Extracción, cuantificación y determinación de proteínas solubles de

saccharomyces sereviciae y litopenaes vannamei

Resumen
Se realizó la extracción, cuantificación y separación de muestras de levadura
(saccharomyces sereviciae) y camarón (litopenaes vannamei), para determinar la
presencia de proteínas y cuantificarlas.
La extracción de las proteínas solubles se llevó a cabo mediante una disrupción
mecánica de las muestras con un buffer de soporte, las cuales se cuantificaron
mediante 3 métodos (biuret, Bradford y lowry), a las muestras se les realizo una
electroforesis SDS-PAGE para separar y confirmar la presencia de proteínas en la
muestra.
Se logró realizar la cuantificación de proteínas por medio del método de lowry, el
cual se utilizó gracias a sensibilidad para la concentración buscada
Al realizar la electroforesis se logró determinar la presencia de proteínas en las
muestras resultantes de la extracción.
Introducción cultivable comparado con organismos
pluricelulares, las principales
La extracción de proteínas es una de
proteínas presentes son enzimas
las técnicas más utilizadas en los
encargadas de su metabolismo y las
laboratorios de bioquímica, ya que
proteínas estructurales.
esta es uno de los métodos más
utilizados en el análisis molecular el Litopenaeus Vannamei es un
cual nos da la pauta para la organismos pluricelular (crustáceo)
aplicación en estudios de que se encuentra principalmente en
investigación específicos el océano pacifico, ya que este
especialmente en técnicas de organismo está constituido por
biología molecular. En esta práctica diversos sistemas, se realizó la
se realizó la extracción de proteínas extracción de tejido muscular el cual
solubles de levadura (Saccharomyces principalmente se constituye por
Sereviciae) y de musculo de camarón proteínas sarcoplasmaticas,
(Litopenaeus Vannamei). Las estromales y miofibrilares, de las
proteínas más solubles son las cuales principalmente se pueden
proteínas con estructura cuaternaria encontrar miosina
globular.
Para realizar la extracción de las
Saccharomyces sereviciae es un muestras primeramente se realiza
organismo (hongo) unicelular una ruptura celular por medio de una
eucariotico, de forma elíptica el cual disrupción mecánica, puede ser por
debido a su simplicidad es fácilmente
medio de vortex, lisis celular,
agitación mecánica, etc.
Es necesario utilizar buffers para el
soporte del pH, y la centrifugación
para la diferenciación celular.
Para la cuantificación proteica es
necesario utilizar uno de los métodos
establecidos aprovechando las
propiedades de la materia, en este
caso se utilizaran métodos de análisis
por colorimetría aprovechando la
dispersión de la luz, por lo cual se
puede determinar mediante la
absorbancia de diferentes muestras,
realizando curvas patrón con
proteínas de albumina sérica, se
utilizaron los métodos de biuret, el
cual utiliza un reactivo de Sulfato de
Cobre diluido en álcali fuerte, donde
los iones de Cu+2 forman complejos
al unirse al grupo OC-NH de los
aminoácidos, Bradford, utiliza un
colorante hidrofóbico, Comassie Blue
G-250, cuyas disoluciones acuosas
en presencia de ácido fosfórico tiene
un color pardo. Al encontrarse con la
proteína, forma un compuesto de
adsorción azul entre los residuos
aminoacídicos básicos y el colorante,
y lowry se basa en una reacción
redox, donde los iones de Cu+2
forman complejo de coordinación con
los enlaces peptídicos. El reactivo de
Folin se reduce por grupos fenoles de
la proteína a un complejo azul
obscuro en presencia de aminoácidos
aromáticos, particularmente Tirosina
y Triptófano.
Para la separación de las proteínas y
su identificación fue necesario
realizar una electroforesis (migración
de las proteínas sometiéndolas a un
campo eléctrico) en medio
desnaturalizado (SDS-PAGE)
mediante la incorporación a la
muestra de el detergente sodio
dodecil sulfato sódico (SDS) el cual
desnaturaliza las proteínas
dejándolas en su estructura primaria.
Metodología
Se llevó a cabo una extracción de
proteínas de las muestras, mismas
que fueron cuantificadas, las cuales
se llevaron a una electroforesis para
confirmar la presencia de proteínas, y
poder dilucidar sobre su estructura.
Para la muestra de levadura
