Polimerización de compuestos fenólicos por Polifenol oxidasa de pimiento

morrón con incremento en su capacidad antioxidante

RESUMEN
Los frutos de chile (Capsicum annum) son ricos en flavonoides, los cuales poseen una gran
capacidad antioxidante. La polifenoloxidasa (PFO) de Capsicum annum fue parcialmente purificada
para polimerizar compuestos fenólicos. Los diámetros hidrodinámicos de los productos resultantes
fueron analizados mediante el análisis dispersión dinámica de luz y su relación con la capacidad
antioxidante. La PFO catalizó la polimerización de los compuestos fenólicos libres formando
agregados de 1500 nm con mayor capacidad antioxidante que sus monómeros. Se identificó una
mayor polimerización con epicatequina formando agregados de 5000 nm con una capacidad
antioxidante superior al monómero de epicatequina. Los agregados de ácido ferúlico presentaron
una capacidad antioxidante 15 veces mayor comparada con su monómero. La quercetina fue la
menos polimerizada pero aún con valores de capacidad antioxidante mayores al monómero.

1. Introducción
Los radicales libres se generan in vivo para propósitos específicos en
metabolismo, pero puede llegar a ser problemático si los desequilibrios
entre la generación de radicales libres y los organismos
mecanismos de defensa (Amic, Davidovic-Amic, Beslo, &
Trinajstic, 2003). Cuando esto ocurre, se produce daño oxidativo
en las células diana (localizaciones específicas en biomoléculas,
como proteínas, lípidos y ácidos nucleicos, donde los productos farmacéuticos
implementar acciones) (Einbond, Reynertson, Luo, Basile,
Kennelly, 2004). Los antioxidantes son la defensa del organismo
contra los radicales libres y el daño oxidativo que causan,
que ha despertado un interés creciente en el uso de
antioxidantes como aditivos alimentarios (Toscano, Colarieti, & Greco,
2003). Los flavonoides son un grupo extenso de compuestos fitoquímicos
compuestos fenólicos con un peso molecular relativamente bajo
(MW) y propiedades antioxidantes in vitro que dependen de la
número y posición de sus grupos hidroxilo. Flavones,
flavonoles (rutina, kaempferol y quercetina) y antocianinas
pertenecen a este grupo (Havsteen, 1983). Debido a su alta
actividad antioxidante, desempeñan un papel importante en la prevención de
enfermedades cardiovasculares, cáncer y enfermedades degenerativas
(Havsteen, 2002, Heim, Tagliaferro, & Bobilya, 2002).
Capsicum annuum L., conocido como chile, pimiento, y / o
pimienta, es un cultivo que se cultiva en México, Centro y Sur
America. Es una de las cinco especies más consumidas de la
mundo considerado como una fuente de antioxidantes tales como fenoles,
flavonoides y taninos condensados (Oboh, Puntel y Rocha,
2007). El pimiento es una buena fuente alternativa de fenoles
obtenido de estudios de polimerización. Polifenol oxidasa
(PPO) (E.C. 1.14.18.1) es la enzima principal responsable de
en las frutas y verduras. Sin embargo, una posible
se ha propuesto una sinergia entre PPO y peroxidasa
debido a la generación de peróxido de hidrógeno durante
oxidación de fenólico con PPO (Arslan, Erzengin, Sinan,
Ozensoy, 2004). Los informes indican que, en el caso del
polimerización enzimática de fenoles simples y algunos flavonoides,
la polimerización afecta su eliminación de radicales
actividad (Anthoni et al., 2010, 2008). La polimerización enzimática
de compuestos fenólicos fue objeto de varias
estudios para mejorar su solubilidad y / o su estabilidad y
proporcionar nuevas propiedades. Estas propiedades dependen de
la masa molecular y la estructura de los polímeros (Mohamed & Latifa, 2012). Se han
realizado estudios sobre
polimerización compuesta usando las enzimas lacasa y
tirosinasa del hongo maíz Ustilago maydis y
rutin como sustrato (quercetin-3-rutinoside) (Desentis-Mendoza
et al., 2006). Éstos produjeron polirutina, un polímero flavonoide
con propiedades antioxidantes superiores a las de la rutina
monómero (Desentis-Mendoza et al., 2006). Desentis-
Mendoza et al. (2006) estudió la polimerización enzimática
de compuestos fenólicos y su efecto sobre el antioxidante
actividad protectora y los efectos de protección de las lesiones
hepática de células humanas línea WRL-68. La oxidación de (Kurisawa,
Chung, Uyama, y Kobayashi, 2003) catechin por el rábano picante
peroxidasa (HPR) - peróxido de hidrógeno y lacasa con lanzadera
oxidante suprime eficazmente la peroxidación lipídica en
tejidos y fracciones subcelulares tales como microsomas
y lipoproteínas de baja densidad (Hosny & Rosazza, 2002).
Los perfiles de antocianina y flavonol han sido identificados como
una herramienta eficaz en la diferenciación de variedades similares de uvas.
La polimerización enzimática de compuestos fenólicos (catecol,
resorcinol, e hidroquinona) se llevó a cabo usando lacasa.
Los pesos moleculares en número de los polifenoles
osciló entre 1000 y 1400 Da (correspondiente al grado
de polimerización que varía de 10 a 12) con una concentración de
polidispersidad de aproximadamente 1,10, mostrando polimerización selectiva
de compuestos fenólicos catalizados por la lacasa (Sol
et al., 2013). Kim, An y Song (2003) demostraron que la
polimerización de cardanol, utilizando peroxidasa de soja,
películas con excelente actividad anti-biofouling contra
Pseudomonas fluorescens. Figueiredo-González, Cancho-
Grande y Simal-Gándara (2013) reportaron un incremento
disminución de todos los compuestos fenólicos a lo largo de la deshidratación
proceso. Esto puede deberse a los efectos de la copigmentación
reacciones de las antocianinas con los flavonoles o con
ácidos hidroxicinámicos, y / o el contacto de PPO con ácidos
un sustrato adecuado o con otros polifenoles menos adecuados que
puede ser alterado por quinonas producidas enzimáticamente vía
acoplado reacciones de oxidación. El presente estudio determinó
la eficacia de la polimerización de compuestos fenólicos por
PPO parcialmente purificado de pimientos (Capsicum annuum
L.) y evaluó su relación con la actividad antioxidante.

