UNIDAD PROFESIONAL

INTERDISCIPLINARIA
DE INGENIERÍA
CAMPUS
GUANAJUATO

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS.

LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

PROFESORES:
Díaz Sandoval Silvia
Luévano Colmenero Guadalupe Hortensia
Macías Sánchez Karla Lizbeth

INTEGRANTES:
Cázarez Vázquez Francisco Javier
Cruz Carranco César Rafael
Leura Quintana Jesús Eduardo
Rodríguez Rivera Héctor Hilario
Téllez Girón Solís Oscar
ÍNDICE:
1.- Objetivos……………………………………………………………….........2
2.- Introducción….……………………………………………………………...2
3.- Resultados…………………………………………………………………..3
3.1.- Siembra por estría cruzada………………………………………….4
3.2.- Siembra por estría cruzada con dilución seriada…………………5
3.3.- Siembra por extensión en placa…………………………………….6
3.4.- Siembra por vertido en placa………………………………………..7
3.5.- Realización de frotis microbianos…………………………………..8
3.6.- Preservación de microorganismos………………………………….8
4.- Morfología Colonial…………………………………………………………9
5.- Morfología Celular…………………………………………………………10
6.- Discusión de Resultados………………………………………………….12
6.1.- Crecimiento bacteriano……………………………………………...12
6.2.- Análisis de crecimiento bacteriano………………………………...13
6.3.- El Yakult como caso especial………………………………………13
6.4.- Preservación de los microorganismos……………………………..14
7.- Conclusiones……………………………………………………………….14
8.- Cuestionario………………………………………………………………...15
9.- Referencias…………………………………………………………………16

1
OBJETIVOS:
- Realizar disoluciones de muestras.
- Realizar siembra por estría cruzada en placa.
- Realizar siembra por extensión en placa.
- Realizar siembra por vertido en placa.
- Observar y describir la morfología de las colonias aisladas obtenidas.
- Realizar tinción GRAM, observar y describir la morfología celular de las colonias
aisladas.
- Preservar dos colonias seleccionadas.
-

INTRODUCCIÓN:
Durante la historia de la microbiología han existido diversos personajes que han contribuido
al extensivo uso e importancia de esta rama de la biología y por ende ha sufrido
transformaciones, que en un principio lentas, en las últimas décadas se ha desarrollado con
una rapidez impresionante. (Hogg, 2005)
Robert Koch un célebre doctor del siglo XIX fue pionero de la formulación de muchos medios
de cultivos axénicos o puros para la aislación de microorganismos específicos. Robert Koch
comenzó con estudios muy rudimentarios para la formulación del medio nutritivo utilizando
en un principio la superficie de una rebanada de papa, posteriormente diseño métodos más
viables, algunos se siguen usando hoy en día. La primera observación sobre el crecimiento
de bacterias en la patata, fue que no todas las bacterias crecían en ese medio, de ahí
comenzó a elaborar cultivos más sofisticados. (Michael T. Madigan, 2005)
El logro más grande de Robert Koch sucedió en 1881 donde comenzó su estudio sobre la
bacteria que provocaba la tuberculosis en las personas, para su tiempo, no se había visto ni
en tejidos, sangre o cultivos. Koch extrajo una muestra de sangre del individuo y trabajo con
todas sus técnicas de identificación, desde tinciones hasta medios de cultivos puros, la
tinción que Koch diseño fue precursor de la tinción de Ziehl-Nielsen para la identificación de
microorganismos acido-Alcohol resistentes. Finalmente el Dr. Koch logro aislar la cepa de
Mycobacterium tuberculosis en un medio de cultivo elaborado con suero de sangre
coagulada, con esta investigación afirmo que esta bacteria cultivada era la culpable de la
tuberculosis, inoculando en cobayas los cuales se contagian fácilmente. Por este trabajo el
Dr. Robert Koch recibió en 1905 el premio nobel de fisiología y medicina. (Michael T.
Madigan, 2005)