(Saccharomyces sereviciae) se
realizó la extracción de un cultivo en
un medio YPD, del cual se tomó 1 mL
de levadura se llevó a un tubo de
eppendorf y se centrifugo
(Microcentrífuga de mesa Hermle
z233 M-2) a 10000 rpm por 5 min, se
desechó el medio acuoso y se agregó
1 mL al tubo llevándolo a centrifugar
a 10000 rpm durante 5 min. A la
muestra se le agregaron 1/3 del
volumen de perlas de vidrio
(ElectronMicroscopy Science, 0.5
Dia) y 200 µL de buffer Tris 50 mM
pH 8.2. Seprocedió a realizar una
disrupción mecánica por medio de
pistilo generando 8 intervalos de
enfriamiento y de ruptura celular de 1
minuto, para después realizar 2
sesiones de centrifugacióna 13000
rpm por 5 min con un enfriamiento de
5 min. Se realizó la extracción del
medio acuoso llevándolo a un tubo
eppendorf, el cual contenía las
proteínas de levadura.
En el caso de la muestra de camarón
(Litopenaeus Vannamei), se fracciono
una porción del tejido con un bisturí
permitiendo tomar una muestra
aproximada de 50 mg, la cual se llevó
a un tubo eppendorf a la cual se le
adiciono 300 µL de buffer tris 50 mM
pH 8.2 y 1/3 del volumen de perlas
de vidrio (ElectronMicroscopy
Science, 0.5 Dia) por medio de un
pistilo se le realizo una disrupción
mecánica en 8 intervalos de 1 min.
Con enfriamiento de 1 min por cada
disrupción, la muestra se centrifugo a
10000 rpm por 5 min, después se
mantuvo en baño de hielo durante 5
min para realizar una centrifugación a
12000 rpm por 5 min. Se extrajo la
solución acuosa la cual contenía las
proteínas y se puso en un tubo
eppendorf.
Para realizar la cuantificación de las
muestras por los métodos ya
establecidos se realizó las curvas
patrón de cada método, empezando
por la preparación de la solución
patrón de albumina sérica bovina a
una concentración de 1 mg/mL. Las
preparaciones de la muestra depende
del método para el caso de los
métodos de Bradford y lowry se
llevaron a cabo las diluciones con
respecto de acuerdo a la tabla 1.1
(anexo), para el método de Bradford
se tomaron 200 µL de cada dilución y
se les agrego 800 µL de reactivo de
Bradford, después de 5 min de
incubación las muestras se leyeron
en un espectrofotómetro a 595 nm, la
concentración de proteína se graficó
contra la absorbancia para obtener la
curva patrón fig. 1.1 (resultados).
Para la curva patrón de lowry se
tomaron 200 µL de cada dilución y se
le agrego 1 mL de solución D (96%
de Na2CO3 en NaOH .2 N, 2% de
Cu2SO4 al 2% y 2% de tartrato de K
y Na al 4%) después de una
incubación de 10 min. Se adicionaron
100 µL de reactivo de Folin se incubo
en obscuridad durante 30 min, las
muestras se leyeron en un
espectrofotómetro (...,) a 750 nm, la
concentración se graficó contra
absorbancia fig. 1.2. Para la curva
estándar de biuret se realizaron se
prepararon las muestras conforme a
la tabla 1.2 (anexo) se dejó reposar
durante 30 min y se leyeron en
espectrofotómetro a 550 nm, se
graficó concentración contra
absorbancia. Serealizó la regresión
lineal de cada gráfico.
Para la lectura de las muestras de
levadura y camarón se prepararon
diluciones 1:100 (se tomaron 15 µL
de extracto y se aforaron a 1500 µL
con agua destilada) en tubos
eppendorf. Las diluciones fueron
tratadas como las muestras de las
curvas patrón de cada uno de los
métodos.
Una vez determinada la
concentración se llevó a cabo la
preparación del equipo y de los geles
de poliacrilamida (de corrida al 12% y
de empaquetamiento al 4%) para la
electroforesis. Se montó el equipo y
se preparó el gel de corrida (12%) en
un tubo falcón de 15 mL adicionando
3.5 mL de agua, 2.5 mL de buffer de
separación pH 8.8, 4 mL de
acrilamida/bisacrilamida, 100 µL de
SDS al 10 %, 50 µL de PSA al 10%, 5
µL de TEMED vaciando el gel en el
Fig. 1.1
soporte rápidamente, se dejó
polimerizar durante 45 min, se
preparó el gel de empaquetamiento Curva Estandar Bradford
(4%) en un tubo falcón de 15 mL 3
adicionando 6.1 mL de agua, 2.5 mL y = 2.5
0.0041x + 0.4942

absorbancia
de buffer de separación pH 6.8, 1.3 R²
2 = 0.8141
mL de acrilamida/bisacrilamida, 100 1.5
µL de SDS al 10 %, 50 µL de PSA al 1
10%, 5 µL de TEMED vaciando 0.5
rápidamente en el soporte, se puso el 0
peine y se dejó polimerizar durante 0 100 200 300 400 500 600
45 min. concentracion (g/ml)

