Identificación de los restos del rey Ricardo III

En 2012, un esqueleto fue excavado en el supuesto sitio del convento de los Frailes Grises en
Leicester, el último lugar de descanso conocido del Rey Ricardo III. Arqueológico, osteológico y
radiocarbono datos de citas fueron consistentes con estos siendo sus restos. Aquí presentamos
análisis de ADN de tanto los restos esqueléticos como los parientes vivos de Ricardo III.
Encontramos un mitocondrial perfecto Coincidencia de ADN entre la secuencia obtenida de los
restos y un pariente vivo, y una sustitución de una sola base cuando se compara con un segundo
pariente. Haplotipos del cromosoma Y de parientes de línea masculina y los restos no coinciden, lo
que podría atribuirse a una falsa paternidad evento que ocurre en cualquiera de las generaciones
intermedias. Cabello y ojo predichos por ADN el color es consistente con la apariencia de Richard
en un retrato temprano. Calculamos probabilidad proporciones para los datos genéticos y no
genéticos por separado, y combinados, y concluyen que la evidencia de que los restos son los de
Ricardo III es abrumadora.

Richard III es uno de los más famosos y controvertidos Reyes ingleses Su ascensión al trono en
1483, después de la muerte de su hermano, Eduardo IV, ha sido visto como contencioso,
involucrando, como lo hizo, desacreditando al legitimidad del matrimonio de Edward y, por lo
tanto, el reclamo de ambos de los hijos de Edward al trono. Más tarde, como acusaciones aún no
probadas surgió que Richard había asesinado a sus dos sobrinos para solidificar su propio reclamo.
La muerte de Richard dos años después, el 22 de agosto de 1485 en la Batalla de Bosworth marcó
el final de Plantagenet dinastía, que había gobernado durante más de 300 años, y el comienzo de
el período Tudor. Ricardo III fue el último rey inglés en ser muerto en la batalla, se convirtió en uno
de los más notorios de Shakespeare villanos, y es uno de los pocos monarcas ingleses cuya
precisión lugar de descanso se perdió: el misterio que rodea el destino de su sigue persistiendo
hasta nuestros días. Los registros históricos informan que después de que Ricardo III fuera
asesinado en el campo de batalla, 32 años, sus restos fueron traídos a Leicester y enterrado en la
iglesia medieval de los Gray Friars1. El convento era disuelto en 1538 bajo las órdenes del rey
Enrique VIII, con la mayoría de los edificios derribados en los años siguientes. Aproximadamente
125 años después, surgió el rumor de que Richard Los restos de III habían sido desenterrados
durante la disolución del monasterios y arrojados al río Soar en Leicester2. Sin embargo, hace
tiempo que se pensaba que este rumor era sin fundamento y por lo tanto se esperaba que la
tumba de Ricardo III todavía debería estar dentro de los restos de los Frailes Grises iglesia3-5. Si
bien los registros históricos y el análisis posterior han indicado por mucho tiempo la ubicación
aproximada del gris Frailes Frailes, y su situación probable en relación con el moderno paisaje
urbano de Leicester, el sitio exacto de la tumba de Ricardo III se había perdido en los 527 años
desde su muerte3-5.

Aunque Ricardo III reinó por poco más de dos años, información histórica sustancial sobre varias
características de su vida y la muerte existe Estos incluyen aspectos de su apariencia física como
tener una constitución delgada, un hombro más alto que el otro y que sufrió heridas de guerra, lo
que resultó en su muerte6 (ver nota complementaria 1). En septiembre de 2012, un esqueleto
(Esqueleto 1) fue excavado en el presunto sitio de los Frailes Grises convento en Leicester, el
último lugar de descanso conocido de Ricardo III (ref. 6). La datación arqueológica, osteológica y
radiocarbónica la evidencia era consistente con los restos siendo los de Ricardo III (ref. 6). El
esqueleto era el de un hombre de 30 a 34 años años7, con escoliosis severa que representa un
hombro más alto que el otro8, con numerosas lesiones de batalla perimortem7. Modelado
datación por radiocarbono también fue consistente (1456-1530AD al 95.4% probabilidad) con
estos siendo los restos de un individuo que murió en 1485 (refs 6,9). Lo que ha faltado hasta la
fecha es el datos genéticos y genealógicos, y un análisis integrativo de ambos las líneas de
evidencia genética y no genética. Nosotros por lo tanto realizó análisis de ADN antiguo y moderno,
y, por primera tiempo, una síntesis de todas las pruebas juntas, para llegar a un conclusión sobre
la identidad de Skeleton

Análisis del ADN mitocondrial completo (ADNmt) secuencia de Skeleton 1 muestra una
combinación perfecta con el Secuencia de mtDNA de un pariente vivo femenino de Richard III y
una sola sustitución en comparación con una segunda vida pariente de línea femenina El haplotipo
del cromosoma Y de Skeleton 1 no coincide con el de los parientes de línea masculina de Ricardo
III, pero esto no es destacable dado que un evento de falsa paternidad podría han ocurrido en
cualquiera de las generaciones intermedias. Si bien no retratos contemporáneos de Richard III
sobreviven, el ADN predicho el pelo y el color de los ojos son consistentes con la apariencia de
Richard en un retrato temprano. Finalmente, un análisis Bayesiano integrativo resulta en una
relación conservadora de probabilidad global de 6,7 millones, que muestra más allá de toda duda
razonable que el Esqueleto 1 es el resto del Rey Ricardo III.