2
 Imagen 1. Postulado de Koch.

La importancia que ha generado el desarrollo de nuevas técnicas para la obtención de

microorganismos específicos se ha potenciado en las últimas décadas, actualmente existen
cientos de tipos de medios de cultivos y diversas técnicas de cultivo así como los métodos
de conservación como lo son la técnica por tubo inclinado entre otros que son de uso
extensivo en los ámbitos de investigación y para el análisis médico-clínico. La técnica de
aislamiento por estría es una de las más usadas en los laboratorios de análisis clínicos y en
laboratorios de investigación, por su facilidad de ejecución, es utilizada para el aislamiento
de microorganismos patógenos los cuales son preparados para su análisis posterior
realizando pruebas específicas como las bioquímicas y pruebas de reacción a antibióticos,
gracias a estos estudios se puede dar al paciente un cuadro clínico más formal sobre la
enfermedad así como un tratamiento para esta. (B.Narins, 2003)

RESULTADOS:
Practicamos varias técnicas de aislamiento de microorganismos en medio sólido, la primera
técnica que utilizamos fue la de siembra por estría cruzada en placa directo de la muestra.
Nuestras muestras fueron un nido de pájaro como muestra sólida y Yakult como muestra
liquida.

Imagen 2. Nido de Pájaro Imagen 3. Bote con Yakult. 3

 En esta técnica nuestro cultivo de hogar de pájaro obtuvo varias colonias y de diferente tipo
aunque no estaban tan aisladas, los microorganismos que pudimos observar tenían forma
ambiboide, elevación umbonada, borde ondulado y color amarillo oscuro, en cambio en
nuestra muestra de Yakult obtuvimos pocas colonias pero estas si estaban aisladas, su
forma era circular, elevación plana, borde entero y color amarillo claro.

Imagen 5. Proceso de siembra por estría cruzada.

Imagen 4. Siembra por

estría cruzada.

Acá se muestran los resultados de nuestros cultivos ya hechos.

Imagen 6. Estriado directo del nido de pájaro. Imagen 7. Estriado directo del Yakult.
La siguiente técnica fue igual de siembra por estría cruzada en placa pero en esta diluimos
la muestra con agua peptonada; para esto, tomamos 0.5 gr de muestra solida y 0.5 ml de
muestra liquida para verterlo en un tubo de ensayo con 4.5 ml de agua peptonada estéril,
después la agitamos en vórtex a baja velocidad por 30 seg., esta fue la dilución 10 -1, para la

4
dilución 10-2 vertimos 0.5 ml de la dilución pasada a un tubo de ensaye con 4.5 ml de agua
peptonada estéril y para la dilución 10-3 hicimos el mismo procedimiento.

Imagen 8. Siembra por

estría cruzada con
dilución seriada.

Imagen 9. Proceso de la
dilución seriada.

Una vez hecho esto, tomamos una asada con la dilución 10 -2 con el asa bacteriológica e
hicimos esta técnica, en esta siembra en la muestra de Yakult obtuvimos muy pocas
colonias, de los microrganismos que observamos eran: forma puntiforme, elevación
convexa, borde entero y color café claro, en la muestra de hogar de pájaro obtuvimos dos
colonias diferentes que estaban aisladas, las cuales eran de una forma puntiforme ,elevación
elevada, borde ondulado y color amarillo claro, en el otro microorganismo su forma era
puntiforme, elevación elevada, borde entero y color amarillo mostaza.

Imagen 10. Estriado con dilución 10^-2 del nido de Imagen 11. Estriado con dilución 10^-2 del Yakult.
pájaro. 5
La siguiente técnica fue la de siembra por extensión en placa con la dilución de 10 -3 en esta,
solo nos creció una colonia y un hongo en la muestra de Yakult, su morfología colonial era
forma circular, elevación elevada, borde entero y color blanco, en la muestra de Hogar de
pájaro crecieron muchas colonias y de diferente tipo, la mayoría estaban aisladas, su
morfología celular era forma circular, elevación plana, borde entero y color amarillo oscuro.

Imagen 12. Siembra

por extensión en placa.

Imagen 13. Proceso de la

extensión en placa con la
dilución 10^-3

Imagen 14. Extensión en placa del nido de pájaro Imagen 15. Extensión de placa del Yakult.

