Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
I. Tujuan
1. Menghidrolisis protein dengan enzim protease
2. Membuat kurva hubungan antara volume NaOH terhadap waktu dan kurva mg
nitrogen asam amino terhadap waktu titrasi formal asam amino
II. Dasar Teori
Protein adalah senyawa organik kompleks yang memiliki bobot molekul tinggi
yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan
satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon,
hydrogen, oksigen, nitrogen dan kadang kala sulfur serta fosfor. Suatu molekul
protein disusun oleh sejumlah asam amino tertentu dengan susunan yang sudah
tertentu pula dan bersifat turunan (Aisjah Girindra dalam Tika, 2010).
Asam amino merupakan ion dipolar yang pada umumnya mempunyai dua atau
lebih pKa. Asam amino yang menyusun suatu protein tertentu, kadar asam aminonya
tidak sama. Protein jika dihidrolisis akan menghasilkan asam amino bebas. Asam
amino tidak larut di dalam eter karena merupakan senyawa dipolar dan dalam air
menunjukkan struktur kutub ganda (Zwitter ion) yaitu:
H H
R C COOH R C COO -
NH 2 NH 3+
OH- OH-
R C COOH R C COO - R C COO -
+
H+ H
NH 3+ NH 3+ NH 2
asam amino pada Bentuk ion dipolar asam amino pada
pH rendah pH tinggi
Bila suatu protein dihidrolisis, akan didapatkan asam aminonya. Hidrolisis protein
dapat dilakukan dengan menggunakan enzim protease dari tripsin. Protein jika
dihidrolisis akan menghasilkan asam amino bebas. Asam amino bebas ini bila
direaksikan dengan formaldehid berlebih akan membentuk derivate metilol. Reaksi
ini menyebabkan asam amino bebas bentuk isoelektrik kehilangan satu proton dari
gugus NH3+ (Tika, 2010).
NH3+CHRCOO- ↔ H2NCHRCOO- + H+
H2NCHRCOO- + 2HCHO ↔ (HOCH2)2NCHRCOO-
H+ yang dilepaskan pada reaksi ini dapat dititrasi langsung dengan NaOH sampai
dengan pH 8,0 (titik akhir indicator ekuivalen). Titrasi asam amino atau campuran
asam amino dalam keberadaan formaldehid disebut dengan titrasi formal asam amino.
Titrasi ini merupakan metode analisis untuk mengikuti pembentukan asam amino
bebas yang dihasilkan pada proses hidrolisis protein oleh enzim proteotik (Tika,
2010).
Pada percobaan ini dibuat kurva titrasi dari asam amino yang diperoleh dari hasil
hidrolisis protein dengan menggunakan enzim protease. Selama hidrolisis suatu
protein, sejumlah gugus karboksil dan gugus amino bertambah terus. Penentuan
secara kuantitatif salah stau gugus akan dapat memberikan indikasi untuk mengetahui
derajat hidrolisis protein. Menurut teori zwiiterion, kalau suatu asam amino dalam
larutan dititrasi dengan basa, berarti ion hydrogen dari ammonium yang dititrasi.
Gugus ammonium dari asam amino yang bersifat buffer pada daerah pH tinggi atau di
atas pH 11, sehingga tidak mungkin dititrasi sampai titik akhir. Hal yang sama juga
terjadi pada gugus karboksil yang bersifat buffer pada pH rendah sehingga tidak
mungkin juga dititrasi dengan basa (Tika, 2010).
Untuk mengatasi hal tersebut, maka formaldehid ditambahkan ke dalam larutan
asam amino agar bereaksi dengan gugus amino yang tidak bermuatan sehingga
memungkinkan gugus ammonium membuffer pada daerah pH yang lebih rendah dan
dapat dititrasi pada titik akhir secara kuantitatif menggunakan indicator (Tika, 2010).
Reaksi yang terjadi selama titrasi formal asam amino adalah :
H H
O
R C COO- + R C COOH
C
H H
NH 3 + H N CH 2 OH
C
H H
R C COOH
HOH2 C N CH 2 OH
dimethilol
H
H
R C COOH
+ NaOH R C COO -Na+ + H2O
HOH 2C N CH 2OH
HOH 2C N CH 2OH
Gambar 3. Reaksi selama Proses Titrasi Formal Asam Amino
Penambahan formalin ke dalam larutan asam amino akan membentuk dimetilol.
Dengan terbentuknya dimetilol berarti gugus amino dari protein sudah terikat dan
tidak akan mempengaruhi titik akhit titrasi sehingga titik akhir titrasi dapat ditentukan
dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah fenolptalein (Tika, 2010).