Resultados

Determinación del sexo de los restos. El sexo de los restos fue determinado por la amplificación de
segmentos de la X- y Cromosomas Y (ver Métodos Suplementarios y Suplementarios Cuadros 1 y
2) 10. Los resultados confirmaron que los restos son esos de un individuo masculino, como
también lo sugiere el análisis físico del huesos. La identificación del ADN más allá de simplemente
determinar el sexo del restos se basa en la comparación con familiares conocidos. Uno de los
problemas clave con una profunda relación histórica es que, para recombinando partes del
enoma, el intercambio de ADN segmentos entre parientes decae rápidamente con el número de
generaciones que los separan. Por lo tanto, después de varias generaciones, solo el genoma
mitocondrial heredado uniparentalmente y no recombinado parte del cromosoma Y puede ser
informativo sobre relación. Como tal, solo individuos por línea materna o patrilineal relacionado
con Richard III sería útil para la comparación. Como Ricardo III no dejó descendientes vivos, era
necesario encontrar individuos relacionados con él a través de otros enlaces genealógicos (ver Fig.
1, Figuras complementarias 1 y 2 y nota complementaria. Parientes de línea masculina y análisis
del cromosoma Y. Línea masculina los familiares son generalmente más fáciles de rastrear que las
mujeres históricamente, y linajes ennoblecidos y titulados se registran en una serie de fuentes
publicadas11. Pudimos identificar, localizar y contactar cinco de esos parientes, descendientes del
quinto duque de Beaufort
(1744-1803), quien aceptó participar en el estudio, proporcionando un, aunque distante (entre 24
y 26 generaciones), conjunto de patrones patrilineales parientes (ver Fig. 1a y Suplementario Fig.
2). Vale la pena señalar que si bien es más fácil de rastrear genealógicamente, la línea masculina es
mucho más susceptible a la paternidad falsa que la línea femenina es a la falsa maternidad
eventos12. Cuatro de los parientes modernos fueron encontrados para pertenecer a Y-haplogrupo
R1b-U152 (x L2, Z36, Z56, M160, M126 y Z192) 13,14 con haplotipos STR que son consistentes con
ellos que comprende un solo grupo patrilineal. Un individuo (Somerset 3) se encontró que
pertenecía al haplogrupo I-M170 (x M253, M223) y por lo tanto, no podría ser un familiar
patrilineal de los otros cuatro dentro del lapso de tiempo considerado, lo que indica que una
paternidad falsa evento había ocurrido dentro de las últimas cuatro generaciones. Secuenciación
de polimorfismos de un solo nucleótido del cromosoma Y (SNP) en el esqueleto 1 se llevó a cabo
mediante ADN en matriz captura de hibridación15 de 24 secuencias amplificadas de Illumina16
bibliotecas, utilizando sondas generadas para cubrir SNP relevantes para el principales linajes Y
europeos, seguidos por la secuencia en un solo 100 SE Illumina Hiseq 2000 sequencing lane. Este
enfoque proporcionó cobertura insuficiente para algunos SNP y tipeo adicional se realizó
mediante PCR dirigidas con la amplificación productos secuenciados en un Ion Torrent PGM.
Finalmente, también generó un haplotipo STR utilizando Promega PowerPlex Y23 sistema (ver
Figuras complementarias 3 y 4 y Suplementario Cuadros 3-5). En contraste con los Y-haplotipos del
putativo moderno parientes, el Esqueleto 1 pertenece al haplogrupo G-P287, con un
correspondiente haplotipo Y-STR. Por lo tanto, el putativo moderno familiares patrilineales de
Ricardo III no están genéticamente relacionados con Esqueleto 1 a través de la línea masculina
durante el período de tiempo considerado. Sin embargo, esto no es sorprendente, dada una
falpaternidad media estimada tasa de B1-2% (refs 12,17,18). El putativo moderno parientes y
Richard III se relacionan a través de un pariente masculino (Edward III) cuatro generaciones más
arriba de Richard III (Fig. 1a y Suplementario Fig. 2), y un evento de falsa paternidad podría tener
sucedido en cualquiera de las 19 generaciones que separan a Ricardo III y el quinto duque de
Beaufort, en cualquier rama de la genealogía descendiendo de Edward III. De hecho, incluso con
un conservador tasa de falsa paternidad 18 (ver Métodos Suplementarios) la posibilidad de una
paternidad falsa que ocurre en este número de generaciones es 16%.
Figura 1 | Enlaces genealógicos entre Richard III y familiares de hoy en día que participaron en este
estudio. (a) La información genealógica vincula el Somersets a Richard III a través de una línea
xclusivamente masculina (lado izquierdo) a través de Edward III. Los números indican la cantidad
de individuos en el árbol entre individuos nombrados. Se sabe que dos eventos de ilegitimidad en
los que los hijos nacidos fuera del matrimonio fueron legitimados ocurrieron en el período entre
Gaunt y Henry Somerset, quinto duque de Beaufort. (b) La información genealógica vincula a
Michael Ibsen y Wendy Duldig con Richard III a través de una mujer solamente La línea (lado
derecho) descendía de la hermana mayor de Ricardo III, Ana de York. Los números indican el
número de individuos en el árbol entre los nombrados individuos.

Parientes femeninos y análisis de mtDNA.

