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DEPARTAMNENTO SALUD AMBIENTAL

Cepas: Material de referencia,


manejo y aplicaciones en el área de
microbiología

Fabiola Rojas C.
Microbiología Metrológica
Sección Metrología Ambiental y Alimentos

Instituto de Salud Pública de Chile


DEPARTAMNENTO SALUD AMBIENTAL
Algo de historia ……

Microbiología

• Ciencia que estudia los MO, su biología, ecología y relaciones.

• Mucho antes que se descubriera el mundo de los MO , el hombre ya intuía la


existencia de «animales» o «miasmas» y sus efectos beneficiosos o
devastadores.

• Los antiguos hebreos tomaban medidas profilácticas para evitar la propagación


de enfermedades que incluían por ejemplo aislamiento, evitar comer ciertos
alimentos, costumbres higiénico-religiosas .

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Algo de historia ……

Microbiología

• Fue sólo hasta 1676 cuando Leeuwanhoek comerciante que dedicaba parte de
su tiempo para pulir lentes, desarrollo un microscopio primitivo con el cual logro
observar y describir unas pequeñas estructuras que llamó animalucos, lo cual en
ese momento creó un conflicto entre los partidarios de la generación espontánea
y los partidarios de el origen de la vida a partir de organismos vivos.

• A fines del siglo XIX tuvo su desarrollo con el avance de conocimientos y


desarrollo de técnicas microscópicas.

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Algo de historia ……

Microbiología

• Con el transcurrir del tiempo y con las investigaciones de Redi, Spallauzani,


Lavoisier entre otros, hasta llegar a 1861 en donde Louis Pasteur logró
demostrar que en el aire había estructuras similares a las encontradas en el
material en descomposición.

• La microbiología en la actualidad es una ciencia especializada y exacta que con


el tiempo se ha hecho indispensable para la industria y para la calidad de
nuestra vida.

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Algo de historia ……

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Algo de historia ……

Historia de la microbiología:

• Era de la Microbiología General y Médica


(1680-1940)

• Era de la Microbiología General y Biología


Molecular (1941-1985)

• Era de la Microbiología Molecular, Genómica y


Proteómica (1986- )

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Relación de la Microbiología con otras ciencias
Química Biología Matemáticas

Físico química
Física

Farmacia Medicina

Microbiología
Genética Bioquímica

Biología molecular Ecología

Biotecnología Alimentos

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Actualmente

Microbiología:

Los microorganismos han sido los primeros en aparecer en la evolución, y


constituyen seguramente la mayor parte de la biomasa de nuestro
planeta.

Dentro de los organismos de estudio se encuentran las bacterias, virus,


protozoos, hongos microscópicos y también se ha incorporado el estudio de
los priones, que no son microorganismos, sino que proteínas que causan
diversas patologías y que, por lo tanto, son motivo de estudio.

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Actualmente

Microbiología:

Actualmente se disponen de herramientas tecnológicas para la investigación y la


búsqueda de información que permita integrar las áreas del conocimiento referidas a la
identificación, autenticación, perfil de comportamiento y estudio de los factores internos
y externos de los MO.

Globalmente es aceptado que materiales de referencia son necesarios


para asegurar la confiabilidad de los resultados

Disponer de procedimientos para la selección, adquisición, recepción, registro,


almacenamiento y utilización de los materiales de referencia, del mismo modo que
para el resto de reactivos y materiales consumibles utilizados en los ensayos y
calibraciones.

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Características MO

Patogenicidad
(genera
enfermedad)

Invasión Contagiosidad
(cap. de (capacidad
diseminar ) propagación)
Agente
(cepa)

Virulencia
Infectividad
(cap. de
(proporción de
provocar daño
expuestos)
o muerte)

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Aplicaciones

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Aplicaciones Moleculares

Estudios
Factores de genotípicos
virulencia

Desarrollo
Genómica Secuenciación
marcadores
Comparativa
moleculares

ADN/Genoma Toxinotipado

Estudio gen Estudio vía Ribotipificación


funcional metabólica

Origen y
evolución de
patógenos

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Terminología

MATERIAL DE REFERENCIA:

• Material o substancia, en la cual uno o más valores de sus propiedades


especificadas son suficientemente estables y homogéneas y están
claramente establecidos como para poder ser utilizados en la calibración,
evaluación de un método de medida o la asignación de valores a
materiales.