Pada praktikum ini digunakan reagen gelatin yang merupakan produk alami yang
diperoleh dari hidrolisis parsial kolagen. Gelatin merupakan protein yang larut dan
bersifat gelling agent (bahan pembuat gel). Sumber bahan baku gelatin dapat berasal
dari tulang dan kulit dari sapi atau babi. Gelatin terdiri dari glisin dengan komposisi
besar, protein dan 4-hidroksi residu.
Struktur gelatin adalah sebagai berikut :
O O O O O O OH
H H H2 H H H H2 H H
N C C N C C NH C N C C N C C N C C N
H
CH 3 CH2 CH2
CH2 CH2 HC NH
NH C O OH CH2
C NH O- C O
NH2 + NH
O
2. Bahan- Bahan
No Nama Bahan Konsentrasi Jumlah
1 Larutan gelatin 5% 100 mL
2 Larutan NaOH 0,2 M dan 0,02 M 200 mL
3 Larutan HCl 0,1 M 50 mL
4 Larutan fenol ftalein 1% 10 mL
5 Larutan Formaldehid 40 % 100 mL
6 Larutan tripsin 1% 15 mL
7 Aquades - 300 mL
ANALISIS DATA
1. Kurva titrasi asam amino yang dinyatakan dengan hubungan volume NaOH terhadap
waktu
Berdasarkan hasil praktikum diperoleh data hasil titrasi asam amino dengan menggunakan
NaOH sebagai titran yaitu sebagai berikut.
Tabel 1. Hasil titrasi asam amino dengan menggunakan NaOH sebagai titran
Waktu (menit) Volume (mL)
0 14,2
15 16,6
30 17,3
45 18,5
60 21,00
90 22,00
120 23,3
Berdasarkan data di atas, maka dapat dibuat kurva titrasi hubungan volume NaOH terhadap
waktu sebagai berikut.
Kurva Titrasi Hubungan Volume NaOH
Terhadap Waktu y = 0.0747x + 15.146
R² = 0.9437
35
30
Volume NaOH (mL)
25
10
Linear (Hubungan volume
5 NaOH terhadap waktu)
0
0 20 40 60 80 100 120 140
Waktu (menit)
????
2. Penentuan Jumlah Mg Asam Amino pada Tiap Volume NaOH saat Titrasi
Dengan mengasumsikan 1 mL NaOH ekivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, maka
dapat dihitung jumlah mg asam amino pada tiap volume NaOH saat titrasi. Adapun
perhitungannya yaitu sebagai berikut.
Pada waktu t = 0
Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 14,2 mL
Mol NaOH = 14,2 mL x 0,02 M = 0,284 mmol
1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,284 mmol
NaOH ekuivalen dengan:
0,1 𝑚𝑚𝑜𝑙 1,4 𝑚𝑔
0,284 mmol
= 𝑥 𝑚𝑔
0,284 𝑚𝑚𝑜𝑙 ×1,4 𝑚𝑔
𝑥= = 3,976 𝑚𝑔 𝑛𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛 𝑎𝑠𝑎𝑚 𝑎𝑚𝑖𝑛𝑜
0,1 𝑚𝑚𝑜𝑙
Pada waktu t = 15
Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 16.6 mL
Mol NaOH = 16,6 mL x 0,02 M = 0,332 mmol
1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,332 mmol
NaOH ekuivalen dengan:
0,1 𝑚𝑚𝑜𝑙 1,4 𝑚𝑔
=
0,332 mmol 𝑥 𝑚𝑔
0,332 𝑚𝑚𝑜𝑙 ×1,4 𝑚𝑔
𝑥= = 4,648 𝑚𝑔 𝑛𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛 𝑎𝑠𝑎𝑚 𝑎𝑚𝑖𝑛𝑜
0,1 𝑚𝑚𝑜𝑙
Pada waktu t = 30
Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 17,3 mL
Mol NaOH = 8,6 mL x 0,02 M = 0,346 mmol
1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,346 mmol
NaOH ekuivalen dengan:
0,1 𝑚𝑚𝑜𝑙 1,4 𝑚𝑔
=
0,346mmol 𝑥 𝑚𝑔
0,346𝑚𝑚𝑜𝑙 ×1,4 𝑚𝑔
𝑥= = 4,844 𝑚𝑔 𝑛𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛 𝑎𝑠𝑎𝑚 𝑎𝑚𝑖𝑛𝑜
0,1 𝑚𝑚𝑜𝑙
Pada waktu t = 45
Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 18,5 mL
Mol NaOH = 8,6 mL x 0,02 M = 0,37 mmol
1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,37 mmol
NaOH ekuivalen dengan:
0,1 𝑚𝑚𝑜𝑙 1,4 𝑚𝑔
=
0,37mmol 𝑥 𝑚𝑔
0,37𝑚𝑚𝑜𝑙 ×1,4 𝑚𝑔
𝑥= = 5,18 𝑚𝑔 𝑛𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛 𝑎𝑠𝑎𝑚 𝑎𝑚𝑖𝑛𝑜
0,1 𝑚𝑚𝑜𝑙
Pada waktu t = 60
Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 8,95 mL