2. Materiales y métodos
2.1. Material biológico
Los pimientos (Capsicum annuum) se compraron
en el municipio de Ixtapaluca, Estado de México,
Méjico. Las frutas seleccionadas fueron maduras (color rojo) y
w1109.28 sin signos de pudrición o deterioro. Ellos
se limpiaron y se almacenaron a -20 ° C hasta su uso. La actividad PPO
se evaluó durante 16 días de maduración. Después de eso, todos
los pimientos se procesaron.
2.2. Extracto crudo
El extracto bruto se preparó siguiendo Castro et al. (2008).
En resumen, 50 g de pimiento sin semillas se trituraron con
nitrógeno líquido en un mortero de porcelana para romper las membranas celulares.
El pimiento frío se homogeneizó después en 75
ml de tampón de fosfato de sodio (0,2 M, pH 6,5) y 4% (v / v)
polivinilpirrolidona (PVP, Sigma, Sigma Chemical P - 6755,
Toluca, México). La mezcla se agitó durante 1 h a 4ºC.
El homogeneizado resultante se filtró a través de capas de
y se centrifugó a 15.000 rpm durante 20 min a 4 °
El sobrenadante se recuperó como el extracto crudo y
utilizado para la extracción enzimática.
2.3. Extracción enzimática
Se obtuvo el extracto enzimático precipitando el extracto bruto
con sulfato de amonio al 90% de saturación. El precipitado fue
recogido por centrifugación a 15.000 rpm durante 20 min a 4ºC. Era
luego se disuelve en un volumen mínimo de fosfato sódico
(20 mM, pH 6,5) y se dializó durante 24 ha 4ºC usando el
mismo tampón y dos cambios de volumen. El precipitado dializado
se concentró usando ultrafiltración en una atmósfera de nitrógeno
(Amicon® Millipore Inc, Beverly, MA, EE.UU.) con una molécula de 10 kDa
membrana.
2.4. Electroforesis nativa de gel de poliacrilamida
Los geles se hicieron por electroforesis bajo condiciones nativas
después de Laemmli (1970).
2.5. Actividad de Gel PPO
La actividad enzimática post-electroforesis se identificó siguiendo
la técnica descrita por Casado-Vela, Selles y Bru
(2005). El peso molecular de proteína (PM) se calculó usando
estándares de referencia de peso molecular de 14,4 a
97 kDa (Kit de calibración de bajo peso molecular, Amersham
Pharmacia Biotech Inc, Piscataway, NJ, EE.UU.).
2.6. Electroelución
La proteína electroeluida se obtuvo a partir de electroforesis nativa
(Bio-Rad Electroeluter Modelo 422, Hercules, CA,
USA) siguiendo las instrucciones del fabricante a
60 mA durante aproximadamente 8 h. Por último, la actividad PPO fue
medida a la fracción electroeluída.
2.7. Determinación de proteínas
El contenido de proteínas se midió por el método de Bradford (1976)
utilizando albúmina de suero bovino (Sigma) de serie.
2.8. Actividad de PPO
La espectrofotometría se utilizó para medir la actividad enzimática
Muñoz, Bravo, Zapata y Londoño (2007) y con
catecol (Sigma) como sustrato. Se definió una unidad de actividad PPO
como un aumento de 0,001 de absorbancia por minuto a 420 nm y
20 ° C.
2.9. Caracterización PPO
2.9.1. PH óptimo
El efecto del pH sobre la actividad enzimática se midió de acuerdo
a Gasull y Becerra (2006) con algunas modificaciones.
Se probaron diferentes pHs usando fosfato de sodio 10 mM
(pH 4-7), tampón HCl 10 mM-Tris (pH 8-9) y borato
(pH 10 - 11). La actividad enzimática se midió como
descrito anteriormente usando catecol de 0,5 M como sustrato.