En contraste con la falsa paternidad, la falsa maternidad es, por razones obvias, mucho menos
probable. Sin embargo, los registros históricos de linajes de línea femenina son usualmente más
difícil de seguir en múltiples generaciones debido a la cambio de apellido en el matrimonio.
Afortunadamente, los árboles genealógicos de las familias nobles y otras élites terratenientes son
a menudo mejor registradas y un árbol genealógico que muestra un linaje ininterrumpido del
linaje femenino de Anne of York, la hermana mayor de Richard, hasta principios del 19 siglo se
publicó en una serie de fuentes19 y un moderno familia descendiente identificada20,21. Sin
embargo, como no hay soporte se informaron pruebas o documentos para estas identificaciones,
llevado a cabo una investigación genealógica adicional para documentar completamente este
primer linaje y, además, rastreó un segundo linaje femenino (ver Notas complementarias 2 y 3).
Por lo tanto, pudimos obtener muestras para comparar de Michael Ibsen (ML1), 19 generaciones
eliminadas de Richard III en la línea femenina, y de Wendy Duldig (ML2), 21 generaciones
eliminadas de Richard III (vea la Fig. 1b y la Fig. 1 complementaria). Wendy Duldig y Michael Ibsen
son primos 14 de línea femenina, dos veces eliminados (32 meiosis). Además, emprendimos una
reconstrucción de La red de parentesco de Richard en el momento de Bosworth para eliminar, en
la medida de lo posible, conocidos parientes contemporáneos que comparten una tipo de ADNmt
heredado común (ver nota complementaria 2b). Llevamos a cabo análisis de ADNmt en dos
etapas. En el primero etapa, ambas cadenas de la región de control de mtDNA (1.210 bp) fueron
secuenciado en duplicado de ambos ML1 y ML2 usando Sanger secuenciación No se observaron
diferencias de secuencia entre ya sea muestras duplicadas del mismo individuo o individuos. Tres
secciones hipervariables (HV1, HV2, HV3) (ref. 22) de la región de control de mtDNA de Skeleton 1
se secuenciaron a partir de dos extracciones independientes llevadas a cabo en dos diferentes
Laboratorios de ADN. Secuenciación de Sanger de productos de PCR clonados también se realizó y
no se observaron diferencias de secuencia a excepción de dos que se pueden atribuir a los
patrones de daño del ADN encontrado en el antiguo ADN23-25. Encontramos una pareja perfecta
entre los tres individuos (ML1, ML2 y Skeleton 1), de acuerdo con estos individuos todos siendo
parientes matrilineales en la genealogía profundidad de tiempo considerada. Para determinar la
similitud completa de mtDNA, llevamos a cabo completar la secuenciación del genoma
mitocondrial en las tres muestras. Para las muestras modernas (ML1 y ML2), todo el mitocondrial
el genoma se amplificó mediante dos PCR de largo alcance26 por duplicado, seguido por la
secuencia en un Ion Torrent PGM: todos sitios que difieren de la secuencia de referencia revisada
de Cambridge (rCRS) 27 fueron confirmados posteriormente por la secuenciación de Sanger en
ambas cadenas en ML1 y ML2 por duplicado. La secuenciación del genoma completo de la
secuencia de ADNmt de El esqueleto 1 se llevó a cabo usando hibridación de ADN en matriz
capture15,16 en 24 bibliotecas de secuenciación generadas a partir de 16 extractos utilizando
sondas generadas a partir de la secuencia de mtDNA de los dos parientes modernos seguidos por
secuenciación en un único 100 SE Línea de secuenciamiento Illumina Hiseq 2000 (vea la Fig. 5
complementaria). Estos revelaron una secuencia de secuencia perfecta del genoma completo con
ML1 y una sola diferencia (posición 8,994) con ML2 consistente con estos individuos siendo
parientes matrilineales en el tiempo período considerado28 (véanse los cuadros suplementarios 6-
8). A continuación, investigamos la probabilidad de que el ADNmt coincida entre Skeleton 1 y ML1
podría haber ocurrido por casualidad. No coincidencias con la secuencia observada se encontraron
en una base de datos de 26,127 secuencias de región de control de mtDNA europeas completas
(http://empop.org/)29 ni en una base de datos de 1,832 Islas Británicas muestras30 que cubren
solo las posiciones 16,093-16,320 y 00073- 00188, lo que sugiere que el haplotipo es raro. MtDNA
las frecuencias de haplotipos no varían mucho en Europa (http: // empop.org/) y la movilidad
femenina entre la nobleza europea tiende a ser más alto que la población general. Por lo tanto, la
ausencia de cualquier coincidencia entre las 26.127 secuencias europeas justificaría un valor de
probabilidad de coincidencia conservador de alrededor 1 en 10,000 Sin embargo, para errar por el
lado de la precaución, utilizamos solo la base de datos británica más pequeña y de menor
resolución para obtener un valor de probabilidad de coincidencia muy conservador de 2 / 1,832
(ver Métodos suplementarios). Cabello y color de ojos predichos por ADN. Los datos genéticos
también pueden ser utilizado para inferir rasgos fenotípicos como el color del cabello y los
ojos31,32. No hay retratos contemporáneos de Ricardo III (ref. 33), todos de después de su
muerte por alrededor de 25 años o más (ver la nota complementaria 4 y la figura complementaria
6). El análisis dendrocronológico ha confirmado que los primeros todos los retratos conocidos de
Richard III que han sobrevivido son la Sociedad de Antiquaries of London (SAL) Arched-Frame
portrait y el retrato en la Colección Real, ambos pensados hasta la fecha dentro de unos pocos
años el uno del otro en la década de 1510. El retrato de SAL es muy diferente de otras pinturas del
rey, que parecen derivar de un tipo original representado por el retrato de la Real Colección. El
retrato de SAL tampoco ha estado sujeto a significativa sobreimpresión posterior33. La tipificación
del ADN del color de los ojos y el cabello se llevó a cabo utilizando sondas diseñado para
HIrisPlex31 SNPs y, donde sea necesario, seguido mediante PCR dirigida usando cebadores
recientemente diseñados para generar amplicones de menos de 100 pb de longitud, seguidos de
una secuencia en un Ion Torrent PGM (ver Tabla Suplementaria 9). Fenotipo las predicciones se
produjeron a partir de IrisPlex y HIrisplex31 modelos estadísticos34. Estos resultados muestran
que Skeleton 1 tenía un 96% probabilidad de tener ojos azules junto con un 77% de probabilidad
tener el cabello rubio (vea la Fig. 2a-b y la Nota Suplementaria 4). La Figura 2a-d muestra los ojos
azules de los europeos contemporáneos cuya Las predicciones de ADN caen dentro del rango de
