PRACTICA N°_____

CINETICA DE CRECIMIENTO

OBJETIVO

Determinar el crecimiento microbiano mediante conteo de células y/o

turbidimetría para obtener la curva de crecimiento.

INTRODUCCIÓN

Los métodos directos de cuantificación de microorganismos permiten

establecer la población total de microorganismos existentes, tienen la ventaja de ser
rápidos aunque no es posible diferenciar a las células vivas de las muertas. Entre
estos métodos tenemos la turbidimetría y el conteo de células.

Turbidimetría

En una suspensión microbiana, la cantidad de microorganismos está directamente

relacionada con la turbiedad o densidad óptica. La metodología es útil con
suspensiones de densidad microbiana baja y con cultivos en donde los
microorganismos son unicelulares y con un tamaño de unos cuantos micrómetros,
características que les permiten mantenerse suspendidos y homogéneamente
distribuidos; en tanto que con microorganismos de mayor tamaño y con aquellos
productores de polisacáridos esta metodología no es adecuada.

Recuento microscópico

Un volumen conocido de muestra es depositado en un portaobjetos especial para

cuenta (hemacitómetros, cámaras de Petroff-Hauser, Neubauer o de Helber; estas
consisten de portaobjetos excavados y cuadriculados que facilitan el recuento por
unidad de superficie y de volumen.

Con la cuantificación de microorganismos a través del tiempo es posible el representar

gráficamente el crecimiento microbiano. La curva presenta distintas fases:

Fase de latencia ó lag: período de adaptación de un microorganismo a un

nuevo medio de cultivo.
Fase exponencial o logarítmica: aumento regular de la población que se
duplica a intervalos regulares de tiempo (td).
Fase estacionaria: cese del crecimiento por agotamiento de nutrientes, por
acumulación de productos tóxicos, etc.
Fase de declinación o muerte: el número de células que mueren es
mayor que el número de células que se dividen.
 MATERIAL Y/O REACTIVOS

Por equipo:
Sesión extraclase :Caldo nutritivo, 15 Tubos de rosca agua, 1 Gradilla, 5
Pipetas de 1 ml, 5 Pipetas de 10 ml, 1Cilindro para esterilizar pipetas, 1 Parrilla,
Agitadores magnéticos, 1 probeta de 100 ml, 1 Vaso de precipitados 1000 ml, 1
Matraz erlenmeyer de 125 ml, 1 probeta de 100 ml, Balanza analítica, Gasa,
Algodón, Papel de estraza.

Sesión práctica: Celdas para espectrofotómetro, Espectrofotómetro,

Microscopio óptico, Portaobjetos, Cámara de Neubauer, Cubreobjetos, 2
Mecheros Fisher y 1 tubo “t” de vidrio.

Reactivos: Caldo nutritivo y agua destilada.

PROCEDIMIENTO
1.- Se preparará 250 ml de caldo nutritivo por equipo, se disolverá por
calentamiento y se distribuirá de la siguiente manera:

10 ml de medio en tubo con tapón de rosca (15 tubos por equipo)

50 ml en un matraz erlenmeyer de 125 ml con tapón de algodón

2.- Esterilizar las pipetas en un cilindro, los tubos y el matraz erlenmeyer con medio
de cultivo en el autoclave a 15 lb/plg2, durante 15 minutos.

3.- Inocular con Escherichia coli el matraz erlenmeyer el día anterior a la sesión práctica
e incubar a 37ºC (tabla 1).

4.-Al día siguiente medir densidad óptica del cultivo del matraz erlenmeyer
utilizando como blanco medio estéril para calibrar el espectrofotómetro.

5.- Inocular con el cultivo del matraz 4 tubos con caldo nutritivo (serie 1) e incubar
a 37ºC tres horas antes de que de inicio la sesión práctica.

6.- Inocular con el cultivo del matraz 8 tubos con caldo nutritivo (serie 2) e incubar a
37ºC

7.- Realizar el muestreo de acuerdo a la tabla 1, determinando la densidad óptica de

acuerdo al paso 4 y contando células siguiendo el procedimiento que se explica a
continuación.
 Tabla 1. Horario de inoculación de E. coli a tubos con medio de cultivo y muestreo
para cuantificar microorganismos.