6
 La ultima técnica fue la de siembra por
vertido en placa en esta tomamos 0.5 ml
de la dilución 10-3 y la vaciamos en una
caja Petri con agar líquido, esparcimos y
dejamos solidificar. En nuestra muestra de
Yakult crecieron varias colonias pequeñas
iguales y aisladas, su morfología colonial
era forma puntiforme, elevación convexa,
borde entero y color blanco en la muestra
de hogar de pájaro crecieron muchas
bacterias, su morfología colonial era forma
circular, elevación plana, borde entero y
color amarillo oscuro.
Imagen 16. Proceso del vertido en placa.

Imagen 17. Siembra por vertido

en placa.

Imagen 18. Vertido en placa del nido de pájaro. Imagen 19. Vertido en placa del Yakult.

Hicimos 6 tinciones de Gram de microorganismos que elegimos de todas nuestra muestra y

que estaban aislados y su morfología celular en el objetivo de 4X observamos cocos café,

7
en el de 10X observamos cocos café claro y en el objetivo de 100X observamos cocos
rojizos esto fue en los microorganismos que tomamos del hogar de pájaro.
De los microrganismos que tomamos del Yakult su morfología celular era: en el objetivo de
4X mucho colorante en particular en una muestra, en el objetivo de 10X bacilos rmorados y
colorante rojo, en el objetivo de 100X morados.

Imagen 20. Frotis con tinción de Gram.

En cuanto al cultivo en el agar inclinado en el tubo de ensayo, hicimos dos de los cuales solo
en uno obtuvimos crecimiento bacteriano (nido de pájaro) lo cual es obvio ya que hay miles
de bacterias en esos lugares, sin embargo en el cultivo del Yakult no obtuvimos nada lo cual
es obvio ya que es un alimento y tiene que estar inocuo. Desafortunadamente no tomamos
fotos ni videos por lo cual no podemos anexar imágenes.

Imagen 21. Cultivo en estría en

agar inclinado.

Imagen 22. Ocho medios de cultivos, 4 de estriado, dos de vertido y dos de extensión.

8
En base a lo anterior les presentamos los resultados obtenidos en tablas:
Muestra Tipo de Siembra Observaciones Imagen y Color

Forma: Ambiboide
Nido de Pájaro Estriado Directo Elevación:
Umbonada
Borde: Ondulado

Forma: Circular
Nido de Pájaro Extensión en Placa Elevación: Plana
Borde: Entero

Forma: Circular
Nido de Pájaro Vertido en Placa Elevación: Plana
Borde: Entero

Forma: Puntiforme
Elevación: Elevado
Nido de Pájaro Estriado en Placa Borde: Entero
con dilución 10^-2
Forma: Puntiforme
Elevación: Elevado
Borde: Ondulado

Forma: Circular
Yakult Estriado Directo Elevación: Plana
Borde: Entero

9
 Forma: Puntiforme
Yakult Vertido en Placa Elevación: Convexa
Borde: Entero

Estriado en la Placa Forma: Puntiforme

con dilución 10^-2
Yakult Elevación: Convexa
Borde: Entero

Forma: Circular
Elevación: Elevado
Borde: Entero
Yakult Extensión en Placa
Forma: Filamentosa
Elevación: Convexa
Borde: Filamentoso

Tabla 1. Resultados de la Morfología Colonial obtenido de nuestros medios de cultivo.

Estos son los resultados de la morfología celular obtenido en base de frotis preparados
hechos de nuestros medios de cultivo. Cabe resaltar que no hicimos frotis de todas las
colonias presentadas, escogimos 6 las cuales se presentan en la tabla. Desafortunadamente
no obtuvimos algunas imágenes por falta de tiempo al igual que no pudimos interpretar a
cual medio de cultivo correspondían por que se borró el nombre en el portaobjetos.
Muestra Morfología Gram + o - Imagen.

Nido de pájaro Cocos y Negativa

estafilococos.