alta probabilidad azul estimado a partir del perfil de Skeleton 1. Del mismo modo, Fig. 2e y f
muestra el color del pelo rubio dentro del rango del rubio alto probabilidad estimada del perfil de
Skeleton 1. Sin embargo, las predicciones actuales de ADN del color del cabello se parecen al
cabello de la infancia color y es importante tener en cuenta que en cierta rubiaindividuos, el color
del cabello puede oscurecerse durante la adolescencia. Es por lo tanto, es posible que Skeleton 1
tuviera cabello castaño como se representa en la Fig. 2g y h como se ve en los europeos
contemporáneos con un probabilidad rubia similarmente alta como la obtenida para Skeleton 1.
pintura de Ricardo III que más se asemeja a la genéticamente los resultados predichos para los
ojos y el color del cabello son los SAL Arch-Framed retrato (ver Fig. 2i y Nota Suplementaria 5).
Análisis estadístico. Para obtener una probabilidad de que Skeleton 1 sea ese de Richard III,
consideramos los datos no genéticos (radiocarbono datos6, edad estimada de muerte, sexo,
presencia de escoliosis8 y presencia de heridas perimortem7) junto con los datos genéticos
(mtDNA y cromosoma Y). Para cada tipo de datos, calculamos Probabilidades para los datos
observados en la hipótesis 1 (H1-que Skeleton 1 es Richard III) y bajo la hipótesis 2 (H2-that
Skeleton 1 no es Richard III). Aunque la evidencia de mtDNA favorece a H1, la evidencia del
cromosoma Y brindada es limitada evidencia contra H1, y nuestro análisis conservador de la la
evidencia genética solo dio un soporte moderado para H1 (probabilidad) relación, LR ¼ 79; ver
Métodos Suplementarios). Usando un escéptico probabilidad previa de 0.025 que el esqueleto 1
es el de Richard III, obtuvo una probabilidad posterior de 2/3 de que H1 sea verdadero. Sobre el
otra mano usando una probabilidad previa de 0.5, la evidencia genética conducen a casi el 99% de
probabilidad de que H1 sea verdadero. Este análisis es muy conservador porque, primero, usaba
una tasa baja por falsa paternidad eventos, y en segundo lugar, la probabilidad de que coincida
con mtDNA por casualidad (probabilidad de coincidencia) utilizado fue mayor que 0.001, mucho
más alta de lo que sería sugerido por la ausencia de control de la región coincidencias en la base
de datos europea (n ¼ 26,127, LR ¼ 6,847). Además, este análisis no tiene en cuenta el genoma
completo coincidencia de mtDNA con un pariente moderno y una base única diferencia con un
segundo Notamos que si ignoramos el Evidencia del cromosoma Y, debido a su susceptibilidad a la
falsa paternidad eventos, la contribución de los datos genéticos se fortalece considerablemente
(LR ¼ 478). La evidencia no genética fuertemente admite H1 (LR ¼ 85,000). Toda la evidencia
combinada es por lo tanto, extremadamente fuerte para soportar H1 (LR ¼ 6,7 millones). Este LR
conduce a una probabilidad de que H1 sea verdadero entre 0.999994 (escéptico anterior) y
0.9999999 (0.5 previo, vea el Suplementario Tabla 10). Todas las probabilidades se calcularon bajo
conservador supuestos (discutidos en los Métodos Suplementarios) y por lo tanto, estos valores
informados son casi seguramente menores que justificado por la evidencia. Discusión La búsqueda
de los restos de Ricardo III se puede comparar a una caso de la persona desaparecida, con tales
investigaciones cada vez más difícil cuanto mayor sea el tiempo entre la investigación y el tiempo
de muerte del individuo35,36. Teniendo en cuenta los 527 años que tuvieron transcurrido desde la
muerte de Richard en Bosworth, este caso es especial interés en que es el caso de identificación
de ADN más antiguo de un conocido individuo hasta la fecha. Como en cualquier caso, todos los
hilos cuantitativos de evidencia debe ser utilizado para llegar a una conclusión sobre la identidad
de cualquier candidato putativo. Este informe es el primero que reúne todos los hilos disponibles y
estima la apoyo estadístico para los restos esqueléticos descubiertos en 2012 siendo los del último
rey de Plantagenet, Ricardo III. Al reunir la evidencia, documentos históricos indicó que estaríamos
buscando los restos de un individuo que fue descrito, durante su vida, como teniendo uno hombro
más alto que el otro, que, en 1485, de 32 años, murió en el el calor de la batalla antes de regresar
a Leicester para ser enterrado en el coro de la iglesia de los Frailes Grises. En septiembre de 2012,
se encontraron los restos de un individuo que se ajusta a todos estos criterios. Posteriormente,
además del atractivo arqueológico evidencia, análisis de laboratorio proporcionaron información
sobre radiocarbono dating6, análisis isotópicos9, el grado y la naturaleza del escoliosis8 y las
lesiones sufridas7. Presentamos la genética análisis de los restos y los únicos parientes femeninos
conocidos de Richard III y encuentra una coincidencia positiva de mtDNA. Mientras que hay No
hubo coincidencia del cromosoma Y entre los restos del esqueleto y cinco parientes de línea
masculina determinados genealógicamente, dado el posibilidad conocida de una paternidad falsa
durante varias generaciones, esto no demostró ser un factor altamente significativo. Uno puede
especular que un evento de falsa paternidad (o eventos) en algún punto (s) en esta genealogía
podría ser de importancia histórica clave, particularmente si ocurrió en las cinco generaciones
entre John de Gaunt (1340-1399) y Ricardo III (véase la Fig. 2 complementaria). Una falsa
paternidad entre Eduardo III (1312-1377) y Juan significaría que el hijo de Juan, Enrique IV (1367-
1413), y el hijo de Enrique los descendientes directos (Henry V y Henry VI) no tendrían reclamo
legítimo de la corona. Esto también sería cierto, indirectamente, para toda la dinastía Tudor
(Enrique VII, Enrique VIII, Eduardo VI, María I y Elizabeth I) desde su reclamo a la corona también
descansó, en parte, en su descenso de Juan de Gaunt. Los reclamo de la dinastía Tudor también
sería cuestionado si la falsa paternidad ocurrió entre Juan de Gaunt y su hijo, John Beaufort, conde
de Somerset. Si la paternidad falsa ocurrió en cualquiera de las tres generaciones entre Edward III
y Richard, Duque de York, el padre de Eduardo IV y Ricardo III, entonces ninguno de sus reclamos a
la corona habría sido legítimo. Analizando toda la evidencia disponible en un marco bayesiano,
incluso utilizando medidas muy conservadoras, concluimos que la la evidencia es abrumadora que
el Esqueleto 1 de los Frailes Grises El sitio en Leicester es el de Richard III, cerrando así un 500-
plusplus persona desaparecida.
Métodos

