SEPARACIÓN DE LOS PIGMENTOS DE LA HOJA DE ESPINACA MEDIANTE

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Y EN COLUMNA

Resumen
En el laboratorio de la universidad surcolombiana de Neiva se realizó los análisis para la separación
de pigmentos presentes en una hoja de espinaca. Se trabajó en dos laboratorios usando técnicas de
cromatografía diferentes. La primera técnica se realizó mediante cromatografía en capa fina, donde se
mezcló etanol y éter con el extracto de espinaca, después se transfirió a un tubo de ensayo y se le adiciono
sulfato de sodio con el fin de separar la fase orgánica, luego se decantó y con un tubo capilar se tomó
muestras de la fase orgánica para hacer el proceso de cromatografía en capa fina. Se usó como fase móvil
hexano-acetona y como fase estacionaria gel de sílice; por último, se realizó los cálculos para hallar Rf. La
segunda técnica se realizó mediante la técnica de cromatografía columna. En este laboratorio se revolvió
gel de sílice en polvo junto con cloroformo y después se puso en la columna del montaje, luego se adiciono
5 gotas de la fase orgánica del extracto de espinaca y se adiciono más cloroformo, el extracto o la muestra
que se recogió fue de color amarillo, para la extracción del otro extracto se usó como fase móvil el metanol
y la muestra que se recogió fue de color verde. Por último, se procedió analizar los resultados que arrojó
cada técnica cromatografía usada.
Palabras Claves: Disolvente, fase móvil, fase estacionaria, cromatografía de capa fina,
cromatografía de columna, eluyente
Abstract
The analysis for the separation of pigments present in a spinach leaf was carried out in the
laboratory of the Surcolombiana University of Neiva. We worked in two laboratories using different
chromatography techniques. The first technique was performed by thin layer chromatography, where
ethanol and ether were mixed with the spinach extract, then transferred to a test tube and sodium sulfate
was added in order to separate the organic phase, then decanted and with a capillary tube samples of the
organic phase were taken to make the thin layer chromatography process. Hexane-acetone was used as the
mobile phase and silica gel as the stationary phase; finally, the calculations were made to find Rf. The
second technique was performed using the column chromatography technique. In this laboratory, powdered
silica gel was stirred together with chloroform and then placed in the assembly column, then 5 drops of the
organic phase of the spinach extract were added and more chloroform, the extract or the sample that was
collected, was added. it was yellow, for the extraction of the other extract, the methanol was used as the
mobile phase and the sample that was collected was green. Finally, we proceeded to analyze the results of
each chromatography technique used.

1
 Keywords: Solvent, mobile phase, stationary phase, thin layer chromatography, column
chromatography, eluent.
Introducción
“La Cromatografía es una técnica de
separación en la que los componentes de una
muestra se distribuyen en dos fases: una fase
estacionaria de gran área superficial, y una
fase móvil” (¿“Qué es la cromatografía?”,
2017) El botánico ruso Miguel Tswett en
1906 fue la primera persona que definió la
cromatografía como “Método en el cual los
componentes de una mezcla son separados en
una columna adsorbente dentro de un sistema
fluyente” (“Métodos de cromatografía”,
2007). Esta técnica tiene varios tipos de
cromatografías, en el laboratorio se trabajó
Ilustración 1. Metodología de la práctica de cromatografía
con dos de ellas: Cromatografía de capa fina
y cromatografía de columna; la primera
consiste en que “las sustancias se reparten de
una forma diferencial en una fase estacionaria
y una fase móvil, la fase estacionaria se
extiende sobre un soporte inerte y la fase
móvil se desplaza por esta capa fina (Soporte
Inerte)” (Cifuentes, 2013), y en la segunda
técnica “se utiliza una columna de vidrio
vertical que se llena con un soporte
sólido aislando los compuestos de la mezcla”
(Angurell et al, 2014).
Metodología
2
 Resultados más liquida a un tubo de ensayo haciendo uso
Cuando se macero la espinaca en el de una pipeta.
mortero, se pudo observar que esta
desprendió un pigmento aparentemente
verde, que se quedó adherido a las paredes del
mortero.

