METODOS DE CULTIVO EN EXUDADO FARINGEO Y NASAL

I. .Introducción

Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van, desde azúcares simples
hasta sustancias complejas como la sangre. Para aislar o purificar una especie
bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra
en un medio de cultivo sólido donde las células que se multiplican no cambian de
localización; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por
escisión binaria una colonia macroscópica compuesta por decenas de millones de
células similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un
nuevo medio crecerá como cultivo puro de un solo tipo de bacteria.

Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfológicamente que es imposible

diferenciarlas sólo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo
de bacteria, se estudian sus características bioquímicas sembrándolas en medios de
cultivo especiales. Así, algunos medios contienen un producto que inhibe el crecimiento
de la mayoría de las especies bacterianas, pero no la de un tipo que deseamos
averiguar si está presente.

Otras veces el medio de cultivo contiene determinados azúcares especiales que sólo
pueden utilizar algunas bacterias. En algunos medios se añaden indicadores de pH
que cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se
generan catabolitos ácidos. Si las bacterias son capaces de producir fermentación,
generan gases que pueden ser apreciados cuando el cultivo se realiza en un tubo
cerrado. Con otros medios de cultivo se identifica si las bacterias producen
determinadas enzimas que digieren los nutrientes: así, algunas bacterias con enzimas
hemolíticas (capaces de romper los glóbulos rojos) producen hemólisis y cambios
apreciables macroscópicamente en las placas de agar-sangre. Los diferentes medios y
técnicas de cultivo son esenciales en el laboratorio de microbiología de un hospital,
pues sirven para identificar las bacterias causantes de las enfermedades infecciosas y
los antibióticos a los que son sensibles esas bacterias .

1.1 Métodos de cultivos

En un primer momento, el método estándar utilizado para las pruebas in vitro fue el
de dilución en caldo, que proporcionaba un resultado cuantitativo. Actualmente
existen varios métodos que se utilizan para llevar a cabo los estudios de sensibilidad
a los antibióticos y todos ellos se realizan bajo condiciones entandarizadas por
organismos internacionales.

Dilución en caldo

Se colocan concentraciones decrecientes del agente antimicrobiano, generalmente

diluciones 1:2, en tubos con un caldo de cultivo que mantiene el desarrollo del
microorganismo. Los antibióticos se preparan en "soluciones madre" concentradas y
luego se diluyen en caldo hasta obtener las concentraciones apropiadas.

Un tubo de caldo se mantiene sin inocular como control negativo de crecimiento.

Después de un periodo de incubación adecuada se observa la turbidez de los tubos
que indica el desarrollo bacteriano. El microorganismo crecerá en el tubo control y
en todos los que no contengan suficiente antibiótico que sea capaz de inhibir su
desarrollo. La concentración de antibiótico que presente ausencia de crecimiento es
la Concentración Mínima Inhibitoria.

Para medir la CMB se debe realizar la prueba de actividad bactericida, que emplea el
mismo sistema de dilución en caldo que para medir la sensibilidad.

A partir de la CMI, se siembra una cantidad conocida de inóculo de cada uno de los
tubos de caldo que no tienen turbidez en placas de agar, y el número de colonias
que crece en estos subcultivos, después de incubar durante la noche, se compara
con el número de UFC/ml del cultivo original. La mínima concentración del agente
antibacteriano que permite sobrevivir a menos de 0,1 % del inóculo original se
denomina concentración bactericida mínima (CBM).

Difusión en agar

Este método incorpora el antimicrobiano a discos de papel de filtro. Su introducción

permitió agilizar la determinación de la sensibilidad de las cepas bacterianas frente
a un número importante de antimicrobianos de forma simultanea. El empleo de los
discos de papel de filtro para las pruebas de sensibilidad está estandarizado y se
correlaciona con las CMIs. Durante muchos años, y a pesar de ser una técnica
puramente cualitativa, el método de difusión por disco (o método Kirby-Bauer), en
función sobre todo de su comodidad, economía y fiabilidad, ha sido uno de los más
utilizados en los laboratorios.

El microorganismo a investigar se inocula en una o varias placas de agar y sobre su

superficie se disponen los discos correspondientes a varios antibióticos. Se incuban
las placas durante 16-24 horas y se estudia el crecimiento en ellas. Se valora el
diámetro de la zona de inhibición que se forma alrededor de cada disco y se
compara con las referencias oportunas publicadas por la NCCLS. De esta manera se
sabe si el microorganismo es Sensible, Intermedio o Resistente a cada uno de los
antibióticos.