Ubicaciones de laboratorio. Todo el trabajo de ADN involucrando a los parientes modernos fue
llevado en la Universidad de Leicester. Los parientes de línea masculina se escribieron utilizando
Promega PowerPlex Y23 y para SNP que definen los principales haplogrupos Y europeos en
Leicester con un subconjunto de la tipificación confirmada en la Universidad Paul Sabatier. Los
parientes femeninos fueron secuenciados para todo el genoma mitocondrial en la Universidad de
Leicester. Se extrajo ADN de dientes y huesos antiguos en la Universidad de York y la Universidad
Paul Sabatier, Toulouse. Preparación de la biblioteca y el enriquecimiento del objetivo se
realizaron en la Universidad de York. Single-end La secuenciación de 100 pb con HiSeq 2000
(Illumina, CA, EE. UU.) Se realizó en Instalación de Secuenciación de Copenhague. Secuenciación
dirigida de los modernos y antiguos El ADN también se llevó a cabo en la plataforma técnica
genómica PlaGe (Genopole, Toulouse, Francia) y en el Laboratorio de Química de Ácido Nucleico
de Proteína en la Universidad de Leicester. A continuación ofrecemos una versión condensada de
los métodos utilizados. Para cada paso, se puede encontrar información completa en los Métodos
Suplementarios. Detalles que rodean la extensa investigación genealógica llevada a cabo para este
proyecto se puede encontrar en la Nota complementaria 2. Coleccion de muestra. El ADN fue
extraído de muestras de saliva de la moderna familiares de Richard III y todos los participantes
fueron reclutados con consentimiento informado siguiente revisión del proyecto por parte del
Comité de Ética en Investigación de la Universidad de Leicester. El esqueleto 1 fue excavado y las
muestras tomadas en condiciones limpias37. Todo el mundo involucrado en la excavación en el
sitio de Gray Friars, el laboratorio limpio en Leicester y aquellos involucrados en los laboratorios y
los laboratorios tenían su mitocondrial y, para los hombres, los cromosomas Y tipificados. El ADN
se extrajo de muestras de saliva y todo los participantes fueron reclutados con consentimiento
informado. Extracción de ADN de muestras antiguas. El ADN fue extraído de dientes y huesos
(fémur) muestras. Todos los procedimientos se realizaron en ADN antiguo dedicado laboratorios
de la Universidad de York y la Universidad Paul Sabatier, Toulouse con precauciones de
contaminación apropiadas en su lugar. Dos espacios de extracción fueron incluido y tratado
exactamente como si fueran extractos durante todo el proceso. Las PCR y los experimentos de
biblioteca también incluyeron controles en blanco adicionales. Ensayo de tipificación sexual
realizado en Skeleton 1. Un nuevo ensayo de tipificación sexual que comprende cebadores de PCR
para la coamplificación del fragmento SRY con UTX y regiones homólogas UTY se utilizó. Este
ensayo fue diseñado para permitir fragmentos de tamaño relativamente pequeño de SRY, UTX y
UTY para ser coamplificados a partir de muestras que probablemente contengan ADN
degradado10. Análisis de la región control Mitocondrial de Skeleton 1. Análisis de la hipervariable
segmentos (HV1, HV2 y HV3) de la región de control de mtDNA se llevaron amplificando y
secuenciando directamente múltiples fragmentos superpuestos que van de 153 a 250 pb de
tamaño (http://forensic.yonsei.ac.kr/protocol/mtDNA-midimini.pdf)22. Se utilizó una selección de
amplicones para clonar los productos de PCR en el laboratorio en Toulouse. La secuenciación se
llevó a cabo utilizando Big-Dye Terminator V3.1 kit de secuenciación de ciclos (Applied Biosystems)
por electroforesis capilar en un ABI Prism 3730 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) en Protein
Nucleic Laboratorio de Química Ácida en la Universidad de Leicester o en el laboratorio genómico
plataforma técnica PlaGe (Genopole). Genoma mitocondrial / Y-SNP / tipificación HIrisplex de
Skeleton 1. Las bibliotecas fueron construido siguiendo Meyer y Kircher16, con la excepción de
que el primer paso de filtración entre la reparación del extremo romo y la ligadura del adaptador
fue sustituido por calor inactivación de las enzimas38,39. Se diseñaron dos microarrays, uno para
enriquecimiento de mtDNA y otro para enriquecimiento nuclear de SNP. ADN el enriquecimiento
se realizó por captura de hibridación usando el ADN Agilent 244k SureSelect microarray (Agilent,
Bo¨blingen, Alemania). Para la captura nuclear, Las sondas del cromosoma Y se diseñaron para
cubrir los SNP relevantes para los principales Linajes europeos14. Se diseñaron otras sondas para
cubrir los SNP relevantes para los marcadores HIrisplex31. Estos dos conjuntos de sondas
(mitocondriales y SNP) se se usa por separado para llenar los dos diseños diferentes de
microarrays de un formato de 1 244 K. Para cada micromatriz, el protocolo de captura se realizó
siguiendo Hodges et al.15 con las modificaciones propuestas por Zhang et al.40 y Fortes y
Paijmans38. Los bibliotecas se agruparon en cantidades equimolares y secuenciadas en dos
carriles de la Plataforma Illumina HiSeq 2000 en el modo 100 SE en la instalación de secuenciación
del Universidad de Copenhague, Dinamarca. Las lecturas en bruto de cada biblioteca se ordenaron
según el índice de seis nucleótidos utilizado durante la preparación de la biblioteca. Solo se lee con
un 100% de coincidencia con el índice cuando seleccionado para análisis adicionales. Lee menos
de 25 nucleótidos fueron descartados de un análisis posterior. Las lecturas recortadas se asignaron
a autosomas y sexo cromosomas de la construcción del genoma de referencia humano 37
(GRCh37) y al rCRS (NC_012920.1) usando bwa 0.7.5a-r405 (ref.41). En cada alineación, la salida
Los archivos bam se fusionaron utilizando SAMtools 0.1.19 (ref. 41) y los duplicados de PCR fueron
eliminado posteriormente. Las lecturas mapeadas se filtraron según una calidad de mapeo 429 y
su alineación a posiciones únicas a lo largo de la secuencia de referencia. Las posiciones
polimórficas se identificaron usando SAMtools (SAMtools 0.1.19) y bcftools. Finalmente, vcfutils.pl