Ilustración 4. Mezcla de la espinaca con los dos

disolventes en el tubo de ensayo

Una vez hecho lo anterior se le

Ilustración 2. Espinaca macerada en el mortero
Luego que se maceró la espinaca y se
obtuvo el anterior resultado, se procedió a
agregarle 4 mililitros de éter y 2 mililitros de
etanol a la espinaca.
adicionó un pequeño volumen de éter a la
solución en el tubo de ensayo, después se
agito suavemente el tubo y se dejó reposar
por cinco minutos. Cuando transcurrió ese
tiempo se pudo observar que la solución se
había dividido en dos: En la superficie era
completamente líquida y de un color verde
oscuro, y la parte del fondo era más más
espesa y de un color más grisáceo.

Ilustración 3. Espinaca macerada luego de agregarle

etanol y éter

Luego de agregarle la mezcla de los

dos disolventes a la espinaca se agito
suficiente la mezcla para luego pasar la parte Ilustración 5. Solución en el tubo de ensayo luego de
haberle agregado el hexano y el etanol

3
 Luego con ayuda de una pipeta se
trasvasó solo la solución que estaba en la
superficie del tubo de ensayo a un beaker.

Ilustración 7. Placa cromatografía de silicagel con los

puntos de la fase orgánica

Una vez se le adicionó la disolución

Ilustración 6. Solución de espinaca en el beaker
Hasta ese momento solo se estaba
preparando la fase orgánica (o
estacionaria), para después ser utilizada en la
cromatografía de capa fina y luego en la
cromatografía de columna.
Cromatografía de capa fina.
Para llevar a cabo esta prueba primero
se tomó una placa cromatografía de silicagel
y vidrio y se le trazo una línea en el extremo
superior (frente del disolvente) e inferior
(punto de origen) de 0.5 centímetros, en cada
una de esas líneas se hizo dos puntos a la
misma distancia para ambos casos. Después
con la ayuda de un capilar se le aplico encima
de los puntos de la línea inferior (punto de
origen) dos pequeñas gotas de la fase
orgánica que fue extraída de la espinaca en el
procedimiento mencionado anteriormente.
orgánica de la espinaca a la cromatoplaca de
silicagel, se debió esperar unos minutos en lo
que esta se secaba para evitar posibles errores
fase en el trascurso de la prueba. Por aparte se le
agregó 0.7 mililitros de hexano y 0.3
mililitros de acetona a un beaker vacío y
posteriormente se puso la placa de silicagel
con la muestra orgánica de tal manera que
quedara un poco recostada en sus paredes
para finalmente tapar el beaker.
Ilustración 8. Cromatoplaca dentro del beaker tapado
y con un pequeño volumen de hexano

4
 Pasado un tiempo luego de haber amarillo muy claro que estaban de últimos en
puesto la cromatoplaca en el beaker se la placa cromatografía.
comenzó a observar como los pigmentos de
la disolución orgánica se iban separando uno
de otros lentamente y como el hexano fue
subiendo por la placa hasta el frente del
disolvente. Esos pigmentos en total fueron de
cuatro tipos: Uno de color naranja, uno
verdeazulado, otro de color amarillo y
finalmente uno de color verde.

