Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------
1. Introducción
A. Historia de la técnica de recuento en placas
a. Medio gelatina nutritiva
b. Medio agar
B. Métodos más recientes
a. Recuento en placa estándar s
b. Recuento heterotrófico en placas
1. Definición de bacterias heterótrofas
2. Medios selectivos versus no selectivos para el crecimiento de bacterias
heterótrofas
II. Usos del recuento heterotrófico en placas
III. Métodos alternativos
A. Método de placa fluida (MPF)
B. Método de placa difusa (MPD)
C. Método de filtración por membrana (PPM)
IV. Consideraciones y beneficios del monitoreo
V. Referencias
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Resumen:
La medición de bacterias heterótrofas en el agua potable puede proporcionar
información útil a los operadores de plantas de agua, ingenieros sanitarios, supervisores
de la calidad del agua y analistas de laboratorios de calidad del agua. Durante el
tratamiento la densidad bacteriana varía y en la red de distribución se puede monitorear el
deterioro de la calidad a través de los métodos de recuento heterotrófico en placas
(RHP). La aplicación constante del método de RHP seleccionado proporcionará datos
básicos para evaluar cambios en la calidad bacteriana del agua potable. A continuación
se presenta un resumen de los métodos disponibles en los Estados Unidos e información
para optimizar el RHP a través de la elección de procedimientos, medios y tiempo y
temperatura de incubación.
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------
a. Gelatina nutritiva. El Dr. Robert Koch (1876) usó la gelatina como el primer
agente gelificante para solidificar el medio líquido usado en el cultivo de las bacterias.
También desarrolló el método de estriado, el método de recuento en placas para el
aislamiento de bacterias y el método de sesgado para sembrar cultivos puros. El uso de
la gelatina como agente de solidificación permitió obtener muestras para el cultivo en
placas, directamente o en alícuotas diluidas, en el medio gelificado, lo que facilitó el
crecimiento de colonias individuales y el desarrollo de cultivos puros. La gelatina se podía
obtener fácilmente y a un bajo costo pero presentaba dos desventajas. En primer lugar, se
debe incubar por debajo de 28 °C para mantenerla solidificada; el uso de temperaturas
de incubación inferiores de 28 °C no es adecuado para muchas bacterias. En segundo
lugar, muchas bacterias pueden descomponer la gelatina, lo que hace que se licúe e
impida la reproducción de las colonias. Actualmente, la gelatina nutritiva se usa
principalmente para determinar si una bacteria aislada de un cultivo puro puede producir
gelatinasa y licuar la gelatina como una característica bioquímica.
b. Medio agar. Fue por sugerencia de Frau Hesse, esposa de un antiguo auxiliar
del Dr. Koch, que el agar se introdujo como un agente gelificante para el medio de cultivo.
En el Oriente el agar, derivado de algunas algas marinas, se usó como un agente
gelificante. El agar entra en solución a 100 °C y permanece en estado líquido a una
temperatura aproximada de 40 °C. Por lo tanto, una vez gelificado, permanece en estado
sólido y se puede incubar a diferentes temperaturas para cultivar bacterias. Además,
como el agar es un carbohidrato complejo atacado solo por algunas bacterias, el
problema de la licuefacción no es muy frecuente
Por lo tanto, el uso del agar como agente de solidificación en medios de cultivo
selectivo y no selectivo ha permitido obtener mayor flexibilidad y capacidad para detectar
y enumerar bacterias en todo tipo de muestras, incluidas las muestras clínicas, de
alimentos, agua ambiental y potable, suelos, sedimentos y superficies (cocinas y áreas de
preparación de alimentos, superficies de hospitales, etc.).
Además, se observó que el método de la placa difusa era más exacto que el de la
placa fluida. Al examinar la distribución de los recuentos bacterianos de la misma muestra
obtenidos con ambos métodos, se halló que aproximadamente 90% de los recuentos de
la placa fluida estaban en una categoría de < 500/ml en comparación con solo 49% de los
recuentos de la placa difusa (cuadro 3). Además, solo 6,3% de los recuentos de la placa
fluida estaban en > 1.000/ml en comparación con aproximadamente 35% de los recuentos
de la placa difusa. Esto es una prueba más de que el método de la placa fluida es muy
ineficiente y puede subestimar significativamente el número de bacterias en una muestra
de agua tratada. Hay dos efectos que contribuyen a reducir los recuentos obtenidos con el
método de la placa fluida. En primer lugar, el agar licuado temperado causa daños
irreparables a algunas bacterias. En segundo lugar, el crecimiento de bacterias altamente
aerobias se dificulta cuando los organismos están dentro del agar y no en la superficie.
