Metodologi Praktikum

Teknik Hematologi

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan adalah sampel darah, larutan hayem, minyak emersi,
giemsa 10%, HCl 0.1 N, aquades, larutan turk, alkohol 70%, dan metil alkohol.
Alat yang digunakan adalah pipet pengencer eritrosit, pipet pengencer leukosit,
kamar hitung, mikroskop, kaca preparat, kertas saring atau tisu, alat penghitung,
tabung kapiler ber-antikoagulan, alat penyumbat tabung kapiler, alat sentrifuge
kecepatan tinggi 10.000-20.000 rpm, alat pembaca mikrohematokrit,
hemoglobinometer yang terdiri atas pipet hemoglobin bertanda 20 mm3, tabung
sahli, dan warna standar, serta pipet tetes.

Prosedur

Penghitungan Jumlah Eritrosit

Pipet pengencer yang bersih diambil lalu darah dihisap ke dalam pipet
hingga batas 0.5. Ujung pipet kemudian dibersihkan dari noda darah
menggunakan kertas saring atau tisu. Setelah pipet dibersihkan, larutan hayem
dihisap hingga mencapai batas 101. Darah dan pengencer dihomogenkan dalam
pipet dengan cara memutar pipet membentuk angka 8 atau dengan membuat
gerakan bolak balik seperempat lingkaran. Setelah homogen, sebagian larutan
dibuang terlebih dahulu sebanyak 3-5 tetes. Kemudian kamar hitung yang bersih
disiapkan lalu kaca penutup diletakkan di atas tanggul kamar hitung. Sampel yang
akan diamati diisikan ke dalam kamar hitung dengan menyentuhkan ujung pipet
pada tepi antara kaca penutup dan kamar hitung hingga dataran terisi penuh.
Setelah kamar hitung terisi, sampel didiamkan beberapa saat terlebih dahulu
kemudian dihitung menggunakan mikroskop.
Penghitungan dilakukan dengan mengamati penyebaran darah pada kamar
hitung terebih dahulu dengan pembesaran rendah. Apabila darah merata,
pembesaran mikroskop diubah lebih tinggi dan penghitungan dimulai.
Penghitungan dilakukan pada lima kotak yang terletak di sentral. Ketentuan dari
penghitungan adalah sel-sel yang menempel pada garis batas atas dan kiri
dihitung, sedangkan sel-sel yang menempel pada garis batas bawah dan kanan
tidak dihitung. Hasil penghitungan kemudian dimasukkan ke dalam rumus:

n = jumlah dari kelima kotak yang dihitung

 Gambar 1. Wilayah penghitungan eritrosit (huruf R)

Penghitungan Nilai Hematokrit

Sampel darah dihisap dengan tabung kapiler, dengan menyentuhkan ujung

tabung pada darah dan mengetuk-ngetuk ujung lainnya dengan telunjuk. Bagian
ujung tabung dikosongkan 1 cm. Ujung lainnya disumbat dengan alat penyumbat
khusus. Tabung diletakkan pada alat sentrifuge dengan bagian yang tidak
tersumbat menghadap pusat sentrifuge. Sentrifugasi dilakukan selama 4-5 menit
dengan kecepatan 10.000 rpm atau selama 2 menit dengan kecepatan 16.000 rpm.
Hasil sentrifugasi dibaca menggunakan micro hematocrit reader.

Penghitungan Kadar Hemoglobin

Metode yang digunakan untuk penghitungan kadar hemoglobin kali ini

adalah metode Sahli. Tabung sahli diisi dengan HCl 0.1 N sampai garis terbawah.
Darah dihisap menggunakan pipet hemoglobin sampai angka 20 kemudian
dimasukkan ke dalam tabung. Darah dan HCl dicampurkan dengan cara dihisap
dan ditiup perlahan-lahan menggunakan pipet. Asam hematin terlihat dengan
adanya perubahan warna menjadi cokelat atau cokelat hitam. Kemudian aquades
diteteskan dengan pipet tetes lalu dikocok hati-hati. Penambahan aquades
dilakukan hingga warna larutan sama dengan warna standar. Kadar hemoglobin
dibaca dengan melihat miniskus cairan pada tabung sahli.

Penghitungan Jumlah Total Leukosit

Pipet pengencer yang bersih diambil lalu darah dihisap ke dalam pipet
hingga batas 0.5. Ujung pipet kemudian dibersihkan dari noda darah
menggunakan kertas saring atau tisu. Setelah pipet dibersihkan, larutan turk
dihisap hingga mencapai batas 11. Darah dan pengencer dihomogenkan dalam
pipet dengan cara memutar pipet membentuk angka 8 atau dengan membuat
gerakan bolak balik seperempat lingkaran. Setelah homogen, sebagian larutan
dibuang terlebih dahulu sebanyak 3-5 tetes. Kemudian kamar hitung yang bersih
disiapkan lalu kaca penutup diletakkan di atas tanggul kamar hitung. Sampel yang
akan diamati diisikan ke dalam kamar hitung dengan menyentuhkan ujung pipet
pada tepi antara kaca penutup dan kamar hitung hingga dataran terisi penuh.
Setelah kamar hitung terisi, sampel didiamkan beberapa saat terlebih dahulu
kemudian dihitung menggunakan mikroskop.
Penghitungan dilakukan dengan mengamati penyebaran darah pada kamar
hitung terebih dahulu dengan pembesaran rendah. Apabila darah merata,
pembesaran mikroskop diubah lebih tinggi dan penghitungan dimulai.
Penghitungan dilakukan pada empat kotak yang terletak di tepi. Ketentuan dari
penghitungan adalah sel-sel yang menempel pada garis batas atas dan kiri
dihitung, sedangkan sel-sel yang menempel pada garis batas bawah dan kanan
tidak dihitung. Hasil penghitungan kemudian dimasukkan ke dalam rumus:

n = jumlah dari keempat kotak yang dihitung

Gambar 2. Wilayah penghitungan leukosit (huruf W)