se utilizó para filtrar la lista de variantes de acuerdo con un Phred-escala genotipo probabilidad
posterior calidad 420 y una profundidad de lectura mayor de 10. Para evitar errores de llamada
debido al patrón de desaminación de ADN antiguo moléculas, todas las posiciones polimórficas
informadas en el archivo de salida vcf fueron revisado por ojo En el caso del genoma mitocondrial,
el ensamblaje al la referencia se visualizó en Tablet42, mientras que la alineación de las lecturas
que contiene los SNP a los cromosomas de referencia se visualizaron usando IGV43. Tipificación de
SNP por PCR. El enfoque de captura arrojó una cobertura insuficiente para todos Los SNP HIrisPlex
y cromosoma Y y, por lo tanto, los cebadores se diseñaron para generar amplicones que contienen
estos SNP, así como dos SNP, que definen Haplogrupo G cromosómico: M285 (G1) y P287 (G2)
(referencia 14). Éstas eran amplificado como parte de las reacciones multiplex siguientes Ro'mpler
et al.44 o singleplex reacciones (utilizando 40 ciclos y sin amplificación secundaria) y secuenciado
en el Ion Torrent después de la preparación de la biblioteca usando Ion PGM 200 Xpress Template
Kit de secuenciación Kit y PGM 200. Para aumentar la cobertura, PCR singleplex y la secuenciación
de un marcador (rs28777) se llevó a cabo de acuerdo con Binladen et al.45. La tipificación del
haplogrupo G que define los SNP (M201, M285 y P287) fue repetido en Toulouse utilizando PCR
únicas. La secuenciación de estos productos de PCR fue llevado a cabo con el kit de secuenciación
de ciclo Big-Dye Terminator V3.1 (Aplicado Biosystems) analizados por electroforesis capilar en un
ABI Prism 3730 Genetic Analizador (Applied Biosystems) en la plataforma técnica genómica PlaGe
(Genopole). Análisis de haplotipos cromosómicos Y Muestras antiguas y modernas 'Y-
chromosomal haplotipos se obtuvieron utilizando el sistema PowerPlex Y23 (Promega) y analizado
por electroforesis capilar en un analizador genético ABI Prism 3730 (Applied Biosystems) en la
plataforma técnica genómica PlaGe (Genopole) y en un analizador genético ABI Prism 3130xl
(Applied Biosystems) en la Universidad de Leicester. Para Skeleton 1, esto se llevó a cabo en tres
extractos separados (RM2, LM1 y LM3) en dos laboratorios de ADN antiguos diferentes (York y
Toulouse). Para el parientes modernos, esto se llevó a cabo en dos extractos diferentes en dos
diferentes laboratorios modernos (Leicester y Toulouse). Análisis SNP cromosómico Y de muestras
modernas. Siguiente determinación del haplotipo Y para las muestras modernas de línea
masculina, el haplogrupo predicho se determinó usando el predictor haplogrupo de Whit Athey
(http://www.hprg.com/ hapest5 / hapest5a / hapest5.htm? order = num). Marcadores binarios
que cubren estos y los linajes relacionados se escribieron en dos multiplexes mediante la
minisecuenciación SNaPshot procedimiento (Applied Biosystems) y un analizador genético
ABI3130xl (aplicado Biosystems) seguido de confirmación usando la secuencia de Sanger.
Somerset 3 era determinado ser Hg I (M170 þ M223, M253) 14 derivado, confirmado por el
laboratorio en Toulouse. Somersets 1,2,4 y 5 se determinaron derivar para R1b-U152. Somersets
1,2,4 y 5 se analizaron para detectar SNP que subdividen este clado13 (Z56, M126, Z36, Z192,
M160 y L2) usando la secuenciación de Sanger en ambos laboratorios. METRO Análisis moderno
de mtDNA. Ambas muestras fueron replicadas dos veces. Las muestras se tomaron usando kits de
recolección de ADN de Oragene (DNA Genotek) y ADN extraído utilizando dos métodos diferentes:
la sangre de Qiacube y el líquido corporal protocolo (200 ml con 200 ml de elución) y el protocolo
de Oragene. Para analizar el región de control, las muestras se secuenciaron dos veces tanto en
avance como en retroceso dirección usando dos conjuntos de cebadores superpuestos (15973-296
y 16524-614) usando BigDye Terminator V 3.1 (Applied Biosystems). No se encontraron diferencias
entre replica o entre muestras. Las muestras se amplificaron para el genoma mitocondrial
completo de ambos extracciones siguiendo Meyer et al.26 amplicones de PCR fueron
secuenciados en un ion Torrent PGM Sequencer en un chip Ion314. Las bibliotecas se prepararon
usando el Ion Xpress Plus gDNA Fragment Library Kit de preparación, mientras que la plantilla la
preparación y la secuenciación se llevaron a cabo utilizando el Ion PGM 200 Xpress Kit de plantilla
y el Kit de secuenciación Ion PGM 200, respectivamente. Las lecturas sin formato fueron mapeado
al rCRS (NC_012920.1) utilizando el software TMAP incluido en el Complemento Ion Alignment
3.2.1 (Torrent Suite Software 3.2.1) en el Ion Torrent servidor. La eliminación de lecturas
duplicadas y las llamadas de variantes se realizaron utilizando SAMtools 0.1.19 (ref.41) y
realineamiento local se llevó a cabo con el genoma Kit de herramientas de análisis46. Los sitios
variantes se filtraron para calidad de base 20, asignación Calidad 50 y profundidad de cobertura 30
después de lo cual 33 sitios polimórficos fueron retenido Todos estos sitios han sido revisados y
confirmados manualmente por Sanger secuenciación en ambas direcciones y replicado dos veces.
Control y cuantificación de la contaminación. Contaminación moderna por ADN del los restos
antiguos fueron controlados por los siguientes métodos: 1. La excavación se llevó a cabo en
condiciones de limpieza (véase el Suplemento Métodos) 2. Las muestras se almacenaron en
laboratorios limpios y el antiguo trabajo de ADN se llevó a cabo solo en instalaciones dedicadas de
ADN antiguo. 3. Se procesaron muestras antiguas separadas en laboratorios separados para
replicar los resultados. 4. Todos los miembros del laboratorio y los participantes de la excavación
tenían su mtDNA escrito y La tipificación del cromosoma Y se llevó a cabo en todos los hombres
implicados. Ninguno tenía una que coincida con el ADN mitocondrial o el cromosoma Y. Como
evidencia contra la contaminación significativa, el análisis de ADN de Skeleton 1 muestra una
coincidencia perfecta de mtDNA con ML1 y una diferencia de base única con ML2.