Ilustración 10. Placa cromatográfica después de que

el hexano llegó al frente del disolvente

Cromatografía de columna
Para este proceso primero se debió
armar un montaje con una columna
cromatográfica, una base universal y una
pinza de nuez.
Ilustración 9. Cromatoplacas luego que transcurrió
algo de tiempo

Finalmente se pudo ver cómo

quedaron los pigmentos distribuidos en la
placa cromatografía una vez que el hexano
llego hasta el frente del disolvente, primero
quedó el pigmento de color naranja
exactamente en la línea superior, luego en la
mitad, le siguió el pigmento de color
verdeazulado, siguiente a ese un pigmento de
color amarillo, después un pigmento de color
verde claro o lima y finalmente se pudo Ilustración 11. Montaje para la cromatografía de
columna
evidenciar otros dos pigmentos de un color

5
 Luego de eso, se colocó en la columna moviendo poco a poco hacia abajo en la
cromatografía una pequeña mota de algodón columna.
y se empujó hasta que esta quedo en la parte
final de la columna (antes de la llave),
seguido a esto se adicionó una mezcla entre
gel de sílice (en mayor cantidad) y
cloroformo (en menor cantidad que el
anterior) dentro de la columna hasta llenarla
hasta un poco más de la mitad; después se
dejó secar un poco la columna y encima del
gel de sílice se le agregó cinco gotas de la
disolución orgánica de la espinaca, que ya se Ilustración 13. Pigmento amarillo desplazándose por
la columna cromatográfica
venía trabajando, y seguido a esto se adicionó
Cabe destacar que cada vez que se
más cloroformo.
agotaba el cloroformo en la superficie de la
columna, era necesario volverle a adicionar
más volumen de este para evitar que la
disolución orgánica se sacara. Finalmente se
recogió el pigmento amarillo en un tubo de
ensayo.

Ilustración 12. Columna cromatografía con la muestra

de disolución orgánica añadida

Al poco tiempo que se adicionó el

cloroformo sobre la disolución orgánica, se
pudo observar que primero se fue separando Ilustración 14. Recolección del pigmento amarillo
luego de haber salido de la columna cromatografía
un pigmento de color amarillo, que se fue

6
 Luego de haber recolectado todo el
volumen de pigmento amarillo, se procedió
agregarle metanol a la columna
cromatografía, fue en este momento cuando
el pigmento de color verde comenzó a
moverse a través de la columna.
Finalmente, cuando el pigmento llegó
hasta la llave de la columna se procedió a
colectar todo el volumen de dicho pigmento
en un tubo de ensayo.

Ilustración 17. Recolección del pigmento verde en un

tubo de ensayo
Ilustración 15. Columna cromatografía luego de
haberle agregado el metanol sobre la disolución
En la siguiente imagen se puede observar
orgánica
la cantidad de pigmento amarillo y verde
De igual manera que en el
obtenido después del proceso de cromatografía de
procedimiento anterior, el pigmento verde se
columna.
fue desplazando por la columna
cromatografía lentamente (más lento que el
pigmento amarillo).

Ilustración 18. Cantidad de pigmento amarillo y

verde recolectados después del proceso de
Ilustración 16. Pigmento verde desplazándose por la cromatografía de columna
columna cromatografía