10
Nido de pájaro Cocos y Negativa
estafilococos

Cocos. diplococos
y estafilococos.
Nido de pájaro Positiva

Cocos, diplococos
y estafilococos.
Nido de pájaro Positiva

Yakult Bacilos Positiva

11
 Yakult Bacilos. Positiva

Tabla 2. Resultados de la morfología celular obtenido a través de nuestros medios de cultivo.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS:
Como pudimos observar en los resultados, las variantes existenciales en el crecimiento
bacteriano de las diferentes técnicas de aislamiento pudieron ser causadas por diversos
factores, incluso la misma técnica nos puede mostrar la sobre ponencia que se tiene una con
otra. Los factores de crecimiento son de vital importancia a la hora de deducir la posible
diferencia del crecimiento microbiano y al mismo tiempo generar una comparación analítica
entre las diferentes técnicas, así las variantes presentes en el transporte y la correcta
inoculación de la muestra en los medios.

Una clara observación que pudimos apreciar fue un distinto crecimiento en las diversas
técnicas de aislación, es claro, por nuestras observaciones que el método por vertido en
placa y extensión en placa resultan ser, técnicas donde el tiempo aproximado de realización
es más extenso que el estriado, pues posteriormente se tiene que realizar diluciones de la
muestra para reducir la carga microbiana (Vullo D., 2000), esto implica que se prolonguen
los tiempos de trabajo, en cambio el estriado en placa propone una forma más directa de
hacer la inoculación, pero con la desventaja de que no se asegura que la carga microbiana
sea lo suficientemente pequeña para que se pueda tomar la colonia la cual deseamos aislar,
aunque, se puede realizar dilución de la muestra y aplicar el agotamiento por estría. (Vullo
D., 2000).

12
Análisis del crecimiento bacteriano

Como ya mencionamos en los resultados, el crecimiento bacteriano fue variado en algunas

de las técnicas, esta variabilidad pudo ser influenciada por la naturaleza de las muestras, y
es claro, la comparativa en la percepción del crecimiento bacteriano en las muestras de
Yakult y el hogar de una ave son notorias, en primer instancia, porque estamos hablando de
un alimento y por ende debemos entender la escases de colonias bacterianas y más que
eso la variabilidad de la flora en el medio, la carga microbiana en las diluciones utilizadas en
la muestra de Yakult presento una escases de colonias de manera indiferente en todas las
técnicas de cultivo empleadas en la práctica, y es de esperarse, pues un alimento debe ser
inocuo, en este caso, solo se presentaron las colonias de bacterias que, según las
investigaciones previas deben presentarse en este producto. (Novick, 1955)

Por el contrario el hogar de ave presento una diversidad en flora bacteriana, este tipo de
muestras encontradas en el ambiente son cuna de una variedad enorme de
microorganismos, muchos de ellos causantes de enfermedades (Madigan M. M., 2003). En
los medios con esta muestra inoculada hubo una gran cantidad de colonias de
microorganismos en todas las diferentes técnicas de cultivo, cabe resaltar que si no se
hubiera realizado la dilución, habría una cantidad excesiva de microorganismos, una
observación mas es la escasez de M.O en la placa hecha con el estriado directo, fue debido
a una mala técnica de cultivo pues las muestras solidas se deben diluir en agua para poder
ser cultivadas, detalle que omitimos a la hora de realizar el estriado. (Cabello, 2007)

Análisis del Yakult como caso especial

El producto Yakult contiene un lactobacilo llamado Lactobacillus casei el cual está presente
en la boca y en la flora intestinal, considerado probiotico por sus beneficios a la salud en el
organismo huésped. Esta bacteria Gram positiva tiene como característica principal rangos
de pH muy amplios así como de temperatura, es una bacteria muy resistente, es por ello que
puede soportar la acidez de los jugos gástricos del estómago y llegar hasta el intestino,
también trabaja en conjunto con otro lactobacilo llamado L. acidophilus presente en la
saliva, el cual produce la enzima amilasa quien es la responsable de la degradación principal
de los hidratos de carbono. (Yuki, 1999)

13
Aunque no podemos decir que es totalmente L. casei el Gram que presento en la muestra
vista por el microscopio fue Gram positiva, el mismo Gram que menciona la investigación
realizada presente en todas las muestras tomadas de las diferentes técnicas de cultivo
(Gordon G. L, 1979), a pesar de ello, aún hace falta realizar pruebas bioquímicas para
confirmar la presencia de este mismo, estas se elaboraran en prácticas futuras.