[Guía ISO 30 Términos y definiciones utilizados en relación con los materiales de referencia

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Terminología

MATERIAL DE REFERENCIA CERTIFICADO:

Caracterizado por un procedimiento metrológicamente válido para una o


más propiedades específicas, acompañado de un certificado que proporciona
el valor de la propiedad especificada, su incertidumbre asociada, y una
declaración de trazabilidad metrológica.

[Guía ISO 30 Términos y definiciones utilizados en relación con los materiales de referencia].

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NOTAS

La trazabilidad puede estar relacionada


Cuando esto no se puede lograr, el
con determinadas referencias de
productor material de referencia debe
estándares de medición (generalmente
proporcionar evidencia satisfactoria de la
estándares de medidas nacionales o
correlación de los resultados con otros
internacionales) a través de una cadena
valores indicados, ya sea por la evaluación
ininterrumpida de comparaciones, con
exhaustiva del proceso de medición o por la
todas las incertidumbres declaradas, el
productor de materiales de referencia y correlación con materiales de referencia

sus colaboradores deberán proporcionar certificados nacionales o internacionales

la evidencia documental de la trazabilidad conocidos y aceptados.


de estas las mediciones.

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Terminología

Cepa: células descienden de un único aislamiento de un cultivo puro, por lo general a


partir de una sola colonia, aunque no necesariamente de una sola célula (es decir, no
necesariamente un clon).

Caracterización: el proceso de someter


una cepa a una serie pruebas
Autenticación: proceso de comparación
morfológicas, fisiológicas, moleculares y /
de las características de una cepa para la
otras. La datos derivados se pueden
descripción de la especie para determinar o
utilizar para describir la cepa y
verificar la identidad.
objetivamente compararla con otras
cepas.

Cultivo: población de células en un lugar y tiempo establecido.

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Terminología
Caracterización
Identificación Fenotípica
Identificación Molecular

Identificación Fenotípica macro-microscópica :


Morfología, fisiología y bioquímica
tamaño, pigmentación, aspecto, comportamiento tinciones,
características desarrollo ( O2, temperatura, tiempo), actividad
frente AB, etc.

Identificación Molecular:
Análisis 16S rRNA ( PCR)
Secuenciación ADN, (técnicas químicas, enzimáticas, masivas)
whole genome, Hierarchical shotgun sequencing, (ambas por
fragmentación aleatoria), next generation sequencing (NGS),

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Terminología

Taxonomía (Nomenclatura de clasificación)


- Fenética (fenotipo)
- Numérica (agrupación por semejanza)
- Filogenética ( basado en relaciones evolutivas)

Características utilizadas en Taxonomía


1.- Clásica: Morfología ,Fisiología, Ecología, Análisis genético ( cap.
Transferencia)
2.-Moleculares: Secuencia aa, Movilidad electroforética,
Hibridación AN , Comparación AN, Secuenciación AN

Principales taxones
Dominio, Reino, Filo o división, Clase, Orden, Familia, Género,
Especia, Morfovar, Biovar, Serovar, Fagovar, Patovar (propiedades)

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Una nueva organización con nuevas
géneros y especies, han dado lugar a
una reclasificación taxonómica
abarcando la diversidad total a partir
de secuenciación genómica.

La imagen muestra una representación


artística del nuevo árbol filogenético.

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Terminología

Cultivo maestro: es el
obtenido directamente
Cultivo puro: cultivo a partir
del cultivo de colección y
de un solo organismo.
sirve para preparar los
cultivos de reservas
usados internamente.