Mol NaOH = 8,95 mL x 0,02 M = 0,42mmol
1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,42 mmol
NaOH ekuivalen dengan:
0,1 𝑚𝑚𝑜𝑙 1,4 𝑚𝑔
=
0,42 mmol 𝑥 𝑚𝑔
0,42 𝑚𝑚𝑜𝑙 × 1,4 𝑚𝑔
𝑥= = 5,88 𝑚𝑔 𝑛𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛 𝑎𝑠𝑎𝑚 𝑎𝑚𝑖𝑛𝑜
0,1 𝑚𝑚𝑜𝑙
Pada waktu t = 90
Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 22 mL
Mol NaOH = 22 mL x 0,02 M = 0,44 mmol
1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,44 mmol
NaOH ekuivalen dengan:
0,1 𝑚𝑚𝑜𝑙 1,4 𝑚𝑔
=
0,44 mmol 𝑥 𝑚𝑔
0,44 𝑚𝑚𝑜𝑙 × 1,4 𝑚𝑔
𝑥= = 6,16 𝑚𝑔 𝑛𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛 𝑎𝑠𝑎𝑚 𝑎𝑚𝑖𝑛𝑜
0,1 𝑚𝑚𝑜𝑙
Dalam percobaan ini, dilakukan titrasi formal asam amino. Titrasi formal asam amino
merupakan titrasi asam amino atau campuran asam amino dalam keberadaan formaldehida.
Asam amino yang digunakan merupakan hasil degradasi dari gelatin (polipeptida) yang
didegradasi menggunakan enzim protease yaitu tripsin. Adapun prinsip dari percobaan ini
mengikuti kenyataan bahwa suatu protein mengikuti teori zwitter ion, dimana suatu asam amino
walaupun memiliki dua sisi aktif (gugus –COOH dan gugus amina –NH2), sehingga dapat
dititrasi menggunakan asam dan basa. Namun kenyataannya, gugus ammonium dari asam amino
merupakan buffer pada pH tinggi (di atas pH 11) sehingga tidak mungkin untuk mentitrasinya
pada titik akhir suatu indikator. Hal ini mengingat dimana suatu indikator pada umumnya
memiliki trayek pH sedapat mungkin mendekati pH 7 karena titrasi asam basa merupakan suatu
reaksi penetralan. Dalam percobaan ini, reagen yang digunakan adalah larutan gelatin. Gelatin
merupakan polipeptida (protein) yang larut dalam air, hal ini terbukti dengan mudah larutnya
gelatin ketika ditambahkan ke dalam aquades. Gelatin merupakan gelting agent (bahan pembuat
gel), sehingga perlu diinkubasi pada suhu 38oC. Bila suhu inkubasi diatas 38oC, maka
kemungkinan akan terbentuk gel yang akan mempengaruhi proses degradasi untuk menghasilkan
asam amino.
Sebelum dilakukan proses titrasi dalam percobaan ini terlebih dahulu dilakukan proses
pembuatan larutan gelatin dengan cara melarutkan 5 gram padatan gelatin ke dalam 100 mL
aquades. Setelah dilarutkan dan diaduk terbentuk larutan gelatin yang berwarna kuning.
Larutan gelatin ini kemudian ditambahkan indikator fenolftalein sebanyak 1 mL dan
ditambahkan larutan NaOH 0,2 M tetes demi tetes sehingga larutan gelatin berwarna merah
muda. Adapun tujuan penambahan NaOH adalah agar larutan bersifat sedikit basa.
Larutan yang berwarna merah ini kemudian ditambahkan larutan HCl 0,1 M tetes demi
tetes. Penambahan larutan HCl menyebabkan warna larutan kembali berwarna kuning.
Penambahan larutan HCl bertujuan agar pH menjadi 8 dimana pada pH ini enzim tripsin akan
mampu bekerja secara optimal. Dalam percobaan ini diperoleh pH setelah penambahan HCl
yaitu 8,02. Hal yang sama juga dilakukan terhadap enzim tripsin, dimana dilakukan penambahan
fenolftalein dan NaOH kedalam 25 mL larutan tripsin sehingga warna menjadi merah muda.
Kemudian larutan ini ditambahkan larutan HCl 0,1 M tetes demi tetes hingga warna merah muda
akibat penambahan fenolftalein dan NaOH ini hilang. Hal ini dilakukan agar kondisi enzim
tripsin sama dengan kondisi gelatin sehingga saat direaksikan akan terjadi reaksi yang sempurna.