2.10. Temperatura óptima

Este parámetro se determinó usando la actividad enzimática
ensayo descrito anteriormente, e incubando la mezcla a
diferentes temperaturas (15, 25, 35, 45 y 55 ° C) utilizando
Tampón de fosfato sódico 10 mM (pH 6,5) en la mezcla
reacción.
2.11. Especificidad del sustrato
La actividad de la actividad PPO contra catecol, ácido cafeico,
ácido clorogénico, quercetina, L-DOPA, y protocatechuic
los sustratos ácidos se determinó de acuerdo con la norma
condiciones descritas para el ensayo enzimático. Cada reacción
se realizó por triplicado (Muñoz et al., 2007).
2.12. Extracción de compuestos fenólicos libres
De acuerdo con el método descrito por Adom y Liu (2002)
con algunas modificaciones; compuestos fenólicos
extraído de una mezcla de 2 g de muestra y 8 mL de etanol
(80%) durante 10 min. La solución se centrifugó a 13.000
rpm durante 10 min a 4 ° C, el sobrenadante fue entonces retirado
y la extracción se repitió una vez más. Los extractos fueron
almacenado a 4 ° C hasta su uso.
2.13. Contenido fenólico total
El contenido total de fenol se midió siguiendo Adom,
Sorrells, y Liu (2005). Brevemente, 0,75 ml Folin Ciocalteu
reactivo (Sigma) diluido 10 veces con agua destilada
añadido a 0,1 ml de extracto. Esta mezcla se dejó reposar para
5 min en la oscuridad y luego se neutralizó con 0,75 ml
De NaHCO _ {3} a 60 g / l. Después de dejar reposar la mezcla
90 min, la absorbancia se midió a 725 nm usando un espectrofotómetro
(GBC UV / VIS 918). El contenido total de fenol fue
expresada como equivalentes de ácido gálico (GA) por gramo de muestra
utilizando GA como estándar.
2.14. Actividad de barrido radical
Esto se midió añadiendo 10 μl de muestra a 990 μl de ABTS +
(Ácido 2,2'-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico),
radicales ajustados a una absorbancia de 0,7 \ pm 0,02. Mediciones de absorbancia
se tomaron a intervalos de 1-7 min. Anhidro
se utilizó etanol como blanco. La actividad antioxidante fue
expresado en milimoles de capacidad antioxidante equivalente Trolox
(TEAC) por gramo (Adom et al., 2005).
2.15. Ensayos dinámicos de dispersión de luz (DLS)
DLS mide el movimiento browniano y lo relaciona con el tamaño de
las partículas. El movimiento browniano es el movimiento aleatorio de
partículas debidas al bombardeo por las moléculas de disolvente
que los rodean (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido).
Análisis de la distribución hidrodinámica del diámetro de
proteína parcialmente purificada (es decir, la solución de enzima) y libre
fenoles se realizó utilizando la técnica DLS con un Malvern
Zetasizer (Serie Nano S-90, Malvern Instruments) a 25 ° C en
la opción "proteína típica". Las muestras se filtraron con
0,25 μm antes de la medición con DLS. Diámetro de partícula
Las mediciones son el resultado de lecturas tomadas en cada
tiempo correspondiente a un DV0.9 = 6 μm, lo que significa que el 90% de
el volumen de partículas mide ≤ 6 μm. Cuatro combinaciones (E) de
los fenoles libres y el extracto enzimático se ensayaron en busca de enzimas
polimerización: (E1) 1,5 ml de fenoles libres (4,5 mg / ml gálico
ácido (GA)) + 1,5 ml de extracto enzimático (3,6 U); (E2) 1,5 ml libre
fenoles (2,3 mg / ml GA) en etanol al 80% + 1,5 ml de enzima
extracto (3,6 U); (E3) 0,4 ml fenoles libres (4,5 mg / ml GA) +
2,4 ml de tampón de fosfato sódico (10 mM, pH 6,5) + 0,2 ml
extracto enzimático (3,6 U); y (E4) 0,4 ml de fenoles libres (2,3 mg /
ml de GA) en etanol al 80% + 2,4 ml de tampón fosfato sódico (10
mM), pH 6,5 + 0,2 ml de extracto enzimático (3,6 U). Cuatro enzimáticos
los ensayos de polimerización se realizaron también como se ha descrito anteriormente,
pero
utilizando compuestos fenólicos puros (ácido ferúlico [Sigma], quercetina
[Sigma]; y epicatequina [Sigma]) como sustratos en una
Concentración inicial de 0,25 mg / ml.