7
 Discusión de resultados
En la primera parte de la prueba para
obtener la disolución orgánica de espinaca,
fue necesario machacar suficientemente las
hojas de dicha planta para “poder obtener una
disolución lo más homogénea posible y con
el mínimo de partículas sólidas que se
pudiera, con el propósito que el proceso de
cromatografía fuera un poco más fácil y con
menor margen de error” (Romero, 2016);
también fue importante agregarle algún tipo
de disolvente o eluyente, como lo fue la
mezcla de éter (para los pigmentos poco
polares) y etanol (para aquellos que eran más
polares), para que todos los tipos de
pigmentos que se encontraban dispersos en el
mortero, después de haber macerado las hojas
de espinaca, fueran solubilizados y pudieran
luego ser extraídos y trasvasados al tubo de
ensayo. Una vez en el tubo, se le adicionó
más éter a la disolución para extraer lo más
esencial de los pigmentos, para así finalmente
obtener la fase orgánica que luego fue
nuevamente trasvasada con la ayuda de una
pipeta a un beaker, de donde se sacó la
muestra que se utilizó en las siguientes
pruebas cromatografías.
Cromatografía de capa fina
La cromatografía de capa fina se base
en que “la muestra a analizar se deposita
cerca de un extremo de una lámina de plástico
o aluminio que previamente ha sido
recubierta de una fina capa de adsorbente
(fase estacionaria). Entonces, la lámina se
coloca en una cubeta cerrada que contiene
uno o varios disolventes mezclados (eluyente
o fase móvil). A medida que la mezcla de
disolventes asciende por capilaridad a través
del adsorbente, se produce un reparto
diferencial de los productos presentes en la
muestra entre el disolvente y el adsorbente”.
(“Cromatografía de capa fina”, 2016)
Para esta prueba se utilizó la
disolución orgánica de espinaca y se utilizó
una cromatoplaca de silicagel unido a una
placa de vidrio; “los dos adsorbentes (fase
estacionaria) más ampliamente utilizados son
el gel de sílice (SiO2) y la alúmina (Al2O3),
ambas de carácter polar. La alúmina anhidra
es el más activo de los dos, es decir, es el que
retiene con más fuerza a los compuestos; por
ello se utiliza para separar compuestos
relativamente apolares (hidrocarburos,
haluros de alquilo, éteres, aldehídos y
cetonas). El gel de sílice (que fue el utilizado
en esta prueba), por el contrario, se utiliza
para separar sustancias más polares (en el
cual entra los pigmentos vistos al final de la
prueba). El proceso de adsorción se debe a
interacciones intermoleculares de tipo
dipolo‐dipolo o enlaces de hidrógeno entre el
soluto y el adsorbente. El adsorbente debe ser
8
inerte con las sustancias a analizar y no actuar
como catalizador en reacciones de
descomposición (por eso era de suma
importancia utilizar herramientas y utensilios
totalmente secos, además de que por ese
mismo motivo no se utilizó agua para
disolver la fase orgánica)” (“Cromatografía
de capa fina”, 2016).
En el transcurso de la prueba los
pigmentos presentes en la fase orgánica se
fueron separando unos de otros en la placa
cromatografía, esto se debe a la polaridad que
posee cada compuesto, el pigmento naranja
fue el primero en ascender y el que quedó en
el eje del disolvente debió tener una polaridad
muy baja porque la mezcla que se le adicionó
al beaker donde se puso la cromatoplaca era
de 0.7 mililitros de hexano (disolvente
orgánico poco polar) y 0.3 mililitros de
acetona (disolvente medianamente polar), es
decir, que el naranja fue el primero en
separarse y subir por la placa porque la fase
móvil era más apolar que polar; los dos
pigmentos que le siguieron (el verdeazulado
y amarillo) fueron de un carácter un poco más
polar que el primero; y finalmente los
pigmentos que quedaron de últimos fueron
mucho más polares (ascendieron por
capilaridad gracias a la acetona, pero como
estaba en menor cantidad que el hexano, hizo
que estos quedaran abajo) que el pigmento
naranja.
“La distribución de los componentes
entre la fase sólida y líquida es determinada,
además de por la polaridad propia de cada
compuesto, por el grado de actividad del
adsorbente (el cual depende principalmente
del grado de hidratación y de la polaridad del
disolvente). El principal factor para controlar
el movimiento de los diferentes compuestos
en un cromatograma es la polaridad del
disolvente. Una lista de los disolventes más
usados en los diferentes tipos de
cromatografía, en orden de polaridad
creciente, se indica en la Ilustración 18.
Entre más polar sea un disolvente, más rápido
es el movimiento de los compuestos y menos
efectiva la separación” (Delgado, 2015).
Ilustración 19. Disolventes más utilizados en la
cromatografía. Imagen aportada por Delgado (2015)
El pigmento naranja que fue el
primero en ascender por la cromatoplaca
tiene por nombre caroteno, “estos son
hidrocarburos isoprenoides, que hacen parte
9
de los carotenoides, que no contienen
oxígeno y están formados por largas
moléculas con un sistema de enlaces