Cepa control de calidad: una


Pasaje: transferencia de organismos
cepa previamente determinada
a partir de un cultivo viable a un
para cumplir el criterio de
medio fresco con crecimiento del MO.
desempeño de una prueba en
(Subcultivo).
particular.
Cultivos en crecimiento activo están
sujetos a cambios genéticos, pérdida
accidental, contaminación, error humano al
transferir y etiquetar, selección de líneas
mutantes.

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Terminología

Cepas de referencia: Microorganismos obtenido de una colección


nacional o internacional reconocida.

Cepa de reserva: Cepas Cepas de trabajo:


obtenidas a partir del cultivo Subcultivos de
de una cepa de referencia microorganismos obtenidos a
preparada y conservada por un partir de las cepas de reserva
laboratorio. para ser utilizados en los
ensayos que lo precisen.

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Cepa de ESQUEMA DE TRABAJO
referencia

Reconstitución

Pasaje

Cultivo Subcultivo Pureza- Autenticidad


maestro viabilidad

Caracterización

Cepa reserva

Pasaje

Cepa de
trabajo
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Cepas de Referencia
Adquisición cepas de referencia:

•Obtención directa a partir de una colección nacional o


internacional

NOTA: Los proveedores comerciales certificados por ISO 9001 comercializan


repiques de cepas de referencia adquiridas en una colección reconocida,
generalmente del 3er o 4° repique, las que sólo se pueden utilizar como cepas de
trabajo.

Las cepas de referencia pueden incluir:


• Cepas positivas robustas con características típicas,
• cepas positivas con crecimiento débil,
• cepas bioquímicamente no reactivas (Ej.: aquellas que
muestran diferentes reacciones de fermentación o
fluorescencia) y
• cepas completamente inhibidas.

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Cepas de Referencia.

Las cepas de referencia pueden obtenerse de


organismos de colección como por ejemplo:

CAB International Mycological American Type Culture


Institute (CMICC) Collection (ATCC).
(Colección Americana de
cultivos tipo)

National Collection of National Collection of Type


Pathogenic Fungi (NCPF) Cultures (NCTC) .
Colección Nacional de Colección Nacional de
Hongos Patógenos cultivos tipo

National Collection of Food


Colección española de Bacteria (NCFB).Colección
cultivos tipo (CECT) Nacional de Bacterias
alimentarias

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Lista de colecciones

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Lista de colecciones

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World Federation for Culture
Collection - WFCC
Su principal objetivo es la promoción y desarrollo de colecciones de cultivos de microorganismos y líneas
celulares.

Las actividades fundamentales siguen siendo la continuidad y apoyo a las colecciones existentes, así como
la asistencia y asesoramiento para ayudar a establecer nuevas colecciones. Los miembros de WFCC
constituyen una única red global para la preservación ex situ de la diversidad microbiana que sostiene la
vida en la tierra.

WFCC tiene una preocupación constante en todos los aspectos referidos a la actividad de las colecciones de
cultivos, en particular, a la estimulación de nuevas iniciativas y al mejoramiento de los estándares de
calidad de los servicios científicos que se proveen a la comunidad internacional.

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La WDCM dispone de una codificación eficiente de las cepas definiendo un acrónimo de la
colección y un número WFCC que le permite dar a cada cultivo de la colección una Identificación
Global Única (Globally Unique Identifiers – GUID), combinando el acrónimo con su propio número
interno.

El trabajo pionero de WDCM permite un registro apropiado y un manejo de la documentación


relacionada con las cepas.

Las colecciones
Instituto deberían
de Salud Pública de Chileusar este sistema para ser parte de la red WDCM y estar conectados con 28
la comunidad científica internacional.
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World Data Centre for Microorganisms -WDCM

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World Data Centre for Microorganisms -WDCM
El proceso está diseñado de modo que los organismos experimentan el número mínimo de
pasajes posible, para reducir la divergencia genética de la cepa.