3. Resultados y discusión
3.1. Actividad enzimática y contenido proteico
La concentración de proteína fue mayor en el extracto bruto
(1,66 g / 100 g) que en la solución enzimática (1,12 g / 100 g;
Tabla 1). Estos contenidos son superiores a los 1 g / 100 g
reportados por Moreiras, Carbajal, Cabrera y Cuadrado
(2007) en el pimiento. Las diferencias en la concentración de proteínas
puede atribuirse a la etapa de maduración del fruto en la cosecha, cultivo
condiciones y región de origen (Rivero et al., 2001). Específico
La actividad de PPO en el extracto enzimático fue de 3,6 U / mg de proteína.
Este valor es superior a 1,92 U / mg de PPO seta
(Fulya, Ahmet, Arzu, Nagihan, & Ertugrull, 2011). Específico
los valores de actividad para otras plantas incluyen 79,83 U / mg de proteína
para la patata (Lin et al., 2010) y 1,50 U / mg de proteína para
clavel (Roquesa y Higuera, 2007).
3.2. Electroforesis nativa de gel de poliacrilamida
El extracto enzimático tenía una banda intensa bien definida a 54 kDa
(Figura 1), que es similar a los MWs reportados para loquat (58 kDa)
(Ding, Chachin, Ueda, & ImahorI, 1998) y oliva (55 kDa)
(Ortega-García, Blanco, Peinado, & Peragon, 2008). Diferente
Se han reportado MWs para PPOs de Boletus erythropus
(40 kDa) (Özel, Colak, Arslan, & Yildirim, 2010), piña
(104 kDa) (Das, Bhat, & Gowda, 1997) y papa (69 kDa)
(Thygesen, Dry, y Robinson, 1994). Arnnok, Ruangviriyachai,
Mahachai, Techawongstien y Chanthai (2010) fueron los
primero para reportar la presencia de PPO en algunos C. annuum L. caliente
variedades, pero no incluyeron datos de MW, y no hay
otros estudios sobre PPO en C. annuum. La razón de tal amplia
variabilidad en PM entre PPOs de diferentes orígenes sigue siendo
no está claro, pero se ha atribuido a una o más polimerizaciones
(Smith y Montgomery, 1985), la glicosilación (Ganesa,
Fox, & Flurkey, 1992), proteólisis y enlaces disulfuro (Marques,
Fleuriet y Macheix, 1995).