También muestra un haplotipo Y-STR claro, que ha sido replicado usando varios extractos
generados y probados en dos laboratorios independientes. Finalmente, un examen (ver Métodos
Suplementarios) del patrón de sustitución en nuestras lecturas también lo respalda. Análisis
estadístico. Tomando un enfoque conservador en cada paso, calculamos un probabilidad para
cada elemento de evidencia observada en cada uno de los dos opuestos hypotheses: Hipótesis 1
(H1): Skeleton 1 es Richard III, y Hypothesis 2 (H2): Skeleton 1 no es Richard III. Como era
razonable suponer que todas las diferentes líneas de evidencia eran independiente, la
probabilidad conjunta de todas las pruebas se obtuvo por multiplicación de las probabilidades
individuales bajo cada hipótesis. El peso de la evidencia para H1, llamada razón de verosimilitud
(LR), fue dada por la razón de la probabilidad debajo de H1 a eso bajo H2. Decimos que una
suposición es "conservadora" si reduce el LR. El LR se puede convertir en una probabilidad de que
H1 sea verdadero, dado un previo probabilidad. Tomamos como punto de partida el momento en
que Skeleton 1 fue el primero observado y reconocido como un esqueleto humano, pero antes de
cualquier evaluación de la edad, sexo, estado de salud y causa de la muerte. En ese punto, había
evidencia sustancial de que un esqueleto encontrado en lo que se cree que ha sido el La ubicación
del coro de los frailes de Leicester Gray podría ser la de Ricardo III. Toda la información disponible
en el momento en que se desenterró el Esqueleto 1, incluido su ubicación precisa y la naturaleza
de la tumba, se consideró para este análisis como información de fondo que puede informar la
probabilidad previa. Sobre la base de eso información, creemos que un observador escéptico no
podría razonablemente tener asignó una probabilidad previa menor a 1 en 40. Este valor fue
propuesto en un análisis (http://rationalgareth.com/), basado en lo que juzgamos escéptico
evaluaciones. La mayor probabilidad que podría justificarse con la evidencia anterior podría ser 1
en 2. Hemos utilizado datos relevantes y disponibles siempre que sea posible. Inevitablemente
subjetivo se requieren juicios, por ejemplo, las poblaciones de referencia relevantes y las
probabilidades de error en los hechos informados. En la medida de lo posible y razonable, nos
esforzamos por ser conservadores en nuestro enfoque, por ejemplo, utilizando un método
pseudocount para sesgar el LR hacia un valor neutral de 1, tendiendo a evitar valores grandes
falsos a partir de bajas frecuencias observadas. Detalles de los datos y métodos utilizados en el
análisis estadístico de los datos de radiocarbono, edad y sexo de esqueleto, presencia de
escoliosis, presencia de heridas perimortem, cromosoma Y y los datos de frecuencia de mtDNA se
pueden encontrar en los Métodos Suplementarios. A Resumir los resultados: los datos de
radiocarbono arrojaron una razón de probabilidad de 1.84 representando soporte limitado para
H1. Los datos de edad y sexo arrojaron una probabilidad ración de 5.25, representando de nuevo
apoyo limitado para H1. La presencia de uno hombro más alto que el otro, informado durante la
vida de Richard, podría ser atribuido a la escoliosis (Esqueleto 1 tenía escoliosis idiopática grave de
inicio en la adolescencia) o dos otras condiciones conocidas, la parálisis de Erb y la deformidad de
Sprengel, ambas de que son muy raros. En H1, las tasas anteriores dan una probabilidad estimada
de 0,90 de observar escoliosis dada la descripción del aspecto físico de Ricardo III (¼ la tasa de
escoliosis dividida por la suma de las tres tasas), que multiplicamos por 0.95 para permitir la
posibilidad de que la descripción grabada sea incorrecta. Esta conducen a un LR de 212,
proporcionando un soporte moderadamente fuerte para H1. La presencia de las lesiones
perimortem dieron una LR de 42, y un soporte tan moderado para H1. Los El cromosoma Y del
esqueleto 1 no coincide con el del genealógico determinado familiares patrilineales de Ricardo III.
Esto podría ser explicado por una falsa paternidad evento en uno o más de los 19 supuestos
vínculos padre-hijo entre Ricardo III y Henry Somerset, quinto duque de Beaufort. Los resultados
del cromosoma Y también indican otro evento de falsa paternidad entre Henry Somerset y sus
cinco contemporáneos, presuntos descendientes patrilineales. Para ser conservador,
seleccionamos un tasa de paternidad falsa publicada que fue (1) más baja que cualquier otra tarifa
publicada que consideramos17,47 y (2) basados en datos genealógicos18. A esto agregamos la
falsa paternidad evento en los 19 supuestos vínculos padre-hijo entre Henry Somerset y cinco
Somersets masculinos contemporáneos. Esto da una probabilidad de al menos una falsa evento de
paternidad en los 19 supuestos vínculos padre-hijo entre Ricardo III y Enrique Somerset de 0.16.
Dado que un evento de falsa paternidad debe haber ocurrido en H1, la frecuencia de población del
haplotipo Y de Skeleton 1 es la misma en H1 y H2 y cancela en el cálculo de LR. Por lo tanto, el LR
es 0.16, representando limitado evidencia contra H1. Las secuencias de mtDNA de Skeleton 1 y la
presunta matrilineal de 19 meiosis pariente de Richard III, Michael Ibsen, coincidió por completo.
Un pariente de 21 meiosis también emparejado excepto en una base (8994). La última
observación es igualmente probable bajo H1 y H2 dada la secuencia observada de Michael Ibsen, y
por lo tanto cancela en el LR. Por lo tanto, solo necesitamos probabilidades para la observación de
la secuencia compartido por Michael Ibsen y Skeleton 1. Para obtener la probabilidad bajo H1,
requerimos la tasa de mutación mtDNA, y en este caso, las estimaciones altas son conservadoras.
Parsons et al.28 informan 10 regiones de control mutaciones en 327 generaciones utilizando
datos genealógicos. Porque esto sugiere una tasa más alta que otras estimaciones publicadas, y se
basa en datos genealógicos, lo usó para derivar una probabilidad de 0.52 para ninguna mutación
en 19 meiosis. Para la probabilidad bajo H2, necesitamos la fracción de población del esqueleto 1
haplotipo Aunque obtuvimos la secuencia completa del genoma de mtDNA de Esqueleto 1,
identificamos pocos datos de comparación de genoma completo publicados de Inglaterra. Por lo
tanto, para el análisis estadístico, utilizamos solo las regiones de control de mtDNA entre las
posiciones 16,093 y 16,320 y entre 00073 y 00188, para lo cual obtuvieron datos adecuados de
comparación en inglés de una actualización de Ro¨hl et al.30, suplementado con secuencias de
mtDNA suministradas por Roots for Real (Genetic Ancestor Ltd., Clare, Suffolk, Reino Unido).
Usando solo estas secciones cortas del control la región bajo H2 es conservativa, ya que la fracción
de población de lo observado las secuencias de la región de control no pueden ser menores que
las del genoma de ADNmt completo. La población de referencia relevante es más de 500 años en
el pasado, pero debido a la gran tamaño de la población durante el período considerado,
esperamos que la población frecuencias que han cambiado poco en los últimos cinco siglos.
Encontramos el frecuencia del haplotipo de esqueleto 1 para ser 0 entre 1823 en la base de datos,
para a lo que agregamos la única instancia observada en Michael Ibsen. Este enfoque es, de
nuevo, conservador como Michael fue muestreado debido a su conocida genealogía relación con
Richard III. Esto lleva a un LR de 478 que representa moderadamente fuerte evidencia de H1.
También notamos que no hubo coincidencias en una base de datos de 26,127 haplotipos de la
región de control mitocondrial (www.empop.org) 29. No confiamos en esta base de datos porque
es a nivel europeo en lugar de específica para Inglaterra y porque de problemas de determinación,
pero sugiere que el haplotipo de esqueleto 1 puede ser mucho más raro de lo que se puede
deducir de nuestra base de datos en inglés más pequeña. También observamos que la movilidad
femenina entre la nobleza europea es probable que haya sido mucho mayor que para la población
en general, debido a las prácticas matrimoniales relacionadas con la política formación de alianzas
Dichas prácticas proporcionarían alguna justificación para usar el Base de datos de mtDNA
europea, y por lo tanto para considerar el haplotipo encontrado en Skeleton 1 y Michael Ibsen son
extremadamente raros. En la Tabla Suplementaria 10, mostrar algunos resultados ilustrativos
utilizando la base de datos europea para demostrar la implicaciones de establecer que el
haplotipo Skeleton 1 es tan raro como lo sugiere esa base de datos. Los LR para diferentes
combinaciones de la evidencia, y dos posteriores probabilidades, se muestran en la Tabla
Suplementaria 10. Utilizando toda la evidencia, el el soporte para H1 es extremadamente fuerte
con una LR de 6.7 millones, de modo que nuestro escéptico sería llevado a la conclusión de que la
probabilidad de que Skeleton 1 no sea Richard III tiene menos de 1 en 100,000, mientras que para
aquellos que toman una posición inicial de 1 en 2 esa probabilidad es mucho menor que 1 en un
millón. Teniendo en cuenta la suposiciones conservadoras subyacentes a nuestro cálculo descrito
anteriormente, consideramos esto como establecer la verdad de H1 más allá de toda duda
razonable.