Identificación: WFCC tienen la


Preservación: para reducir al mínimo los riegos responsabilidad de proporcionar recursos
de pérdida de la cepa, la preservación la con identidades precisas como materiales
realizan en al menos por dos métodos de crio- de referencia si ofrecen un servicio
preservación (liofilización , nitrógeno líquido)
por lo menos en duplicado para ser
público y deben hacer todo lo posible
almacenadas en lugares diferentes ( para no para asegurar que los organismos que
perder la cepa en catástrofes naturales). suministran son auténticos.

Autenticación: se basa principalmente en una


caracterización polifásica (fenotípica y
genotípica) en base a las propiedades del MO.
Las pruebas bioquímicas fueron y siguen
siendo fundamentales para autenticar
muchas propiedades de los MO.
La caracterización genotípica se basa en
secuenciación rADN (SSU 16S). Métodos
altamente específicos y sensibles
independiente del estado fisiológico o de
desarrollo del MO.

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Cepas de Referencia

Un proveedor de material de referencia MR y MRC debe brindar información a


través de un certificado que acompañe al material. Y además deberá demostrar su
competencia en la producción del MR.

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Cepas de Referencia

• Características de MR

Homogéneo

Estable

Con valores asignados a algunas


de sus propiedades

Con incertidumbre asignada a


sus valores
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Pureza: Condición de ser libre y exento de toda mezcla

Homogeneidad: Condición de tener composición y estructura


uniforme respecto de uno o más de sus caracteres dentro de los
límites establecidos.

Estabilidad de cultivos de referencia: Características de un cultivo de


mantener, por un período de tiempo establecido, un valor declarado de sus
propiedades dentro de los limites especificados.

Trazabilidad de cultivos de referencia: se considera que un cultivo de


referencia es trazable si cumple con los requisitos taxonómicos definidos para
esa especie microbiana y con aquellas características propias de esa cepa, de
forma tal que los resultados de estas evaluaciones puedan ser reproducidos en
otros laboratorios.
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Qué debe contener un certificado?
Nombre y dirección del organismo de certificación

• Título del documento.

• Condiciones del certificado (provisorio)

• Nombre del material

• Número de muestra (Nº del lote puntual)

• Características del material

• Descripción del material

• Fecha de certificación

• Disponibilidad de otras formas y tamaño del MR

• Fuente del MR

• Proveedor del MR

• Preparador del MR

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Qué debe contener un certificado?

 Condiciones de Almacenamiento
 Instrucciones para el uso correcto del MR
 Método de preparación del MR
 Determinación de homogeneidad y estabilidad (descripción de los ensayos
realizados)
 Valores obtenidos para una determinada propiedad y sus límites de confianza
 Valores asignados pueden ser generados por un laboratorios o un grupo de
laboratorio

 Incertidumbre

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DEPARTAMNENTO SALUD AMBIENTAL
Colección de cepas
Para su selección:

Es necesario tener en cuenta el propósito al cual será


destinado

1. Identificar las especificaciones requeridas con las de los MRC disponibles


en el mercado.
2. Consultar la información disponible: catálogos de fabricantes, bancos de
datos, publicaciones, recomendaciones
3. Asegurar que el MRC seleccionado está certificado para la medida o
propiedad de interés y no es un valor meramente indicativo, y que su
procedimiento de certificación tiene un nivel de confianza apropiado y está
suficientemente documentado.

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Colección de cepas
Para su selección:

Es necesario tener en cuenta el propósito al cual será


destinado

Validación/ verificación método


QC
Controles ensayos/ análisis (área ambiental, clínica, farmacéutica)
Pruebas confirmativas
Evaluación desempeño medios de cultivo
Estudio comportamiento a AB
Evaluación de procesos de esterilización.

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Colección de cepas

Servicio de colección de cepas

Conservación ex situ del microorganismo

Custodios de los recursos nacionales

Otorgar seguridad , confidencialidad y licencia

Protocolos para una cuidadosa preservación y almacenamiento para


mantener cultivos en forma segura y eficaz.