Método de E-test
Es un método más reciente, es una combinación de características de los métodos
anteriores. Se trata de una técnica cuantitativa en placa que permite obtener una
lectura directa de CMI en µg/ml, ya que se emplean tiras plásticas impregnadas en
concentraciones crecientes de antibiótico.

El microorganismo se inocula en una placa y sobre ella se deposita la tira del

antibiótico (o antibióticos) a ensayar. Se incuba durante 16-24 horas a 35ºC y se
valora la zona de inhibición alrededor de cada tira. La CMI se lee directamente
observando el punto más bajo de la elipse que presente el crecimiento

Microorganismos que se aíslan con mayor frecuencia en la faringe de personas sanas

Streptococus beta hemolyticus del tipo A.

Streptococus alfa hemolítico.
Branhamella catarhalis.
Neisserias.
Staphylococcus epidermidis.
Staphylococcus aureus.
Haemophylus haemolyticus.
Haemophylus influenzae.
Diplococos pneumoniae.
Bacilos difteroides.
Bacilos coliformes (Gram -).
Levaduras (Cándida albicans). +

Debe tenerse presente que la importancia de los microorganismos como responsables de

una infección está relacionada con su abundancia en el exudado que se estudia.

II. Objetivos

II.1Objetivos Generales

 Familiarizar al participante con los términos de medios de cultivo.

 Conocer como preparar y diferenciar los medios de cultivo.
 Conocer las técnicas de esterilización de los medios de cultivo.

2.2.- Objetivos Especificos

• Identificación de los microorganismos causantes de las infecciones respiratorias

más comunes de tipo bacteriano mediante el empleo de la técnica de laboratorio
conocida como exudado faríngeo.

III. Materiales y métodos

3.1 Materiales
Hisopos de algodón estériles
Asa bacteriológica
Mechero de Bunsen
Placa con Agar sangre
Placa con Agar SS
Placa con Agar McConkey

3.2 Métodos

Usar dos hisopos estériles y pedir al paciente que abra la boca.

Deprimir la lengua con un baja lenguas estéril.
Juntando ambos hisopos, proceder a la toma de muestra, realizando un raspado suave de
cualquier área que manifieste signos de inflamación, exudados o úlceras procurando no
tocar la lengua, labios ni los otros anexos de la cavidad bucal del paciente.
Con uno de los hisopos, realizar un frotis y proceder a teñirlo con la técnica de Gram.
Con el otro hisopo, realizar la descarga del inóculo en los diferentes medios de cultivo.
Con ayuda de un asa bacteriológica, realizar la distribución del inóculo empleando la
técnica de estría cruzada.

Incubar los diferentes medios por un periodo comprendido entre 24 y 48 horas a 37°C.
Es importante que las placas de agar sangre se observen a las 24 horas para observar los
patrones de hemólisis.
Reportar la morfología colonial y guardar los cultivos en refrigeración para la siguiente
sesión.

Tinción de Gram
1.- Se hace un frotis delgado del material a estudiar y se deja secar al aire.
2.- Se fija la preparación pasándola un par de veces a través de la flama del mechero. De esta
forma se evita que sea lavada durante la tinción.
3.- Cubrir la superficie del frotis con solución de cristal violeta por un lapso de un minuto.
4.- Enjuagar con agua destilada.
5.- Cubrir la superficie del frotis con la solución de yodo de Gram, dejando que esta actué por un
lapso de un minuto.
6.- Enjuagar con agua destilada. 8.- Enjuagar con agua destilada.
9.- Cubrir el frotis con la solución de safranina por 15 segundos.
10.- Enjuagar con agua destilada.
11.- Secar al aire.
12.- Observar al microscopio a 40x y 100x.

VI.- RESULTADO

 Experimento 1AGAR SANGRE

|
  Experimento 2 AGAR POLIVITEX (chocolate):

V.- CONCLUSIONES

El agar es utiliza para muestras sólidas.

Los medios químicamente definidos se preparan añadiendo al agua destilada

cantidades precisas de compuestos orgánicos o inorgánicos altamente purificados.

Los diferentes medios y técnicas de cultivo son esenciales en el laboratorio de

microbiología pues sirven para identificar las bacterias causantes de las enfermedades
infecciosas y los antibióticos a los que son sensibles esas bacterias.

La mayoría de las bacterias se desarrolla en un medio de cultivo básico que

contiene agua extracto de carne y pepsina.