Setelah itu, larutan gelatin dan tripsin ini diinkubasi dengan inkubator air pada suhu
38 C, dimana suhu ini dijaga supaya tidak melebihi suhu 38oC karena dapat menyebabkan enzim
o
rusak yang ditandai dengan pembentukan gel yang sangat mempengaruhi proses degradasi
menghasilkan asam amino. Setelah diinkubasi selama beberapa menit, kedua larutan ini
kemudian dicampur. Dari pencampuran ini terbentuk larutan berwarna kuning kecoklatan.
Tujuan pencamuran ini adalah untuk mengdegradasi larutan gelatin dengan menggunakan enzim
tripsin. Tripsin merupakan enzim proteolitik yang hanya terdiri dari suatu rantai polipeptida.
Enzim ini akan mendegradasi gelatin menghasilkan asam amino penyusunnya.
Sebanyak 10 mL dari larutan ini diambil dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer dan
dilakukan pendidihan terhadap larutan ini dengan tujuan untuk merusak enzim. Kemudian
dilakukan pendinginan terhadap larutan. Setelah dingin, larutan ditambahkan 15 mL larutan
formaldehid dan 3 tetes fenolftalein. Warna larutan setelah ditambahkan formaldehid dan
fenolftalein yaitu tetap berwarna kuning keruh. Larutan ini kemudian dititrasi dengan larutan
NaOH 0,02 M. Titrasi dihentikan ketika larutan ini berubah warna menjadi merah muda.
Adapun penambahan formaldehid sebelum titrasi berfungsi agar gugus karbonilnya
bereaksi dengan asam amino yang tidak bermuatan sehingga memungkinkan gugus amonium
bereaksi dengan NaOH dan membuffer pada pH yang lebih rendah serta dapat dititrasi pada titik
akhir secara kuantitatif menggunakan suatu indikator. Reaksi yang terjadi pada titrasi dengan
menggunakan formalin merupakan reaksi pembentukan dimetilol. Larutan protein yang telah
dinetralkan dengan basa (NaOH), ditambahkan formalin sehingga membentuk dimetilol. Dengan
terbentuknya dimetilol ini, berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi
reaksi yang terjadi antara gugus asam (karboksil) dengan basa (NaOH) sehingga titik akhir titrasi
dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah fenolftalein. Bila titik akhir titrasi
diperoleh tepat, maka akan terjadi perubahan warna larutan dari bening menjadi merah muda.
Reaksi yang terjadi dalam proses ini adalah sebagai berikut :
H H
NaOH
R C COOH R C COO-
NH2 NH3+
H O H
R C COO- + C R C COOH
H H
NH3+ H N CH2OH
C
H H
R C COOH
HOH2C N CH2OH
dimethilol
H
H
R C COOH + NaOH
R C COO-Na+ + H2O
HOH2C N CH2OH
HOH2C N CH2OH
Berdasarkan Kurva hubungan volume NaOH terhadap waktu di atas, dapat diketahui
bahwa semakin lama larutan didiamkan, maka semakin banyak volume NaOH yang digunakan
untuk proses titrasi. Hal ini terjadi karena selama proses hidrolisis gelatin oleh tripsin
menghasilkan sejumlah asam amino yang konsentrasinya bertambah seiring dengan
bertambahnya interaksi antara larutan gelatin dengan larutan tripsin. Enzim tripsin yang semakin
lama menghidrolisis gelatin menyebabkan gugus karboksil dan gugus amino yang dihasilkan
semakin banyak. Dengan bertambahnya gugus ini, maka jumlah NaOH yang digunakan pada
saat titrasi juga bertambah.
Secara kuantitatif dari kurva yang diperoleh, maka dapat dihitung derajat
hidrolisis dari enzim tripsin terhadap larutan gelatin. Berdasarkan hasil analisis data besar derajat
hidrolisis dari enzim tripsin terhadap larutan gelatin adalah 0,0122.
Selanjutnya dari kurva hubungan waktu terhadap mg Nitrogen asam amino di atas,
terlihat bahwa semakin lama waktu yang digunakan larutan gelatin untuk bereaksi dengan enzim
pankreatin maka semakin banyak pula mg nitrogen asam amino yang dihasilkan. Terdapat
hubungan yang searah antara waktu kontak dengan mg nitrogen asam amino. Hal ini terjadi
karena selama proses hidrolisis gelatin (protein) oleh enzim pankreatin menghasilkan sejumlah
gugus karboksil dan gugus amino yang bertambah sehingga nitrogen yang terdapat pada
dimethilol juga ikut bertambah.
SIMPULAN