La utilización de un sistema de reserva de semillas para minimizar


subcultivo

Caracterización completa de cada cepa para establecer la identidad


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Normas de Referencia

ISO Guía 30
Definiciones ISO Guía 31 Contenido
certificado y etiquetas

ISO Guía 35
ISO Guía 34 Requerimientos
Principios generales
generales para la competencia ISO Guía 33 Uso
para estadística y
de los productores MR MRC
certificación

ISO 9000 Gestión ISO 17025


y Calidad

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Principios de MR

Los materiales de referencia y los materiales de referencia certificados son


utilizados para demostrar:

• la exactitud de los resultados,


• calibrar equipos,
• controlar la calidad del laboratorio,
• validar métodos y
• permitir la comparación de métodos.

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Principios de MR

El procedimiento manejo de cepas se fundamenta en:

En la reactivación de los cultivos de referencia certificados (liofilizados


o congelados), a través de la utilización de medios de cultivo
específicos,

Incubación a la temperatura y tiempo establecido para cada


microorganismo,

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Principios de MR

Verificación de la viabilidad, pureza, estabilidad y adicionalmente realizando


pruebas para descripción de las características fenotípicas y genotípicas.

Seguido de preservación a través de los diferentes métodos


disponibles en el laboratorio.

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Cepa de Referencia

Para demostrar la trazabilidad, el laboratorio debe utilizar cepas de referencia de


microorganismos suministrados por una colección nacional o internacional
reconocida.

Las cepas de referencia se reconstituirán y someterán a los controles


de pureza y ensayos bioquímicos que sean necesarios.

Serán subcultivadas una sola vez para obtener las cepas de reserva, de
las que se obtendrán las cepas de trabajo.

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Cepas de Reserva

Las cepas de reserva deben conservarse utilizando:


• una técnica que mantenga las características deseadas de las cepas de referencia
( sin cambio genético).

Por ejemplo:
• liofilización,
• ultra congelación (-70ºC),
• conservación en nitrógeno líquido, etc.

Cuando se descongelan las cepas de reserva no se deben volver a


congelar y reutilizar.

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DEPARTAMNENTO SALUD AMBIENTAL
Cepa de trabajo

Las cepas de trabajo, se conservarán en refrigeración durante un período de


tiempo que asegure la viabilidad del microorganismo.

Las cepas de trabajo no deben ser subcultivadas y no deben


sustituir las cepas de reserva.

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Importante

En la práctica para cumplir con el requisito prevenir mutaciones, deterioro o


alteración de las características típicas de las cepas de el número de repiques a
partir de la cepa de referencia debe ser limitado.

En general es aceptado hasta 5 repiques a partir de la cepa de referencia conforme a las


recomendaciones de la Pharmacopoeia (USP) las cuales han sido estimadas por Amarican Type Culture
Collection (ATCC) y en este contexto ATCC lo hace válido si las cepas son adquiridas directamente a
ATCC.

Por otro lado, Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) recomienda hasta tres subcultivos del
cultivo de reserva y hasta tres subcultivos del cultivo de trabajo, lo que significa obtener hasta 7 pasajes a
partir del cultivo original de la cepa de referencia ATCC.

(Ref. Documento técnico N°6 ATCC)

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Pasaje /Subcultivo

P Cultivo Viable
a
s
Cultivo Viable a
j
e
Pasaje Pasaje

Cultivo Fresco

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Procedimiento por el laboratorio

– Métodos para preservación cepa de reserva :


• Liofilización

Es un proceso de desecación a partir de un estado congelado.

Dentro de los agentes crioprotectores se incluye la leche descremada de


calidad microbiológica (esterilización por vapor fluente) al 10% o 20% p/v).

El producto liofilizado se puede conservar en refrigeración a temperatura


ambiente por años.

Los envases deben estar debidamente identificados con nombre cepa, tipo y
N° de colección, N° de repique, fecha de elaboración cepa reserva, fecha
vencimiento, N° tubo o crioval.
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Procedimiento por el laboratorio
• Congelación a bajas temperaturas

• La congelación es un método de preservación a largo plazo, donde los


microorganismos son resuspendidos en medios con algún agente crioprotector y
son almacenados a temperaturas inferiores a 0°C
• (-20, -40, -70, -80° C ) en congeladores o en tanques de nitrógeno líquido.