Preservación de los microorganismos

Es imprescindible para este procedimiento haber conocido anteriormente los requerimientos

para la conservación de colonias de microorganismos, pues se sabe de los múltiples
factores que se le atribuyen a la muerte bacteriana, desafortunadamente podemos decir que
los microorganismos que preservamos se encontraban, probablemente en una fase
comprendida entre la fase exponencial y la de muerte (Novick, 1955), este dato es
potencialmente un factor de crecimiento para los microorganismos, es variable porque estos
tiene diferentes periodos de vida, por ejemplo L. casei en promedio 3 dias (Yuki, 1999) si no
se le cambia el agar nutritivo donde están cultivadas, mueren por falta de nutrientes aunque
algunas que se adaptan pueden vivir un poco más, otro factor son los desechos que ellos
mismos liberan los cuales resultan ser tóxicos para estos mismos. Nuestras preservaciones
mostraron una cantidad minúscula de crecimiento, apenas entre 2 y 3 colonias en ambas
muestras, también es fundamental saber si realmente se tomó bien la colonia a inocular.
(Sanz, 2012)

CONCLUSIÓN:
Los microorganismos son capaces de adaptarse a casi cualquier ambiente por lo que es fácil
encontrarlos por todo el mundo, aún en condiciones extremas. Estos pueden sobrevivir en
ambientes deficientes de nutrientes necesarios para su crecimiento. En el laboratorio de
microbiología llevamos muestras de diferentes muestras en donde encontramos
microorganismos y las sembramos en placas de agar con métodos de siembra, con estos
métodos pudimos reducir la carga microbiana para poder obtener colonias aisladas para su
posterior tinción y preservación en tubos con agar.

En cada una de las cajas con agar obtuvimos diferentes colonias de bacterias, unas con muy
pocas colonias y otras con colonias incontables por su gran número. En una de ellas
14
obtuvimos contaminación de un hongo y en otras dos, al momento de realizar a cabo el
método de siembra, se rompió el agar. En una más hubo crecimiento excesivo de lo que
parecía un hongo por lo que no se pudieron obtener muestra de colonias aisladas.
Observamos cada una de las cajas en el estereoscopio y describimos la morfología colonial
de las que nosotros consideramos de diferente tipo de cada muestra inoculada.

Por falta de tiempo decidimos solo hacer la tinción de una muestra de una colonia de cada
caja, y durante la tinción se borró el nombre de la caja de la cual sacamos la muestra. Al
observar en el microscopio pudimos deducir de cual muestra se trataba. Al final obtuvimos 6
frotis.

CUESTIONARIO.
1.- Existen técnicas de aislamiento de microorganismos en medio líquido, investigue y
explique para que tipo de microorganismos se recomiendan y cómo se lleva a cabo éste
método.
Este tipo de técnica no contiene agar y favorecen el crecimiento bacteriano ya que las
bacterias poseen una libertad de movimiento y al difundirse por todo el medio encuentran su
componente nutritivo y requerimiento de oxígeno más óptimo con gran facilidad. Un ejemplo
las aerobias estrictas crecen en los primeros 10-15 mm de la superficie del medio, las
microaerofilas ligeramente por la superficie del medio, las anaerobias estrictas en los 10-
20mm del fondo y las facultativas por todo el medio. Se realiza transfiriendo la muestra con
una asa bacteriológica, un hisopo, pipeta o pipeta pasteur y se siembra en el líquido se agita
para terminar. (Zapata, Zapata, & Cartagena, 2014)
2.- Investigue y argumente una secuencia de pruebas para el aislamiento e identificación de
tres bacterias que sean:
a) Bacilos Gram positivos.
Comenzamos observando la morfología de la colonia (hemólisis, pigmentos, tamaño,
textura, adherencia al agar, formación de depresiones entre otras cosas, después de la
observación se hace la tinción de Gram para ubicar el microorganismo en positivo o
negativo. Para este casi la prueba de la catalasa debe seguir a la tinción de Gram.
b) Cocos Gram negativos.
Comenzamos observando la morfología de la colonia (hemólisis, pigmentos, tamaño,
textura, adherencia al agar, formación de depresiones entre otras cosas, después de la
observación se hace la tinción de Gram para ubicar el microorganismo en positivo o
negativo. Para este caso las pruebas deben comenzar con la prueba de la oxidasa. Estás
pruebas simples más el crecimiento en agar de MacConkey.

