Aislamiento e Identificación de Coliformes Fecales Provenientes de Carne Molida Cruda

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Aislamiento e Identificación de Coliformes Fecales Provenientes

De Carne Molida Cruda
Cano Sebastián1; Castro Camilo2; Rueda Eduardo3; Salazar Michelle4

1,2,3, 4
Escuela Politécnica Nacional, Facultad de Ingeniería Química y Agroindustria, Quito, Ecuador

Resumen: Se aislaron e identificaron las colonias de coliformes fecales presentes en carne molida cruda en Mac
Conkey Agar y EBM Agar como medios de cultivo. Se prepararon los medios de cultivo según la norma, se esterilizó
los medios preparados y las cajas Petri en la autoclave, después se preparó las cajas Petri en la cámara de flujo laminar.
Se preparó la muestra tomando 25g de muestra y se licuó en 225 ml de BHI, esto se llevó a incubación de 35ºC por
2 horas. Se añadió el sobrenadante en la mezcla licuada e incubar a 44º C por 20 horas. Se realizó la siembra en los
dos medios con sus respectivas paralelas, se incubó a 35ºC por 24 horas y se examinó. Se tomó una colonia de posibles
coliformes, se realizó la tinción de Gram para determinar Gram (-) y se sembró de nuevo, se incubó y se realizó la
tinción para analizar presencia de coliformes. En el medio Mac Conkey Agar se evidenció presencia de coliformes
fecales, que gracias a la tinción y observación en el microscopio se constató coliformes. En el medio EBM Agar
crecieron pocos coliformes y se encontraba contaminado con estafilococos. Se identificó la presencia de coliformes
fecales en el medio Mc Conkey Agar, caracterizada por el color rosado y forma circular de sus colonias.

Palabras clave: Aislamiento, medio, tinción de Gram, coliformes, bacilo

Isolation and Identification of Fecal Coliform Hailing from the raw

ground beef
Abstract: They were isolated and identified colonies of fecal coliforms present in raw ground beef and Mac
Conkey Agar Agar EBM as culture media. The culture media were prepared according to standard media
preparations and Petri dishes in the autoclave sterilized after Petri dishes prepared in the laminar flow chamber.
Were taking 25g sample was prepared and liquified in 225 ml BHI, this incubation was 35 ° C for 2 hours. The
supernatant was added to the liquified mixture and incubating at 44 ° C for 20 hours. Planting was carried out in the
two media with their respective parallel, incubated at 35 ° C for 24 hours and examined. A colony of coliform was
made possible, Gram staining was performed to determine Gram (-) and seeded again, incubated and staining was
performed to analyze the presence of coliforms. In the middle Mac Conkey Agar presence of fecal coliforms,
thanks to staining and microscopic observation was found coliform was evident. In the middle EBM few coliform
Agar grew and was contaminated with staph. The presence of fecal coliforms in the middle Mc Conkey Agar,
characterized by pink color and form circular colonies identified.

Keywords: Isolation, médium, Gram Stain, coliform, bacillus

1. MARCO TEÓRICO
Coliformes
Son bacilos Gram (-) aerobios y anaerobios facultativos no
esporulados, tienen una temperatura de incubación a 37º C por
48 horas. Se caracterizan por su capacidad de fermentar la
lactosa con la producción de ácido y gas.
Del grupo coliformes forman parte varios géneros, como los
Escherichia, Enterobacter, Klebsiella y Citrobacter. Se
encuentran en el intestino humano y de los animales, también
en el suelo y las plantas. Se suelen utilizar como indicadores
de contaminación fecal por frecuencia de heces, fàciil
detección en el laboratorio. Se consideran los coliformes
fecales como los presuntos Escherichia coli (John. L, Ingrham.
C, 1998, p.358).
Mac Conkey Agar
Es un medio utilizado para aislar bacilos Gram (-) de fácil
desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite
diferenciar microorganismos que utilizan lactosa en muestras
clínicas. En este medio las peptonas aportan los nutrientes
necesarios para el desarrollo de los microorganismos, la
lactosa es el carbohidrato fermentable y los otros
componentes, son los responsables de inhibir el crecimiento de
los Gram (+). Los no fermentadores de lactosa producen
colonias incoloras. A continuación, se detalla la composición
de este medio. (Olivas. E, Fonelli. F, 2004, p.56)