Dentro de los agentes crioprotectores se encuentran:

• Glicerol al 20%.
• Caldo cerebro corazón (BHI) con glicerol al 20%.
• Leche descremada al 20%
• Dimetil sulfoxido (DMSO) al 10%.

Puede adicionarse aditivos como el inositol.

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Procedimiento por el laboratorio

• Las temperaturas de congelación deseable a -70°C , -80°C o menores.

A temperaturas de -20°C no es lo ideal pero tal vez es la única forma


posible. Es preferible a -40°C.

Los envases pueden ser el uso de crioval o tubo estéril, sistema Cryobank.

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Procedimiento por el laboratorio

Los envases deben estar debidamente identificados con nombre cepa, tipo y
N° de colección, N° de repique, fecha de elaboración cepa reserva, fecha
vencimiento, N° tubo o crioval.

El producto se puede conservar congelado por


años.

Anotar en registro

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Procedimiento por el laboratorio

–Preservación a Temperatura ambiental

Es una forma de mantener el cultivo generalmente para uso diario. Se


utilizan tubos de cultivo tapa rosca, rotulados y con medio sólido. El cultivo
se ha obtenido por incubación en el tiempo y temperatura apropiados para
el microorganismo procesado.

Por un período más largo de almacenamiento, después de incubar añadir


una capa de aceite mineral o parafina estéril que cubra el cultivo hasta 1,0
cm por encima de la superficie del agar. Sellar bien los tubos.

Realizar controles periódicos de pureza y viabilidad.

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Factores que afectan la viabilidad de la cepa

La viabilidad de las cepas, sometidas a un proceso de


congelación (para su almacenamiento), está determinada por
los siguientes factores:

a) Tipo de cepa: Ejemplo las bacterias Gram positivas resisten


mejor las bajas T° que las Gram negativas.

b) Concentración del MO: determinado por las condiciones del


cultivo.

El cultivo debe estar en las mejores condiciones posibles antes de ser expuesto a
bajas temperaturas.
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Factores que afectan la viabilidad de la cepa
Condiciones necesarias antes de ser expuesto a bajas
temperaturas:

1.- La EDAD DEL CULTIVO puede afectar la capacidad del


microorganismo de sobrevivir.

• Cultivos demasiados jóvenes o demasiado viejos son menos resistentes al


shock térmico.
• Ideal es al final etapa logarítmica principio fase estacionaria (108 ufc/mL, tiene
mayor probabilidad de recuperación).

2. Las CONDICIONES DE DESARROLLO también juegan un papel


importante .

Ejemplo; Las levaduras que crecen aireadas y agitadas tienen mayor resistencia a
la temperatura que aquellas que desarrollan en un medio sólido.

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Recomendaciones

La manipulación y modo de conservación de los cultivos de referencia deben


evitar:

• El deterioro de las cepas
• La contaminación cruzada 
• Mutaciones
• Deterioro o alteración de las características típicas de las cepas.
• Su crecimiento característico debe ser documentado sobre cada medio en el
que se utiliza como cepa control.

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Problemas asociados selección a MR/MRC

• Dificultad de localizar MRC los disponibles y de comunicarse con fabricantes y


distribuidores.

• Su alto costo, lo que limita su aplicación.

• Escasa información por parte de los fabricantes, lo cual dificulta la evaluación de si


un determinado MRC es adecuado a los objetivos.

• El analito requerido no se encuentra certificado en una matriz idéntica o parecida


a la composición del producto o de la muestra.

• Dificultad en disponer de distintos niveles de concentración para evaluar el


procedimiento en todo su rango de aplicación.

• Una incertidumbre inapropiada para evaluar un procedimiento de medida.

• Su trazabilidad.

• Dificultad en su preparación.

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GRACIAS

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