Figura 1. Electroforesis en gel de poliacrilamida nativa de pimiento (Capsicum

anual): 1. Marcador de bajo peso molecular, teñido con Coomasie; 2. Pimiento
extracto enzimático (7,68 mg / ml), se tiñeron con catecol 20 mM.
Figura 1. Electroforesis en gel en condiciones de chile pimiento
Capsicum annum: 1. Marcador de bajo peso molecular tinción de Coomasie; 2.
Extracto enzimático de pimiento (7,68 mg / ml), teñido con 20 mM de Catecol.
3.3. Caracterización PPO parcial
El pimiento PPO presentaba una actividad máxima (211.30 U / mg)
a pH 6,5 (Figura 2 (a)), que coincide con los valores informados
para loquat (Dincer, Colak, Aydin, Kadioglu, & Güner, 2002),
trigo (Altunkaya y Gokmen, 2011) y lichi (Jiang, 2001).
Según informes previos, el pH óptimo de los PPOs
de varias plantas y verduras es comúnmente 4.0-8.0:
pH 7,5 para el clavel (Roquesa y Higuera, 2007); pH 6 para
berenjena (Concellón, Añón, & Chaves, 2004); pH 6-7 para
alcachofa (Aydemir, 2004); pH 5 para la uva (Rapeanu, Loey,
Smout, & Hendrickx, 2006); pH 5,7 para el brócoli (Gawlik-Dziki,
2008); y pH 8 para Cleome gynandra (Gao, Liu, & Xiao, 2011).
La acción de la enzima PPO sobre el sustrato depende de la
pH óptimo para una actividad enzimática principal.
La actividad enzimática fue más alta (132.06 U / mg) a 35 ° C y
estaba ausente a 45 ° C (Figura 2 (b)). Máxima actividad de PPO en
35 ° C coincide con informes para PPO de loquat (Dincer
et al., 2002), mantequilla de lechuga (Gawlik-Dziki, 2008), litchi (Jiang,
2001), mamey (Palma-Orozco, Ortiz-Moreno, DorantesÁlvarez,
Sampedro, & Nájera, 2011), y está cerca de lo reportado
para otras fuentes PPO tales como menta (30 ° C) (Kavrayan &
Aydemir, 2001) y Hevea brasilensis (35 - 45ºC)
(Wititsuwannakul, Chareonthiphakorn, Pace,
Wititsuwannakul, 2002). Temperaturas óptimas de algunos
Los PPO que utilizan catecol son 25-45 ° C (Wititsuwannakul et al.,
2002; Yoruk y Marshall, 2003). El pimiento PPO exhibió
preferencia por un sustrato ácido clorogénico, seguido de
quercetina y ácido cafeico (Figura 2 (c)). Esto es similar a un
PPO del tomate (Casado-Vela et al., 2005).
3.4. Compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Compuestos fenólicos libres extraídos de pimiento fresco
tienen un valor de 2042 mg GA / 100 g (Tabla 2). Esto es mayor para
el valor de 296 mg / 100 g informado por Kevers et al. (2007) y
los 257 mg / 100 g informados por Howard, Talcott, Brenes y Villalon (2000), pero muy
superior al valor de 69,7 mg /
100 g reportados por Sun y Tanumihardjo (2007) y el
87,6 mg / 100 g informados por Young, Vinson, Su y Zubik
(2006). Estas diferencias son atribuibles a los cultivares y
condiciones de cultivo en diferentes regiones. Capacidad antioxidante
de los compuestos fenólicos extraídos de campana fresca y madura
pimiento fue de 1109 mmol TEAC / g de fenol (Tabla 2), mucho
mayor que en el chile serrano o jalapeño. Sin embargo,
informes sobre la capacidad antioxidante de los pimientos de
7,6-100 mmol TEAC / g de peso fresco (Flores, Jaramillo,
Karendash, Hernández, & Dorantes, 2009; Molina-Quijada,
2009; Pellegrini et al., 2003; Sun y Tanumihardjo, 2007). En
presente estudio, el valor de la capacidad antioxidante fue 22,6 mmol
TEAC / g, cerca de la reportada por Molina-Quijada (2009).