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3. METODOLOGÍA

Previo a la realización de la parte experimental, se realizó un

Tabla 1. Fórmula para preparar medio Mac Conkey Agar tratamiento de enriquecimiento de la muestra de carne,
Fórmula (g/L) obteniendo una solución con la que se realizó la siembra en
Peptona 17,0 streak plates.
Pluripeptona 3,0 Con el asa esterilizada en el mechero, se tomó una gota de la
Lactosa 10,0 solución preparada, y se realizó streak plates en cajas Petri con
los dos medios de cultivo; MacConkey agar y EBM,
Mezcla de sales biliares 1,5
realizando 3 cuadros concéntricos, sin cerrar un lado, para que
Cloruro de Sodio 5,0
sólo del marco interno salga una línea ondulada al centro de la
Cristal violeta 0,001 caja Petri. Se sometió a incubación la muestra durante 24 horas
Rojo neutro 0,03 a 35°C; al finalizar el tiempo se analizó individualmente cada
Agar 13,5 muestra con el fin de identificar colonias sospechosas y que se
encuentren aisladas para su fácil manipulación. Al identificar
EBM Agar una de interés, se procede a realizar un Gram Stain; con el asa
se toma la colonia seleccionada, se realizó un frotis en un
Medio utilizado para aislar microorganismos Gram (-) de portaobjetos con una gota de agua destilada, posterior a ello se
rápido desarrollo y poca exigencia nutricional. La peptona secó el agua en el portaobjetos con intervalos cortos cerca del
sirve de alimento para los microorganismos. Los organismos mechero. En el portaobjetos seco, se colocó violeta de metilo
capaces de oxidar la lactosa o la sacarosa pueden observarse para que actúe durante dos minutos, se enjuagó con agua el
debido a los cambios con la eosina y el azul de metileno. Las exceso de colorante rápidamente y se colocó yodo igualmente
cepas que utilizan la lactosa presentan un centro oscuro con en un intervalo de 2 minutos, después del cual se realizó un
periferia azulada o rosada, y los q no utilizan lactosa son lavado con acetona. Finalmente se colocó una gota de fucsina
durante 1 minuto, y se realizó un lavado final con agua
incoloros. (Rodríguez. E, Gamboa. M, Hernández. F, 1998,
destilada. Se secó el portaobjetos ligeramente y se observó en
p.48)
el microscopio óptico; analizando sus características físicas
como color (determinado por la tinción de Gram) y forma, se
Tabla 2. Fórmula para preparar medio EBM Agar pudo determinar si se trata del microorganismo de interés, para
Fórmula (g/L) realizar una resiembra de la colonia seleccionada, repitiendo el
Peptona 07,0 proceso inicial, con las mismas características de incubación;
Sacarosa 5,0 a 35°C durante 24 horas. Nuevamente se analiza las colonias
Lactosa 5,0 formadas mediante Gram Stain, para seleccionar una de interés
Fosfato dipostàsico 2,0 bajo los mismos parámetros anteriores. Este proceso se lo
Eosina 0,4 realizó en cada medio; luego de determinar una vez más la
Azul de metileno 0,065 presencia de coliformes por el procedimiento de Gram Stain,
Agar 13,5 se realizó una siembra final en un tubo de ensayo con la nueva
colonia seleccionada.

2. EQUIPO Y MATERIALES UTILIZADOS

4. DATOS EXPERIMENTALES
A continuación, se detallan los materiales utilizados en la
Los datos experimentales se determinaron por simple
práctica.
observación y registro de las características de los cultivos; por
lo que se detallan en la sección de resultados, para su posterior
Tabla 3. Materiales necesarios para la práctica. discusión.
Material Cantidad
BHI 225 mL 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Caja petri con Mc Conkey Agar 4
Caja petri con EBM Agar 4 En la Tabla 4 se presentan los resultados de la siembra de
Microscopio 1 coliformes fecales obtenidos en cada medio con las respectivas
descripciones de sus colonias
Asas 1
Mechero 1 Tabla 4. Apariencia de las colonias
Estufa 1
Apariencia
Pinza para tubos de ensayo 2 Medio utilizado
Color Forma
Tubo de ensayo 1 Mac Conkey Agar Rosado Redonda
EBM Agar Rosado Redonda