La figura 2. compara los resultados del RHP después de siete días de incubación
para muestras de aguas de fuente no clorada y de agua potable clorada. Los recuentos
de colonia se obtuvieron mediante los métodos estándares y medio agar R2A con los
procedimientos de la placa difusa, del filtro de membrana y del filtro de membrana m-
RHP. Esta cifra muestra que la incubación a 20 °C produjo los recuentos más altos en
todos los medios para los dos tipos de muestras, también indica que los resultados a 35
°C fueron muy bajos en comparación con los resultados a 20 °C para el agua clorada.
Además, el método usado para el RHP del agua clorada a 35 °C fue más importante que
para el RHP a 20 °C. Estos datos sirven para resaltar el hecho de que la combinación de
métodos/medios de RHP se debe determinar experimentalmente mediante pruebas de
comparación y no se debe suponer que todas las combinaciones de medios/métodos van
a producir resultados equivalentes.
Como actualmente no hay ningún requisito legal en las normas primarias del agua
potable para la medición del RHP, la decisión de monitorear el RHP y la elección de la
metodología dependen estrictamente del servicio de agua. Se espera que un manejo bien
informado y progresivo por parte del servicio de agua determine el uso del RHP como una
herramienta complementaria de información para realizar una operación óptima del
proceso de tratamiento y producir un producto de alta calidad para sus clientes.
Referencias
1. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19a. Edición. APHA,
AWWA, y WPCF. Washington, D.C. (19a. ed., 1995).
5. Haas, C. N., M. A. Meyer, y M. S. Paller. 1992. Analytical note: Evaluation of the m-SPC
Method as a Substitute for the Standard Plate Count in Water Microbiology. Jour. AWWA,
74(6):322.
Volumen de la
Subsección Medio Incubación °C/tiempo
muestra
9215B, método de TGE 35 ± 0,5 °C/48 ± 3 h. 1 ml. máximo
placa fluida (MPF) PCA “ “ /72 ± 4 h.
28 °C ó 20 °C/5-7 días
# = Agua embotellada.
Cuadro 2. RHP Ingredientes de los medios (g/litro)
Agar del
Ingrediente recuento en R2A Agar m-RHP Agar NWR1
placa (ARP)
Caseína soluble - - - 0,5
Triptona 5,0 - - -
Glucosa 1,0 0,5 - -
Extracto de levadura 2,5 0,5 - -
Proteosa peptona #3 o - 0,5 - -
polipeptona
Ácidos casaminos - 0,5 - -
Almidón soluble - 0,5 - -
K2HPO4 - 0,3 - 0,2
MgSO⋅7H2O - 0,05 - 0,05
Piruvate de sodio - 0,3 - -
Cloruro férrico - - - 0,001
Peptona - - 20,0 3,0
Gelatina - - 25,0 -
Glicerol - - 10,0 -
Agar 15,0 15,0 15,0 15,0
PH 7 ± 0,2 7,2 7,1 7,2
Agua destilada 1,0 L 1,0 L 1,0 L 1,0 L
Todos los medios, a excepción del m-RHP se esterilizan en el autoclave a 121 °C por 15
minutos después de hervir para disolver todos los ingredientes. Para preparar el agar m-
RHP se mezclan todos los ingredientes, excepto el glicerol, se ajusta el pH con 1,0 N
NaOH, se calienta para disolver, se añade glicerol y se coloca en el autoclave a 121 °C
por cinco minutos.
Cuadro 3. Distribución de los recuentos de bacterias de la misma muestra
tanto con el procedimiento de placa líquida como con el de la placa difusa.
Recuento de placas/mL
Placa fluida
Placa difusa
Las diapositivas (no incluidas en el paquete) indican que no tienen una copia impresa
correspondiente porque no fue posible escanearlas. Por ejemplo, las diapositivas 27-30
se presentarán durante la conferencia pero no se dispone de la copia impresa.
Todas las copias impresas están enumeradas al reverso para coincidir con la lista.
Tampoco se dispone de una versión electrónica debido al tamaño del archivo; se tendría
que utilizar un disquete por cada diapositiva.