3.5. Polimerización de compuestos fenólicos libres por

oxidación enzimática y su capacidad antioxidante
La actividad de la enzima y la solubilidad del sustrato
son los dos factores importantes para la alta polimerización
rendimiento de la reacción. El entorno natural de la
enzima es agua, mientras que los sustratos fenólicos son más
soluble en disolventes orgánicos (Mohamed & Latifa, 2012). En
el primer tratamiento E1 (E1: 1,5 ml de fenoles libres (4,5 mg / ml
GA) + 1,5 ml de extracto enzimático (3,6 U)), la hidrodinámica
diámetros eran similares o inferiores a los fenoles libres
en blanco (1500 nm) y solución en solución en blanco (1000 nm)
(Figura 3 (a)). Esto podría indicar una baja interacción entre
el PPO y los compuestos fenólicos libres. El bajo o ausente
reactividad de algunos fenoles podría explicarse por su
estructura molecular y su mayor potencial redox
(Mohamed & Latifa, 2012).
En la reacción de la solución enzimática (3,6 U) con un
2,3 mg / mL de concentración de compuesto fenólico libre (E2:
1,5 ml de fenoles libres (2,3 mg / ml de GA) en etanol al 80%
1,5 ml de extracto enzimático (3,6 U)), se midieron los diámetros moleculares
mayor que para los fenoles libres, y solución enzimática
los espacios en blanco estaban a los tiempos de reacción de 40, 50, 90 y 130 min.
Esto muestra que los dímeros de 800 nm y los trímeros de 1000 nm
formado como resultado de la reacción enzimática con los sustratos.
Dordick, Marletta y Klibanov (1987) observaron cambios en
el peso medio de polímero de poli (fenol) de 1000 a
sobre 26.000 g.mol-1 al variar el contenido de 1,4-dioxano en
la reacción de polimerización. Mita, Tawaki, Uyama y
Kobayashi (2002) han investigado varios solventes polares
y su influencia en la quimioselectividad de la peroxidasa-
inició la polimerización de fenoles. En E2, la polimerización
perfil no era significativo con respecto a la
capacidad antioxidante (297 mmol TEAC / g de fenol), este comportamiento
se debe a interacciones entre la enzima, el disolvente,
el monómero, y el polímero, particularmente a la disminución
de la afinidad enzimática al sustrato. En disolvente orgánico, the activity of
oxidoreductases is reduced due to their denaturation
in such environment (Rodakiewicz-Nowak, 2000).
For that, the use of cosolvent was a good alternative to
aqueous or organic solvents.
The polymerization profile for E3 (0.4 mL free phenols
(4.5 mg/mL GA) + 2.4 mL sodium phosphate buffer
(10 mM, pH 6.5) + 0.2 mL enzyme extract (3.6 U)) began
with formation of a 1550 nm trimer, followed by formation
of dimers at 20, 40, 50, and 70 min (Figure 3(c)). The polymerization
was stable until 70 min as result of oxidative
polymerization of phenols via recombination process
(Mohamed & Latifa, 2012).
In the E4 (0.4 mL free phenols (2.3 mg/mL GA) in 80%
ethanol + 2.4 mL sodium phosphate buffer (10 mM), pH
6.5 + 0.2 mL enzyme extract (3.6 U)) profile (Figure 3(d)),
phenol dimers and trimers were formed at 40, 50, and
70 min, with a clear tendency to increase from 20 to
70 min. After 70 min, the polymers underwent disaggregation,
and the profile began to decline and then again began
to form dimers beginning at 120 min.
The tendency to maintain polymerization was clear in all
four treatments, and, although no polymers appeared, a
number of molecular aggregates appeared. Conditions in
E4 were most favorable to PPO activity in formation of
phenolic polymers. It resulted in production of species
from 900 to 1500 nm molecular diameter, corresponding
to phenol trimers and tetramers. This result can be due to
the presence of cosolvent with organic solvent in E4. The
ratio of organic solvent/buffer affects drastically the yield,
the solubility, and the average molecular weight of obtained
polymers (Anthoni et al., 2008; Mita et al., 2002; Mohamed &
Latifa, 2012). For more complex phenols like flavonoids,
there are few works that discussed the effect of the nature
and proportion of solvent (Anthoni et al., 2008; Tonam,
2003). López et al. (2013) identified an enzymatically synthesized
polymer soluble in water, and it possesses active pendant
groups, which might increase its range of applications.
The effect of solvent on selectivity could be attributed to
different interactions of the solvent molecules with the radical
intermediates during their coupling reactions.
E4 showed the highest antioxidant capacity (2196 mmol
TEAC/g phenol), followed by E3 (1152 mmol TEAC/g phenol)
(Figure 4). The free phenolic group had an antioxidant capacity
value of 1109 mmol TEAC/g phenol, higher than E1
(457 mmol TEAC /g phenol) and E2 (297 mmol TEAC/g
phenol). The nearly 100% increase (+97.98%) in antioxidant
capacity in the E4 treatment compared with the pre-reaction
phenolic compounds extract was favored by the conditions
in E4 and was probably the result of formation of molecular
aggregates with diameters from 900 to 1000 nm.
This result indicated that pH is other important factor that
plays a vital role in the enzymatic reaction, besides the ratio
of organic solvent/buffer factor. The effect of the pH on the
polymerization reaction can be related to the nature of the
substrate. For substrates having a redox potential independent
of pH (ABTS, K4Fe(CN)6), laccase activity decreases with
the increase of pH (Mohamed & Latifa, 2012). Few data are
available on the effect of pH on the structure of the synthesized
polymers. Tonam (2003) indicated that the buffer pH
also affected the polymerization behaviors, the yield was the
highest in buffer pH 7 in oxidative polymerization of phenolic
compounds catalyzed by peroxidase. López et al.
(2013) indicated that pH affects the type of linkage between unidades monoméricas en
la oxidación de lacinas Trametes versicolor de
GEORGIA. Un pH ácido promueve el enlace C-C, mientras que el C-O
el enlace es abundante a pH básico. La actividad antioxidante
puede ser dependiente del peso molecular de la mezcla sintetizada
los polímeros y el tipo y la posición de los enlaces
(Mohamed & Latifa, 2012).
Las condiciones de reacción podrían ser controladas por la polidispersidad,
el peso molecular de los polímeros sintetizados,
y el tipo de enlaces entre los monómeros
(Kobayashi & Higashimura, 2003, Mohamed & Latifa, 2012).