BIBLIOGRAFÍA

http://www.danival.org/notasmicro/medioscult/_madre_medios.html

http://www.mailxmail.com/curso-analisis-clinicos/medios-cultivo

Beishir, L. “Microbiology in practice. A self-instructional laboratory course”.5ª Ed.

Harper Collins Pub. Inc., 1991
IDENTIFICACION DE ESTREPTOCOCOS Y NEUMOCOCOS EN EL APARATO
RESPIRATORIO

I. Introducción

Las infecciones respiratorias agudas tienen una incidencia muy elevada en todas las
edades, constituyen el principal motivo de consulta en todos los países y en todos los
estratos socioeconómicos. Entre las bacterias que causan infecciones respiratorias
agudas de forma primaria, se reconoce al género Streptoccocus, en especial al grupo A
como el más frecuente en rinofaringitis y faringoamigdalitis purulenta.
Como género, estos microorganismos, se caracterizan por tener una forma redondeada,
que oscila entre 0.5 a 1 micra de diámetro, se pueden encontrar como cocos aislados, en
pares o formando cadenas, se distinguen por ser anaerobios facultativos y catalasa
negativos1.
La gran mayoría de los estreptococos, se distinguen por la producción de una gran
variedad de toxinas y enzimas extracelulares, siendo un rasgo distintivo la producción de
hemolisinas con las que efectúan reacciones hemolíticas (hemólisis en cultivos
enriquecidos con sangre.
Algunos microorganismos como Streptococcus pneumoniae pueden presentar cápsulas
polisacaridas que le confieren un aspecto mucoide a las colonias que se desarrollan sobre
el agar, y son lisados con facilidad por agentes tensoactivos, por ejemplo, las sales
biliares.
Parte de las características antes mencionadas pueden emplearse como fundamentos para
una clasificación; sin embargo la agrupación de las diferentes especies en los grupos
actualmente conocidos, quien emplea antígenos específicos de la pared celular como
base para dicha clasificación.
 II. Objetivos

2.1Objetivos generales

• Conocer de manera general las características del género Streptococcus y diferenciar

entre las especies pyogenes y pneumoniae a través de los patrones de hemólisis
obtenidos en cultivos en agar sangre y el empleo de otras pruebas como la identificación
de cápsula.

2.2Objetivos Específicos

III. Material y Métodos

3.1 Material
• Asa bacteriológica
• Mechero
• Microscopio
• Juego de colorante para Gram
• Tinta china
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• 2 placas de agar sangre
• 2 tubos de glucosa + rojo fenol
• Cepa de Streptococcus pyogenes
• Cepa de Streptococcus pneumoniae
• 1 tubo con desoxicolato de sodio
• Discos de optoquina.

IV. Metodos

1. De la cepa Streptococcus pyogenes, tomar una asada y sembrar en el medio de

cultivo Agar sangre con técnica de aislamiento. Seguir el mismo procedimiento para la
cepa de Streptococcus pneumoniae.

2. Tras la realización de la siembra, colocar un disco impregnado con optoquina en

cada caja para observar la resistencia o sensibilidad de algunas colonias ante el reactivo.

3. Tomar una asada de la cepa de Streptococcus pyogenes y sembrar por agitación

en el medio líquido que contiene lactosa con rojo de fenol.

4. Tomar una asada de la cepa de Streptococcus pyogenes y sembrar por agitación

en el medio líquido que contiene sorbitol con rojo de fenol.
5. Tomar una asada de la cepa de Streptococcus pyogenes y sembrar por agitación
en el medio líquido que contiene glucosa con rojo de fenol.

6. Seguir el mismo procedimiento con la cepa de Streptococcus pneumoniae.

7. Tomar una asada de la cepa de S. pneumoniae e inocular el tubo con desoxicolato

sódico.

8. Incubar a 37° durante 24 hrs.

a) Realizar frotis y tinción de Gram para cada cepa.

b) Realizar tinción de tinta china para Streptococcus pneumoniae.

Técnica de tinción con tinta china

• Colocar una gota de agua en un portaobjetos limpio.

• Hacer una suspensión con una asada de la cepa de Streptoccocus pneumoniae.
• Colocar a un lado una gota pequeña de tinta china.
• Homogeneizar con el asa y colocar encima un cubre objetos.
•
Observar al microscopio a 40x.
Las cápsulas aparecen como zonas claras entre el contorno de las células y el fondo se
observa oscuro.