Pembuatan dan Pewarnaan Preparat Ulas Darah

Kaca preparat dibersihkan terlebih dahulu menggunakan alkohol 70%

sebelum digunakan, kemudian dibersihkan dengan tisu atau lap bersih. Satu tetes
sampel darah (segar maupun ber-antikoagulan) diteteskan pada ujung kaca
preparat yang sudah dibersihkan. Kaca preparat lain ditempatkan di dekat tetesan
darah dengan membentuk sudut 30o sampai 45o, kemudian ditarik ke belakang
hingga menyentuh darah. Darah dibiarkan menyebar pada tepi kaca preparat
terlebih dahulu sebelum kemudian didorong sepanjang permukaan kaca preparat
pertama hingga terbentuk lapisan darah yang tipis dan merata. Preparat kemudian
dibiarkan mengering.
Setelah lapisan darah mengering, preparat dimasukkan ke dalam metil
alkohol selama 3-5 menit. Kemudian preparat diambil dan dikeringkan di udara.
Setelah kering, preparat dimasukkan ke dalam larutan giemsa 10% selama 45-60
menit. Kemudian preparat ulas dicuci dengan aquades mengalir dan dikeringkan
di udara. Pengamatan preparat ulas darah dilakukan menggunakan mikroskop
dengan perbesaran 1000 kali. Minyak emersi diteteskan di atas preparat sebelum
diamati dengan mikroskop.

A. Pemeriksaan Mikroskopis
 1. Pemeriksaan Lemak Netral (undigested fat) dalam feses
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan adalah gelas obyek, gelas penutup dan mikroskop. Bahan
yang digunakan adalah feses, air, alkohol 95% (etanol), dan Sudan III / IV
jenuh.
Cara Kerja
Meletakkan sampel feses (ukuran kira-kira sebesar ½ biji kacang hijau) diatas
gelas objek. Menambahkan 2 tetes air dan diaduk sampai tercampur merata.
Lalu menambahkan 2 tetes alkohol 95% (etanol) dan menambahkan 4 tetes
Sudan III / IV jenuh serta mengaduknya sampai merata. Kemudian menutup
dengan gelas penutup dan mengamati dibawah mikroskop dengan pembesaran
10 x 40 (400 kali). Mengamati terhadap adanya butiran (droplet) yang berwarna
merah orange.

2. Pemeriksaan asam lemak bebas (digested fat) dalam feses

Alat dan Bahan
Alat yang digunakan adalah gelas obyek, gelas penutup, api bunsen dan
mikroskop. Bahan yang digunakan adalah feses, asam asetik glasial dan Sudan
III / IV.
Cara Kerja
Meletakkan sampel feses (ukuran kira-kira sebesar ½ biji kacang hijau) diatas
gelas objek. Menambahkan beberapa tetes asam asetik dan menambahkan
beberapa tetes Sudan III / IV jenuh serta mengaduknya sampai merata.
Kemudian menutup dengan gelas penutup lalu memanaskannya diatas api
sampai mendidih kemudian mengamati dibawah mikroskop dengan pembesaran
10 x 40 (400 kali). Mengamati terhadap adanya butiran (droplet) yang berwarna
merah orange.

3. Pemeriksaan Serabut Otot dan Serat Kasar dalam feses

Alat dan Bahan
Alat yang digunakan adalah gelas obyek, gelas penutup dan mikroskop. Bahan
yang digunakan adalah feses, dan Sol. Lugol’s Iodine.
Cara Kerja
Meletakkan sampel feses (ukuran kira-kira sebesar ½ biji kacang hijau) diatas
gelas objek. Menambahkan 2-3 tetes Sol. Lugol’s Iodine dan menutupnya.
Kemudian mengamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 10 x 40 (400
kali) terhadap adanya serabut otot / granula bahan kasar yang berwarna hitam
kebiruan.

B. Pemeriksaan Aktivitas Tripsin dalam feses

Alat dan Bahan
Alat yang digunakan adalah alat sentrifugasi, tabung reaksi, dan refrigerator.
Bahan yang digunakan antara lain aquades, gelatin 7,5% dan Na 2CO3 5%.
Cara Kerja
Mencampur sebanyak 9 ml aquades dengan feses hingga mencapai volume 10 ml,
kemudian menyentrifugasi (bagian supernatannya yang akan digunakan sebagai
sampel). Menghangatkan sebanyak 2 ml gelatin 7.5% sampai suhu 37 0C
kemudian menambahkan ke dalam gelatin sebanyak 1 ml Na 2CO3 5% dan 1 ml
supernatan (dari 10 ml campuran 9 ml aquades + feses) ke dalam tabung uji /
tabung 1. Setelah itu menyiapkan tabung blanko (tabung 2) yang berisi 2 ml
gelatin 7.5 % + 1 ml Na 2CO3 5% + 1 ml aquades. Lalu menginkubasi kedua
tabung (1 dan 2) pada suhu 370C selama 60 menit atau pada suhu kamar selama
2.5 jam. Kemudian memasukkan ke dalam refrigerator selama 20 menit, setelah
itu membaca hasilnya.
Pembacaan Hasil
 Tabung uji (tabung 1) dibaca setelah tabung blanko (tabung 2) mengental pada
suhu refrigerator ; “blanko” akan cepat menjadi gel
 Tabung 1 : jika tetap cair mengindikasikan adanya tripsin dalam feses.