3.2.

Stabilirea enzimei, alegerea si cultivarea tulpinii

În obţinerea unei enzime de uz industrial se ţine cont, în primul rând, de procesele de biotransformare în care
va fi utilizată enzima respectivă. Este absolut obligatorie determinarea principalelor caracteristici ale enzimei în
cauză, cele mai importante fiind următoarele:
– Specificitatea de acţiune. Din acest punct de vedere o problemă extrem de importantă o constituie activitatea
globală a preparatelor enzimatice comerciale dată fiind probabilitatea existenţei şi altor capacităţi catalitice pe
lângă cea principală, activităţi ce pot realiza transformări indezirabile. În cazul pectinazei de exemplu (enzimă
utilizată pe scară largă în industria de cofetărie), preparatele enzimatice pot conţine de fapt trei enzime cu activităţi
catalitice diferite. În funcţie de procesele ce urmează a se realiza, se aleg preparatele enzimatice convenabile a
căror specificitate de acţiune se manifestă faţă de substratele de care dispunem.
– pH-ul optim de acţiune. Acest factor poate manifesta o influenţă hotărîtoare asupra bunei desfăşurări a
proceselor biotehnologice realizate de enzime. În general, se aleg enzime ce îşi menţin activitatea catalitică într-
un interval cât mai larg posibil de pH.
– Temperatura optimă de acţiune. În general, în industrie sunt preferate enzimele a căror temperatură optimă
de acţiune este cât mai mare posibil deoarece la temperaturi relativ crescute este facilitată menţinerea sterilităţii
mediului.

3.2.1. Alegerea tulpinii microbiene

Microorganismele capabile să sintetizeze în cantităţi crescute anumite enzime se întîlnesc, în condiţii naturale,
în acele habitaturi care conţin substratele enzimelor respective, acesta fiind un factor extrem de important de care
se ţine cont în alegerea tulpinii producătoare. De exemplu, dacă se intenţionează să se obţină enzime
celulozolitice, tulpinile microbiene producătoare se vor izola din medii naturale bogate în celuloză. Iniţial cele
mai multe microorganisme se izolau din sol. Actualmente însă aria cercetărilor a fost mult extinsă, fiind studiată
posibilitatea izolării producătorilor industriali de enzime şi din alte surse: ape reziduale, reziduuri din industria
celulozei, a pielăriei, cea alimentară etc., reziduuri din zootehnie şi altele.
Pentru izolarea tulpinilor microbiene producătoare de enzime se folosesc metodele clasice, cea mai
importantă fiind metoda cultivării pe medii îmbogăţite urmată de realizarea de subculturi pe medii selective. Într-
un mediu selectiv ideal, substratul enzimei în cauză reprezintă unica sursă a unuia din elementele vitale (de
exemplu unica sursă de carbon). Astfel, pentru obţinerea de amilaze, mediul selectiv trebuie să conţină amidonul
ca unică sursă de carbon şi energie.
Pentru obţinerea de enzime la scară industrială, tulpinile microbiene producătoare trebuie să îndeplinească o
serie de condiţii:
– să se dezvolte pe medii cât mai simple cu putinţă şi ieftine;
– să producă cât mai puţini metaboliţi secundari;
– enzima ce urmează a fi obţinută să fie exportată în mediul de incubare în aşa fel încât să fie uşor de izolat
şi purificat;
– să nu fie poluante;
– să nu fie patogene şi să nu producă metaboliţi toxici.
 Dacă enzimele în cauză urmează să fie utilizate în industria alimentară, tulpinile microbiene producătoare
trebuie să îndeplinească toate condiţiile G.R.A.S. (Generaly Recognized As Safe) adică toate condiţiile impuse
produselor alimentare. De aceea, orice nouă tulpină studiată, înainte de a fi utilizată în producerea de enzime, este
supusă unui minuţios examen toxicologic, ceea ce necesită mult timp. Acesta este motivul datorită căruia
majoritatea cercetătorilor preferă tulpinile microbiene deja incluse în cataloagele GRAS.
După alegerea tulpinii producătoare se pot face numeroase studii de optimizare a proceselor fermentative, iar
ingineria genetică oferă posibilităţi teoretic infinite de ameliorare. Se apelează foarte des la realizarea de mutante
în vederea obţinerii unor tulpini producătoare de enzime cu randamente superioare. În acelaşi timp, prin mutaţii
pot fi suprimate acele caractere ale tulpinii sălbatice care influenţează negativ producţia industrială a enzimelor,
dat fiind faptul că, deseori, tulpinile sălbatice produc unii metaboliţi secundari, alte enzime decât cea care ne
interesează, antibiotice etc., compuşi ce se elimină relativ greu. De exemplu, în cazul obţinerii glucoamilazei,
preparatele rezultate conţin de multe ori cantităţi relativ mari de transglucozidază, iar proteaza produsă de Bacillus
licheniformis este impurificată cu bacitracină. Cea mai eficientă metodă constă în obţinerea unor mutante care să
nu producă metaboliţii secundari respectivi.
În ultimul timp, ingineria genetică oferă noi posibilităţi de obţinere a enzimelor de interes industrial. Cel mai
adesea se recurge la clonarea genei responsabile de biosinteza unei enzime dintr-un microorganism incompatibil
cu industria alimentară într-un al microorganism agreat de G.R.A.S.

3.2.2. Cultivarea tulpinii producătoare

Iniţial, enzimele de origine microbiană se obţineau prin realizarea culturilor de suprafaţă pe medii solide sau
semisolide. Această metodă se mai utilizează încă la obţinerea unor enzime de origine fungică cum ar fi amilazele
(Aspergillus), proteazele (Aspergillus şi Mucor), pectinazele (Penicillium) şi altele. Actualmente sunt însă
preferate culturile submerse deoarece în cazul culturilor pe mediu solid apar dificultăţi în ceea ce priveşte
controlul temperaturii, umidităţii şi aerării. Culturile în mediu lichid reduc riscul contaminării şi permit controlul
periodic al parametrilor biochimici şi microbiologici.