LABORATORIO MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

PRÁCTICA DE LABORATORIO
MEDIDAS DE CRECIMIENTO MICROBIANO

DEFINICIÓN

El crecimiento microbiano se puede conocer por medio de técnicas especiales, ya sean, medidas
directas, como: recuentos electrónicos o recuentos directos al microscopio, cálculo del número
más probable y el recuento en placa. El recuento directo al microscopio o el recuento electrónico
proporcionan un recuento de todas las células, tanto las vivas como las muertas, un recuento de
viables mide sólo las células vivas de una población, es decir, aquellas capaces de reproducirse. Los
recuentos en placa y el NMP son recuentos de viables.

El recuento microscópico requiere solamente un microscopio óptico y una cámara, es un método

rápido y económico pero presenta inconvenientes en la observación y cuantificación cuando las
células son muy pequeñas o las poblaciones son de baja densidad. Una de las cámaras más
utilizadas en este tipo de determinación es la de Neubauer.
La cámara de Neubauer es un portaobjeto con una depresión en el centro. En el fondo de la
cámara tiene marcada una cuadricula con la ayuda de un diamante con un volumen de 0,1 mm 3.

Entre las medidas indirectas, una de las más utilizadas es la medición de la turbidez de los cultivos
en un espectrofotómetro, es relativamente rápida y se basa en la capacidad de las células
microbianas de dispersar la luz que incide sobre estás, de esta forma el grado de dispersión es
proporcional a la concentración de células presentes pero no se puede diferenciar la turbidez dada
por células viables o no viables.

La medida más utilizada en microbiología es el recuento en placa, en él, se cultivan los

microorganismos en medios de cultivo específicos para un determinado grupo en estudio, esta
técnica se basa en la suposición de que cada bacteria que crezca en el medio de cultivo producirá
una colonia visible, en consecuencia el número de colonias que se observan a simple vista será
igual al número de unidades formadoras de colonias inoculadas en el agar multiplicadas por la
dilución.

1. MATERIALES
- Cámara de Neubauer
- Capilares
- Laminas cubreobjetos
- Celdas espectrofotómetro

2. MEDIOS DE CULTIVO
NA
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3. REACTIVOS
- Tubos tapa rosca con 9 ml de agua peptonada

4. EQUIPOS
- Microscopio
- Espectrofotómetro

5. PROCEDIMIENTO

Agitar suavemente el frasco que contiene el cultivo de estudio y preparar diferentes diluciones,
mínimo tres, en tubos con agua peptonada. Etiquetar los tubos con la dilución correspondiente.

Recuento en cámara de Neubauer

Limpie con un paño suave, sin frotar, la cámara y una lámina cubreobjetos, humedezca con agua
destilada los soportes exteriores y coloque la lámina sobre la zona central limitada por los dos
soportes laterales, donde se aprecia una zona cuadriculada a simple vista.

Homogenice la muestra que se va a utilizar en el recuento, con la ayuda de un capilar deposite una
gota entre la cámara y el cubreobjetos por el borde de la cámara. Figura 1. Permita que la muestra
se distribuya por capilaridad, evite el exceso que dificultará el montaje, si quedan burbujas o no
queda completamente cargada, lave y repita el montaje.

Fig. 1. Montaje de la muestra en la cámara de Neubauer

Deje reposar la cámara durante 5 minutos, coloque la cámara en la platina y utilice el objetivo de
10x para enfocar la zona cuadriculada y cambie al objetivo de 40x para iniciar el recuento.

La cuadrícula de recuento está formada por 9

cuadrados grandes, cada uno de ellos con una
superficie de 1 mm2. (Indicados con el numero 1)
Figura 2.
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El cuadrado grande central (que se puede ver en su totalidad con el objetivo 10X), está dividido en
25 cuadrados medianos como se indica en la figura con el número 3 (con el objetivo 40X se pueden
ver los cuadrados medianos completamente), cada uno de ellos con 16 cuadrados pequeños en su
interior. Los cuatro cuadrados grandes de las esquinas, están formados por 16 cuadrados
medianos. (Indicados con el número 2)

El recuento se puede realizar tanto en el cuadrado grande central como en los de las esquinas,
dependiendo del tamaño de las células en estudio.

Identifique el cuadrado central conformado por 25 cuadrados pequeños limitados por triple línea,
revise que la muestra se haya distribuido uniformemente e inicie el recuento seleccionando los
cuadrados de las esquinas y el central. Si las células tocan los límites de los cuadros, deberán
contarse solamente aquellas que toquen la parte superior y el lado izquierdo del cuadro. Figura 3.
Si las células tocan la parte inferior o el lado derecho no se cuentan. Utilice las indicaciones de la
figura 4 para realizar el recuento. Estos dos métodos reducen las posibilidades de contar la misma
célula dos veces.

Fig. 3. Límites de los cuadros Fig. 4. Recuento en Zigzag

Para obtener el resultado del número de células/ml se deben tener en cuenta el volumen del
líquido en la cámara. Cuando colocamos la muestra bajo el cubreobjetos, la suspensión celular
alcanza una altura de 0,1 mm. Teniendo estos datos en cuenta, y si consideramos uno de los
cuadrados grandes, el volumen contenido en éste será de:

1mm x 1mm x 0,1mm = 0,1 mm3 = 10-4 ml

Si hemos contabilizado N células en uno de los cuadrados grandes (o sea, en 25 cuadrados

medianos), la concentración de la muestra será:
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N x 104 cel/ml

Si para hacer el recuento hemos tenido que diluir la muestra inicial, hemos de tener en cuenta este
factor de dilución (fd):

N x 104 x fd cel/ml

INMEDIATAMENTE después de realizado el recuento, se retira el cubre-objeto y se limpia la

cámara con agua o – si es necesario - con un detergente suave. A continuación, la cámara se seca
con un paño blando.

Recuento indirecto por espectrofotometría

- Encienda el equipo y permita que realice toda la secuencia de encendido, alrededor de 2

minutos, es deseable que el equipo se encienda con 30 minutos de anterioridad al inicio
de la práctica. Ajuste la longitud de onda en 520 nm, con las flechas que indican nm
- Coloque en el portaceldas un medio de cultivo estéril (sin inocular) y cierre el
compartimiento de muestras, oprima el botón 0 Abs/100%T para llevar el blanco a 0
absorbancia ó 100% transmitancia dependiendo de la lectura que se va a realizar.
- Retire el blanco e inserte la muestra cierre el compartimiento y realice la lectura
- Asegúrese de leer el parámetro adecuado oprimiendo el botón A/T/C para cambiar entre
las diferentes medidas

6. EXPRESIÓN DE RESULTADOS

Complete la información de la siguiente tabla de acuerdo a los resultados obtenidos. Realice una
gráfica que relacione los resultados obtenidos. Absorbancia vs. # células totales/ ml

Recuento en cámara Neubauer (

Dilución Absorbancia
# células totales/ml)

BIBLIOGRAFIA
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Manual de prácticas de laboratorio de microbiología general. Departamento de Biotecnología.

Universidad Autónoma Metropolitana. Unidad Iztapalapa. 2004

Microbiología General. Primera Edición. Miryam Escobar de Rico.2003

Dpto. Inmunología, Microbiología y Parasitología

Universidad del País Vasco. Recursos de microbiología. http://www.testak.org/microbiologia/

Marienfeld. Laboratory Glassware. «Folleto explicativo de la técnica de recuento en cámara de

Neubauer»