I.

Alat dan bahan

Alat Bahan
Autoklaf Mikroba uji : Staphylococcus aureus dan
Escherichia coli
Cowan petri Medium : Nutrien Broth, nutrient
agar,dan Nacl 0.9%
Inkubator Antibiotic : Ampisilin Na, Tetrasiklin
Hcl, dan Kloramfenikol
Jarum Ose bundar Cakram kertas
Labu erlenmeyer Kapas berlemak
Labu takar Benang
Piper Volume Aluminum foil
Piper Mikro
Pinset
Tabung reaksi
Vortex
Gelas ukur

II. Prosedur
A. Persiapan praktikum
1. Sterilisasi alat dan media pertumbuhan bakteri.

Sterilisasi alat-alat gelas yaitu labu ukur, gelas ukur, cawan petri, tabung reaksi,
pipet volume, dan labu Erlenmeyer dicuci dan ditutup dengan kertas untuk cawan petri
dan yang memiliki lubang ditutup dengan kapas berlemak yang ditutup dengan kain
kasa dan alumunium foil. , dan media pertumbuhan bakteri dilakukan dengan cara
panas lembab menggunakan Autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit. Sedangkan
untuk alat tertentu seperti jarum ose dapat disterilisasi dengan cara difiksasi pada nyala
api bunsen.

2. Penyiapan media pertumbuhan bakteri

Nutrien agar (NA) dibuat dengan melarutkan 23 gram serbuk NA dalam labu
erlenmeyer dengan air suling sebanyak 1000 ml. Nutrient broth (NB) dibuat dengan
melarutkan 8 gram serbuk NB dalam air suling steril sebanyak 1000 ml dalam labu
erlenmeyer. Kemudian media masing-masing dipanaskan hinges larut. Selanjutnya
labu Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan kain kasa serta alumunium foil pada bagian
atasnya lalu disterilisasi dengan autoklaf.

3. Penyiapan bakteri uji

Bakteri Staphylococcus aureus dan E. Coli diinokulasikan pada media agar

miring (NA) dan selanjutnya diinkubasi pads suhu 37oC selama 24 jam.

4. Penyiapan perhitungan konsentrasi antibiotika

Ampisilin, tetrasiklin dan kloramfenikol dibuat pengenceran dengan berbagai

variasi konsentrasi. Untuk metode difusi agar dibuat konsentrasi 1000 µg/ml, 500
µg/ml, 250 µg/ml, 100 µg/ml, 50 µg/ml, 25 µg/ml, 10 µg/ml, dan 1 µg/ml dan untuk
pengenceran agar konsentrasinya 0,03 dan 0.06 µg/ml.

B. Pengujian aktivitas antibakteri

1. Pensuspensi bakteri

Biakan bakteri S. Aureus dan E.Coli dikumpulkan dan dimasukan kedalam 10

ml aqua steril. Lalu dikocok dengan vortex hingga homogen.

2. Pembuatan larutan antibiotik

Antibiotik ampisilin, tetrasiklin, dan kloramfenikol dibuat dengan konsentrasi.

Untuk metode difusi agar dibuat konsentrasi 1000 µg/ml, 500 µg/ml, 250 µg/ml, 100
µg/ml, 50 µg/ml, 25 µg/ml, 10 µg/ml, dan 1 µg/ml dan untuk pengenceran agar
konsentrasinya 0,03 dan 0.06 µg/ml.

3. Pengujian aktivitas antibakteri dengan metode difusi agar.

Suspense bakteri sebanyak 1 ml dimasukkan kedalam cawan petri. Lalu,

sebanyak 31 ml NA dicairkan dan dibiarkan hingga mencapai suhu 45-53oC, kemudian
dituangkan kedalam cawan petri steril. Campuran lalu diputar hingga homogen dan
dibiarkan menjadi padat. Sebanyak 4 buah cakram steril diletakan pada tiap lempeng
agar dalam cawan petri steril. Setiap cakram ditetesi dengan 10 µg/ml larutan
antibiotik. Dibiarkan selama 1 jam, lalu dimasukan kedalam inkubator pada suhu 37oC
selama 18- 24 jam. Setelah diinkubasi diamati diameter hambat yang terbentuk
disekitar cakram kertas. Dibuat kurva hubungan konsentrasi atau log konsentrasi
dengan diameter hambatan antibiotik yang digunakan.

4. Pengujian aktivitas antibakteri dengan metode pengenceran agar

Antibiotika sebanyak 1 ml dimasukkan kedalam cawan petri dengan

konsentrasi 0.03 dan 0.06 µg/ml. Lalu, sebanyak 31 ml NA dicairkan dan dibiarkan
hingga mencapai suhu 45-53oC, kemudian dituangkan kedalam cawan petri steril. Satu
cawan petri hanya untuk satu konsentrasi. Campuran lalu diputar hingga homogen dan
dibiarkan menjadi padat. Kemudian suspensi bakteri diteteskan diatas media sebanyak
10 µg/ml, lalu digores dengan jarum ose bundar Dibiarkan selama 1 jam, lalu
dimasukan kedalam inkubator pada suhu 37oC selama 18- 24 jam. Setelah diinkubasi
diamati diameter hambat yang terbentuk disekitar cakram kertas.