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La Figura 1 muestra la vista al microscopio de las colonias de
coliformes fecales presentes en los medios Mac Conkey y
EBM Agar respectivamente, después del proceso de tinción de
Gram.
Mac Conkey Agar EBM Agar
Figura 1. Resultados del teñido en los 2 medios estudiados
Luego de que se observaron los streak plates en los que se
sospechó la presencia de coliformes fecales, en el medio Mc
Conkey Agar se observaron colonias con forma redonda y de
coloración rosada, al analizarlas en el microscopio óptico
luego de que se realizó Gram Stain se pudieron visualizar
pequeños bacilos de color rosa, la forma que se pudo observar
es típica de los coliformes y su color rosa indicó que las
bacterias analizadas fueron Gram negativas. En el medio EBM
Agar se observaron colonias de color rosa, no se observaron
puntos de color verde metálico, por lo que la cantidad de
coliformes desarrollados no fue la esperada, se constató dicho
suceso en el microscopio óptico luego de realizar Gramn Stain,
se observaron bacilos de color rosa en mínimas cantidades
contaminados por estafilococos de color violeta, se repitió el
proceso para el segundo plato y no se pudieron observar
bacilos rosados, por lo que se pudo determinar que el proceso
de siembra no fue el adecuado y pudo haberse contaminado
por una manipulación inadecuada del asa o una deficiente
distribución del inoculo en el medio. La coloración rosa de los
coliformes al igual que la violeta de los estafilococos no tiene
una explicación a ciencia cierta, en este caso las bacterias
toman el color de la fucsina y no del violeta de metilo, dicho
fenómeno se produce por diferencias estructurales y de
composición entre las paredes celulares de ambas bacterias, de
las cuales la presencia de una doble capa y 2 espacios
intersticiales llenos de derivados de glicerol son característicos
de las bacterias Gram negativas y por ende de los coliformes
analizados.
6. CONCLUSIONES
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Se identificó la presencia de coliformes fecales en el medio Mc
Conkey Agar, caracterizada por el color rosado y forma
circular de sus colonias.
En el medio EBM Agar no se logró determinar la presencia de
las colonias de coliformes fecales, por el contrario, se
identificó mayormente la presencia de Staphylococcus en
dicho medio, probablemente debido a contaminaciones
durante el proceso de siembra.
Se observó en el microscopio que las colonias de coliformes
fecales se tiñeron de color rosa, por lo cual se pudo determinar
que dichos microorganismos eran bacterias Gram (-).
7. RECOMENDACIONES
Esterilizar de mejor manera el lugar de trabajo y el asa para
evitar contaminaciones en las muestras.
Realizar la siembra de manera sutil para evitar el daño del agar
y no dejar la caja Petri expuesta al medio ambiente durante
largos lapsos de tiempo para evitar posibles contaminaciones.
Tomar una colonia representativa que permita realizar el Gram
stain y también la resiembra para evitar incongruencias en el
análisis de las muestras.
No utilizar grandes cantidades de acetona cuando se realiza el
Gram stain, debido a que la colonia tomada para su análisis en
el microscopio puede perderse al ser lavada.
8. PREGUNTAS
8.1 ¿Qué dificultades encontró en esta práctica?
Al momento de seleccionar colonias aisladas de interés para la
el proceso Gram Stain y la resiembra, en la mayoría de casos
estaban muy agrupadas, por lo que hay que tomar en cuenta
este parámetro en futuros procesos de Streak Plates, realizando
una siembra más separada.
Bibliográficamente se dispone de los parámetros de
identificación de los microorganismos en el microscopio
óptico; sin embargo, en la práctica, resulta un poco complicado
su caracterización para quienes no están acostumbrados a
manipular dicho equipo, se pueden confundir con
microorganismos no deseados por la similitud de su forma.
Con la ayuda de la señorita ayudante del Laboratorio se superó
esta dificultad y se hizo más fácil los procesos posteriores
8.2 ¿Qué haría en el caso de que en la segunda rayada
de platos obtiene un Gram + y un Gram – al
mismo tiempo?
Determina la presencia de microorganismos contaminantes en
la muestra; se requiere un nuevo rayado, seleccionando
colonias aisladas con las características que se desea (las Gram
(-) en este caso, teniendo mucho cuidado de no contaminar el
asa con los otros microorganismos evitando el contacto,
evitando así una nueva contaminación.
8.3 ¿Qué utilidad encuentra a la práctica?
Por las características de los microorganismo que se analizan;
coliformes fecales, estos resultan ser patógenos para el ser
humano, se vuelve un tema de interés el determinar su
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presencia en productos alimenticios que fácilmente los

encontramos en nuestro hogar, a fin de conocer los riesgos a
los que estamos expuestos en la manipulación de alimentos,
además de identificar causas de afecciones en nuestro
organismo.

9. REFERENCIAS

John. L, Ingrham. C. (1998). Introducción a la

microbiología.3ra Edición. Bogotá – Colombia: Editorial
Reverte.

Olivas. E, Fonelli. F. (2004). Manual de Prácticas de

microbiología I, II y Parasitología. 2d Edición. México D.F –
México: Universidad Autónoma Ciudad de Juárez.

Rodríguez. E, Gamboa. M, Hernández. F. (1998).

Bacteriología General: Principios y prácticas de laboratorio.
5ta Edición. Buenos Aires - Argentina: Mc Graw Hill.

Negroni. M. (2009). Microbiología Estomatológica:

Fundamentos y guía práctica. 2 da edición. Buenos Aires -
Argentina: Editorial Panamericana.

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