15
c) Bacilos Gram positivos.
Comenzamos observando la morfología de la colonia (hemólisis, pigmentos, tamaño,
textura, adherencia al agar, formación de depresiones entre otras cosas, después de la
observación se hace la tinción de Gram para ubicar el microorganismo en positivo o
negativo. Para este casi la prueba de la catalasa debe seguir a la tinción de Gram. Estás
pruebas simples más el crecimiento en agar de MacConkey. (Forbes, Sahm, & Weissfeld,
2009)

Bibliografía
B.C.MIMS. (2002). Microbiología Médica. Mosby: Elsevier.

B.Narins. (2003). World of Microbiology and Immunology. Gale.

Bergey, D. H. (1994). Bergey´s manual of determinative bacteriology. Williams.

Cabello, R. R. (2007). Microbiologia y Parasitologia Humanas. Medica Panamericana .

Diaz A, R. N. (2001). Biologia. Caracas: Mcgraw-hill interamericana.

Diaz. R. Gamazo, L. G. (1999). Manual Práctico de Microbiología. Masson.

E., A. M. (2004). Ciencia y diseño de formulas farmacéuticas. España: Elsevier.

Endoesporas, L. (2013). Morfología de Bacillus Subtilis en Crecimiento Fracial no Lineal. Coyoacán, Distrito
Federal, México: Universidad Autónoma Nacional de México.

G., F. (1990). Biologia Schaum. MacGraw-Hill Interamericana.

Gerard J. Tortora, B. R. (2007). Introduccion a la microbiologia. Medica Panamericana .

Gordon G. L, D. H. (1979). Purification, properties and immunological relationship of L (+)-lactate

dehydrogenase from Lactobacillus casei.

Hogg, S. (2005). Essential Microbiology. Wiley.

L., T. G. (1995). Microbiology an introduction. Cummings Publishing.

Mac, E. (2012). eHow.com. Obtenido de eHow.com/EColi

Madigan, M. M. (2003). Brock. Biologia de los Microorganismos. Spain: Prentice Hall.

Madigan, M. T., & Martinko J., P. J. (2004). Brock biology of microorganisms. Williams.

Michael T. Madigan, J. M. (2005). Brock,Biologia de los Microorganismos. Pearson.

Murray., P. (2006). Microbiología Médica. Mosby: Elsevier.

Novick, A. (1955). Growth of Bacteria, Annual Review of Microbiology.

Paredes S. Fernando, T. F. (1994). Microbiología clínica práctica. España: UDC Servicio de publicaciones.

Quees.la. (2012). Quees. Obtenido de http://quees.la/estereoscopio/

16
Red Escolar Nacional. (2008). El microscopio 2010. Centro Nacional de Inovación Tecnológica (CENIT).

Rodríguez, D. C. (2001). Laboratorio de Microbiología, Instrumentación y principios básicos. La Habana, Cuba.

Salyeers, A. a. (1994). Bacterial Phatogenesis. Washington,DC.

Santambrosio E., O. M. (2009). Tincion y observacion de microorganismos. Universidad Tecnologica Nacional.

Sanz, J. L. (2012). Cinetica y crecimiento bacteriano.

Silva, C. C. (2009). Análisis Microbiológico de la Gingivitis en Edad Pediátrica. Madrid, Madrid, España: Facultad
de Odontología UCM.

Søgaard, M., Nørgaard, M., & Schønheyder, H. (2007). First notification of positive blood cultures.

Vullo D., M. W. (2000). Microbiologia en practica. Argentina: Atlante S.

Walker, T. (2000). Microbiología. McGraw-hill.

Yuki, N. W. (1999). Survival of a probiotic,Lactobacillus casei strain Shirota, in the gastrointestinal tract:
selective isolation from faeces and identification using monoclonal antibodies.

17