conjugados alternantes, dobles y sencillos,
rematados en cada extremo por un anillo de
ciclohexano insaturado tienen color amarillo-
anaranjado; el beta – caroteno es el pigmento
carotenoide principal que se encuentra en las
hojas de espinaca”. (Vega, 2014).
El pigmento de color verdeazulado
corresponde a la clorofila A y el pigmento de
color verde corresponde a la clorofila B, “la
clorofila es el pigmento verde en la mayoría
de las plantas que está asociado con la
fotosíntesis. El pigmento absorbe toda la luz
de color a excepción de la banda verde, que
se refleja para dar a la espinaca su color de
hoja y tallo característico. "La clorofila a" es
de un fuerte color verde azulado y es
responsable principalmente de la fotosíntesis,
mientras que "la clorofila b" es un pigmento
de color verde y sirve de apoyo
fotosintético”. (Belyeu, 2014)
“Las clorofilas están compuestas por
una porfirina que lleva incorporado un átomo
de magnesio en el centro del núcleo
tetrapirrólico. El ion Mg2+ está coordinado
con los cuatro átomos de nitrógeno centrales,
lo que hace de la clorofila un complejo
extraordinariamente estable. La "cabeza" que
acabamos de describir, está unida a una
"cola", el fitol, que es un alcohol de 20
átomos de carbono. Cabeza y cola se unen a
través de un enlace éster en el que intervienen
el grupo alcohólico del fitol y el grupo
carboxilo de un ácido propiónico que está
unido al anillo IV del núcleo tetrapirrólico.
Existen varios tipos de clorofilas, las más
importantes son la "a", y la "b". La clorofila a
tiene un grupo -CH3 en el anillo II mientras
que la clorofila b tiene un grupo -CHO en esa
misma posición”. (Vega 2014)
Teniendo en cuenta el párrafo
anterior, se puede dar explicación al porque
una clorofila subió primero que la otra, esto
se debe a que la clorofila A posee una
polaridad menor (por la presencia del grupo
CH3 en el segundo anillo), mientras que la
clorofila B tiene una polaridad mucho mayor
(porque tiene el grupo CHO en el segundo
anillo), y pues como la mezcla de disolventes
es mayormente apolar, entonces las
sustancias que poseen una polaridad más baja
suben primero.
El pigmento faltante, el de color
amarillo, es de la xantofila, “estas hacen parte
de los carotenoides y tienen una estructura
muy similar a la de los carotenos, su
diferencia estriba en la incorporación de
oxígeno en los extremos de la molécula
(cuando los carotenoides se oxidan, o
adquieren una molécula de oxígeno, son
10
conocidos como xantofilas). Según el grupo
que se incorpore existen variedades dentro de
las xantofilas, estas son usualmente de color
amarillo”. (Belyeu, 2014).
Contrastando los carotenoides
(carotenos y xantofilas), también se puede
decir que la disposición que tuvieron estos
pigmentos en la placa cromatográfica
dependió de su polaridad, los carotenos al ser
tan apolares (en sus extremos posee un anillo
de ciclohexano insaturado), suben con mayor
rapidez por la placa (por acción de la
capilaridad), mientras que la xantofila al estar
oxidada (presencia de oxígeno en su
composición) posee más polaridad (en parte
gracias a los enlaces carbono – oxígeno que
tiene en su composición), y por ello subió con
mayor lentitud y ocupó el último lugar entre
todos los pigmentos reconocidos (por lo
mismo que la fase móvil o disolvente, era más
apolar que polar).
Cromatografía de columna
Cuando se culminó el proceso de
cromatografía en columna para la
identificación y extracción de los pigmentos
de la espinaca, se pudo colectar dos tipos de
pigmentos uno de color amarillo (en menor
volumen) y otro de un tono verde (cuyo
volumen fue dos veces mayor al anterior),
pero un pigmento quedo retenido en la
superficie de la fase estacionaria y no pasó a
la fase móvil, como se puede apreciar en la
Ilustración 14, ese pigmento era de un color
verde claro, y por esa razón no pudo ser
extraído de la columna cromatografía y
puesto en un tubo de ensayo.
“La cromatografía en una columna de
adsorbente proporciona un medio para la
separación y aislamiento de los componentes
de una mezcla. La muestra se aplica en la
parte superior de la columna y se deja pasar
solvente a través del adsorbente. Este proceso
desarrolla el cromatograma en bandas que
contienen los compuestos individuales; estas
bandas pueden ser eluídas (arrastradas) en
secuencia por adición de más solvente y
recolectadas en fracciones separadas. La
columna se prepara y desarrolla usando el
solvente menos polar que disuelva a la
muestra y que permita el movimiento de los
compuestos a una velocidad práctica.
Generalmente es necesario ir cambiando a
solventes más polares para efectuar la elusión
de los compuestos, dependiendo de los
grupos funcionales que tengan los
componentes de la mezcla. La facilidad de ser
eluído más rápidamente, dependerá de la
menor polaridad de los grupos funcionales,
como se muestra en la Imagen 19”.
(“Separación por cromatografía en columna
de pigmentos vegetales y sus espectros de
absorción”, 2015)
11

