

Se vuelve abrir la llave de la bureta y se recoge la fracción 2. Cuando el pigmento haya bajado se
agregan aprox. 60 ml de otro eluyente para ayudar a la fase móvil.

Al agregar el otro eluyente se recoge la fracción 3en otro matraz. Cuando el pigmento se
encuentre cerca de la “galleta”se recoge otra fracción, la 4 y se continua hasta que el eluato sea
incoloro.