Figura 4. Capacidad antioxidante de compuestos fenólicos libres de pimiento

mediante ABTS+ (FL) y de extractos polimerizados con polifenoloxidasa de
pimiento: E1: 1,5 ml fenoles libres (4,55 mg/ml AG) + 1,5 ml extracto
enzimático (3,62 U); E2: 1,5 ml fenoles libres (2,275 mg/ml AG) en 80%
etanol + 1,5 ml extracto enzimático (3,62 U); E3: 0,4 ml fenoles libres
(4,55 mg/ml AG) + 2,4 ml 10 mM regulador de fosfato de sodio, pH
6,5 + 0,2 ml extracto enzimático (3,62 U); y E4: 0,4 ml fenoles libres
(2,275 mg/ml AG) in 80% etanol + 2,4 ml 10 mM regulador de fosfato de
sodio, pH 6,5 + 0,2 ml extracto enzimático (3,62 U).

3.6. Polimerización de compuestos fenólicos puros por

PPO
De los tres sustratos utilizados en las reacciones de PPO, los
efectiva o específica, fue epicatequina (0,25 mg / ml) (Figura 5
(un)). En las cuatro pruebas formó dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros,
e incluso polímeros más grandes, que estaban presentes desde la
comienzo del ensayo. El polímero de orden de 5000 nm fue más
frecuentes en el tratamiento E3. En E3, apareció en 10 y
80 min con un diámetro molecular de 5560 nm, a 90 min con
un diámetro de 5408 nm, ya los 140 minutos con uno de 5532
(Figura 5 (a)). Según Mohamed y Latifa (2012) para el
En la misma enzima, el tipo de sustrato modifica el
peso y rendimiento de los polímeros obtenidos. Esto puede deberse a la
diferencia en la solubilidad del polímero en el disolvente.
El ácido férulico siguió a la epicatequina en eficacia, formando
dímeros y polímeros grandes en los cuatro tratamientos (Figura 5
(segundo)). Es un sustrato útil para la polimerización enzimática, y
los tratamientos E3 y E4 produjeron los mejores resultados debido al pH
medio. Con los tres sustratos probados, E3 y E4 fueron
más eficaz para la formación de agregados moleculares; en efecto,
produjeron 15 veces más que sus monómeros. Los los polímeros más grandes se
detectaron en presencia de 10 mM
tampón de fosfato sódico a pH 6,5 (figura 5 (b)), que
favoreció la actividad enzimática porque su pH es óptimo
para PPO (Arnnok et al., 2010). El pH influye en la conversión
y el peso molecular de los oligómeros obtenidos (Ikeda,
Sugihara, Uyama, & Kobayashi, 1998). Pocos datos están disponibles
sobre el efecto del pH sobre la estructura de la estructura sintetizada
polímeros. El pH ácido promoverá los enlaces C-C, mientras que el C-O
los enlaces se favorecen a pH básico (Kobayashi & Higashimura,
2003). La naturaleza del disolvente afecta tanto a la posición
(Intra, Nicotra, Riva, & Danieli, 2005) y el tipo de
(Mita, Tawaki, Uyama y Kobayashi, 2003, Ncanana,
Baratto, Roncaglia, Riva, y Burton, 2007).
El sustrato menos eficaz para la polimerización de PPO
era la quercetina porque formaba dímeros en los cuatro
(Figura 5 (c)). Un polímero de orden de 5000 nm
detectado en E1 y E2. Sin embargo, en E3 sólo dímeros, y no
polímeros, se formaron (Figura 5 (c)), que también fue el caso
en E4 (datos no mostrados). El uso del tampón de fosfato sódico
a pH 6,5 (particularmente adecuado para PPO) se esperaba que
producen una reacción enzimática más estable y favorecen la polimerización.
Sin embargo, esto no ocurrió ya que la quercetina
tenía baja afinidad por PPO, a pesar de que había producido una
pequeño número de polímeros en pruebas preliminares. La eficiencia
de la transformación enzimática depende estrictamente de la
químicas del sustrato fenólico tales como el
número de grupos OH, naturaleza y peso molecular
de los sustituyentes y su posición en el anillo aromático
(orto o para) (Mohamed & Latifa, 2012).
3.7. Actividad antioxidante en los polímeros obtenidos
De los tres sustratos comerciales puros probados, la quercetina
tenía la mayor capacidad antioxidante, seguido de cerca por
epicatequina y finalmente ácido ferúlico (Tabla 3). Compuesto fenólico
la capacidad antioxidante se atribuye al número de
grupos hidroxilo unidos a la molécula (Muñoz et al.,
2007; Oliveras & López, 2005). Esto concuerda con el presente