Se prepararon las muestras para la

electroforesis para el camarón se
diluyo 1:2 (25 µL de extracto y 25 µL
de agua destilada) y para la levadura
se tomó directamente de la
Curva Patron Lowry
extracción, de estas muestras se
tomaron 37.5 µL y se le agregaron 1.2

12.5 µL de buffer de disociación, se 1

y = 0.0018x + 0.0804
Absorbancia

llevaron a baño maría durante 5 min. 0.8 R² = 0.976

Las muestras se cargaron en los 0.6
geles dentro de las cámaras de 0.4
electroforesis las cuales fueron 0.2
llenadas con buffer de reservorios 0
(1X). Seajustó el voltaje a 100 v y se 0 100 200 300 400 500 600
dejó correr durante 90 min. Se concentracion
desmonto la cámara y se retiró el gel
el cual se llevó a un soporte en el
cual se llenó de solución de teñido
(0.25% de azul brillante, 45% de Fig. 1.2
metanol y 10% de ácido acético)
durante 20 min, se decantó la
solución de teñido y se llenó el
soporte del gel con solución de
desteñido (7.5% ácidoacético, 5%
metanol) se dejó durante 24 horas, el Electroforesis
gel se lavó con agua destilada.

Resultados
Fig. 2.1 2 1 M

Discusión
Se descartó la gráfica y la lectura de
la muestra por el método de bureta
debido a que los datos que se
arrojaron de las lecturas no
generaban una gráfica que se
encontrara dentro de una relación
lineal y se cree que fue debido al
estado del reactivo de biuret al
momento de la realización de la
curva.
Los resultados que se obtuvieron con
respecto a la concentración de las
muestras corresponde a lo esperado
debido a que se esperaba una
concentración mayor de proteínas en
el extracto de camarón que en
levadura debido a que el camarón es
un organismo pluricelular con
morfología mucho más compleja el
cual tiene diferentes constituyentes
proteicos los ya mencionados debido
a que la extracción se realizó de un
tejido muscular en cambio la levadura
la cual es un organismo de unicelular
y con morfología mucho más simple
reflejo una concentración más baja de
proteínas.
Para la electroforesis fue necesario la
elección de uno de los resultados de
los métodos de cuantificación, para lo
cual se eligió el resultado de lowry
debido a su sensibilidad a péptidos y
proteínas de bajos pesos
moleculares.
Al realizar la electroforesis se agregó
una cantidad de TEMED de mas (45
microlitros) a la preparación del gel
de poliacrilamida al 12 %, lo cual
genero una polimerización mucho
más rápida y compacta, en tanto no
influyo en la corrida de las muestras
proteicas.
Como se puede observar en las
muestras 1 (camarón) y 2 (levadura)
de la fig. 2.1 Es notoria la sección de
área que abarca la banda (muy
anchas) debido a que la
concentración de las muestras estaba
muy cargada de proteína. Aun así es
posible notar las bandas de proteínas
aunque no es posible determinar en
base al marcaje de peso molecular la
presencia de actina y miosina en
levadura, la banda para de camarón
si demuestra la presencia de
proteínas como actina y miosina
debido a las bandas que se empareja
en el marcaje de peso molecular.
Un factor que pudo influir en la
corrida para que no se notaran las
bandas del marcaje de peso
molecular fue el tiempo, debido a que
solo se dejó correr las muestras
durante 90 minutos. Pero en base a
lo obtenido se pudo interpretar de
manera favorable los resultados.

Conclusión
En base a lo establecido se
obtuvieron los resultados esperados,
se extrajo un concentrado de
proteínas de levadura y camarón, a
los cuales se les determino la
concentración por medio del método
de lowry, los cuales son ,
para camarón y levadura,
respectivamente. Al realizar la
electroforesis fue notorio la presencia
de proteína debido a las bandas que
se resaltan después del marcaje.
Referencias
Cox, M. y Nelson, D. (2007). Principios de
bioquímica (Quinta edición). Barcelona: Ediciones
Omega

http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
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http://tesis.uson.mx/digital/tesis/docs/1062
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Bioquímica, libro con aplicaciones clínicas,

T.M. Devlin, 2da edición, editorial reverte,
Barcelona 1990.