Ilustración 20. Velocidades relativas de elución para
diferentes grupos funcionales (“Separación por
cromatografía en columna de pigmentos vegetales y
sus espectros de absorción”, 2015)
“Las sustancias demasiado polares,
como azúcares o aminoácidos, no pueden
separarse de sus mezclas por cromatografía
en columna (puede que esto le dé explicación
al por qué uno de los pigmentos no se
desplazó por la fase móvil de la columna) , ya
que con los adsorbentes anteriormente
mencionados no pueden utilizarse agua o
ácido acético porque, con estos solventes
demasiado polares (es la principal razón de
no utilizarlas durante el proceso
cromatografía de columna), el equilibrio
componentes-adsorbente se desplaza hacia el
de solvente-adsorbente y de ahí al de
componentes-solvente y, de esta manera,
todos los componentes de la mezcla se eluyen
simultáneamente”. (“Separación
cromatografía en columna de pigmentos
vegetales y sus espectros de absorción”,
2015).
Conclusión
Las técnicas de cromatografía
llevadas a cabo durante la práctica de
laboratorio, tanto de capa fina como de
columna, resultaron muy útiles para separar
componentes en una mezcla, esto se vio
evidenciado en el hecho de que permitieron
determinar que la hoja de espinaca posee
distintos pigmentos como los carotenoides
(carotenos y xantofilas) y clorofilas (de tipo a
y b). Mediante la cromatografía de capa fina
se pudo ver, diferenciar y determinar el
número pigmentos presentes de manera
cualitativa (por el color), mientras que con la
cromatografía de columna no solo se pudo
observar los pigmentos, sino separarlos,
extraerlos y posteriormente colocarlos en un
tubo de ensayo; con ello se pudo determinar
que los pigmentos que más se encuentran en
la espinaca son los de la clorofila a (verde
de
azulado) y b (verde), mientras que los otros
pigmentos, como los carotenos (naranja) y
xantofilas (amarillo), se encuentran en menor
volumen. Adicionalmente, con las pruebas
cromatográficas enseñadas anteriormente se
pudo determinar que entre los cuatro
por
pigmentos hallados, el de menor polaridad
fue el caroteno y el de mayor polaridad fue la
clorofila b. Igualmente se puede recalcar la
importancia que tiene la cromatografía,
porque no solo le sirve al ser humano como
12
un proceso para identificar los diversos noviembre del 2017, de:
compuestos que posee una planta, sino que https://www.uam.es/docencia/jppid/d
también puede ser aplicado a un sin número ocumentos/practicas/actuales/guion-
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