resultados, ya que el ácido ferúlico tiene el menor número de
grupos de los tres compuestos fenólicos probados y se exhibieron
la capacidad antioxidante más baja. Quercetina y epicatequina
tienen un número similar de grupos hidroxilo y estos
las moléculas se realizaron de manera similar. Sin embargo, el grupo carbonilo
en la posición de anillo cuatro del grupo pirano proporciona quercetina
mayor capacidad antioxidante (Cai, Sun, Xing, Luo, & Corke,
2006), y explica su mayor valor en comparación con epicatequina
(Tabla 3).
La mayor actividad antioxidante en la polimerización de epicatequina
con PPO se observó en el tratamiento E2
(135.539 mmol de TEAC / g de fenol), seguido de E4, E1 y E3.
Decamers y octamers fueron detectados en E2 y E4, y
los polímeros del orden de 5000 nm estaban presentes en E4. los
los polímeros formados usando epicatequina exhibían propiedades duales,
como los formados a partir de ácido ferúlico y quercetina.
Con ácido ferúlico, cada uno de los cuatro tratamientos expuestos
diferentes capacidades antioxidantes, siendo el más alto
fenol puro. Los dımeros, trımeros y polımeros identificados
tenían diferentes propiedades dependiendo del producto formado
en la reacción enzimática. La capacidad antioxidante fue la más alta
en E4 (91,256 mmol de TEAC / g de fenol), seguido de E1, E3 y
E2. A lo largo de la cinética en E4, se realizaron 14 lecturas de
grandes polímeros de más de 5000 nm con el fin de
ocurrieron en cantidades mayores que en los otros tratamientos.
Sin embargo, este tratamiento también tuvo menos lecturas de dímeros
y trímeros en comparación con los otros tratamientos (Tabla 3).
Polimerización de la quercetina por pimiento PPO producido
dímeros y trímeros que contribuyeron a incrementar su efecto antioxidante
capacidad superior a la del fenol puro. Tratamiento E2 exhibieron la mayor capacidad
antioxidante (78.360 mmol
TEAC / g de fenol), seguido de E4, E3 y E1 (Tabla 3).
Se observaron polımeros mayores con un diámetro de 5362 nm
en 6 lecturas en E2, y los dímeros se detectaron en 10 lecturas.
La capacidad antioxidante de E4 confirma el papel de los dímeros en
esta capacidad ya que tenía el mayor número de dímeros y
la segunda más alta capacidad antioxidante. Los polímeros
formado a partir de la quercetina aparentemente tenía una naturaleza dual,
aumentar la capacidad antioxidante en E2 y disminuirla en
E1. Tal vez esta diferencia se deba a la liberación de hidroxilo
durante la formación del polímero, lo que favorecería la formación de antioxidantes
capacidad. Desentis-Mendoza et al. (2006) propuso un
posible mecanismo de reacción para la polimerización enzimática
de polifenoles en los que los productos con grupos hidroxilo
se forman los conteos de grupos. Ellos reportaron altos niveles de antioxidantes
los valores de actividad que comienzan en quercetina de bajo peso molecular
agregados moleculares.
Cada sustrato utilizado en la polimerización enzimática con
pimiento PPO exhibió agregados moleculares con diferentes
características y capacidades antioxidantes. Estas diferencias
fueron causadas por el pH del medio, la cantidad de
sustrato, y el medio de reacción; además, cada substrato
especificidad es diferente. La magnitud de estos efectos
depende del grado de polimerización o de la sintetización
oligómeros (Anthoni et al., 2008, 2010).
4. Conclusión
El PPO del pimiento es generalmente prometedor para la polimerización
de fenoles y da como resultado algunos productos con alto contenido en antioxidantes
actividad. Sin embargo, se necesitan más investigaciones para
comprender el proceso y sus productos y desarrollar posibles
usos para ellos. Los disolventes utilizados durante la polimerización
reacción también afecta a la estructura de los polímeros y
selectividad de la reacción. Este comportamiento es variable según
a la naturaleza de los sustratos. El injerto oxidativo de los flavonoides
a los polímeros está disfrutando de una mayor atención especialmente
en textiles funcionalizados o aplicaciones alimentarias.