• ¿Cuál es la hipótesis que se intenta comprobar con este estudio?

Según el estudio se intenta comprobar la identificación de un cadáver el cual se cree que

perteneció a Ricardo 3, en el cual se realizaron estudios pertinentes como la construcción de su
árbol genealógico entre otras para poder aceptar la hipotesis

• ¿Cuáles son los objetivos del artículo? El articulo y los autores tienen como objetivo identificar el
cuerpo de Ricardo tercero por medio de recursos genéticos.

• ¿Cómo contribuye este estudio a la disciplina? La contribución de este articulo es de gran

importancia puesto que se realizaron estudios genéticos por medio de metodologías las cuales
implementaron recursos genéticos como el dna, pues este estudio nos enseña a la identificacion
de alguna especie sin importar el tiempo de existencia de esta y sus parentescos atraves de la
gemetica.

• ¿Cuáles son las fuentes de información utilizadas en este artículo? referencias

• ¿Cuáles fueron los métodos utilizados en la investigación? Para realizar este articulo fue
necesario iniciarcon la construcción del árbol genealógico, en seguida se da a la busquedade los
posibles familiares que en este caso fueron 5 y de hay se realizo las pruebas pertinentes para
saber el resultadop

• ¿Cuáles son los datos presentados como evidencia en este artículo?

• ¿Cuáles son las conclusiones principales del artículo?

Preguntas críticas

Las siguientes preguntas te pueden ayudar a ser crítico con la lectura:

• ¿Cuál es la importancia o relevancia de la investigación?

• ¿Cuán apropiados son los procedimientos y técnicas de investigación utilizados por el autor?

• ¿Se presentó la suficiente evidencia como para juzgar los resultados de la investigación por uno
mismo? Los hallazgos

presentados, ¿se pueden aplicar a otras observaciones (propias o de otros autores)?