Hora Serie 1 Serie 2

16 a 18 horas antes del día de la
sesión de práctica Inocular medio de cultivo en matraz
Día de sesión práctica
12:30 0
15:30 0
16:30 210 30
17:00 240 60
17:30 90
18:00 300 120
18:30 150

Conteo de células

1. Hacer frotis y tinción de Gram a la muestra a cultivar.

2. Bajo condiciones de asepsia colocar en el área hundida de la cámara de Neubauer

una gota de los cultivos (muestras series 1 y 2) y extenderla rápidamente. Evitar
escurrimientos.

3. Colocar el cubreobjetos y observar con los objetivos de 40X y 100X

4. Contar las células en cuadros individuales. Para evitar el conteo de las mismas
células dos veces, omitir aquellas ubicados en las líneas de la parte superior e izquierda
de cada cuadro. Los microorganismos omitidos son considerados en los cuadros
superior y derecho adyacentes: ejemplo:

5. Contar cuando menos 10 campos

6. Aplicar la siguiente fórmula y calcular

el número de microorganismos por
mililitro o gramo de la muestra original:
RESULTADOS

Graficar la curva de crecimiento (número de células y densidad óptica)

Determinar la tasa específica de crecimiento (μ) en la gráfica y con la ecuación de la

curva de crecimiento

Determinar el tiempo de duplicación.

CUESTIONARIO

1. Explica en qué consisten los métodos directos e indirectos de cuantificación de

microorganismos

2. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de los métodos de cuantificación de

microorganismos empleados en la práctica?

3. Explica en qué consiste la curva de crecimiento y que pasa en cada etapa

Practica N° ____
"ELABORACION DEL VINO" (FERMENTACION ALCOHOLICA)

OBJETIVO.
Efectuar el desarrollo del proceso de vinificación a partir de las uvas, utilizando
saccharomyces, cerecisiae o saccharomyces elliosoudeus.

INTRODUCCIÓN.
El vino es el zumo fermentado de los jugos de la uva (vitis-vinefira). El cual se compone
de agua y de un gran número de sustancias en solución entre la que se encuentra el
etanol (6-12% en peso), glicerina, ácido acético, ácido tartárico y anhídrido carbónico,
diversas materias colorantes y otros numerosos productos que son los que proporcionan
el aroma particular.

La habilidad de producir agradables y paladeables bebidas efervescentes por la

fermentación de jugos de frutas naturales es una demostración de la ingeniosidad
inherente del hombre.

Las uvas son el producto de una fermentación alcohólica natural de uvas frescas y
maduras con la participación activa de microorganismos.

El proceso parte del jugo de uva comprimido, llamado mosto, que se compone de agua,
azúcar de uva (glucosa), creportartaro y diversas materias colorantes entre las que se
halla la hemocianina de color azul. En donde a los pocos días fermenta espontáneamente
el CO2 debido a la actividad de los fermentos de S. cerevisiae y s. ellipsoideus las cuales
se hallan en las uvas.

Durante la fermentación gran parte del tártaro disuelto precipita a causa de la insolubilidad
en el alcohol y al depositarse en el fondo del fermentador las cuales constituyen las heces
del vino.

MATERIAL. REACTIVOS
1 fermentador (recipiente de vidrio) 3 kg de uva morada
2 envases de vidrio color ambar 250 g de azúcar
1 termometro de -10 a 110°C 2 litros de agua de botellón
1 equipo de calentamiento
3 franelas

PROCEDIMIENTO.
1. Efectuar la selección de las uvas, las cuales deben de estar maduras y lo mas
homogéneamente posible.
2. Estrujar las uvas de manera manual, sin romper las semillitas, de esta manera se
obtiene el jugo de uva que posteriormente se convierte en el mosto.
3. Una vez obtenido el jugo de uva se le adiciona azúcar y el agua.
4. Se cierra hemerticamente el fermentador, aunque antes se puede aplicar un
tratamiento de sulfitado el cual consiste en adicionar SO2.
5. Se deja fermentar por espacio de 7 dias, a la temperatura de 20- 23 °C en
condiciones anaerobias.
6. Transcurrido este tiempo filtrar para la separación del orujo (cascaras de las uvas),
quedando solo el mosto.
7. Dejar completar la fermentación del mosto por un tiempo de 7 días más.
8. Tener preparado los envases esterilizados y verter aquí el producto.
9. Pasteurizar el producto envasado a la temperatura de 63°C por un tiempo de 30
minutos a baño maría.
10. Se guarda el producto en un tiempo promedio de un año.
11. Tomar una alícuota de fermentado y destilar el Bioetanol producido

RESULTADOS.
Medir el rendimiento obtenido.

CUESTIONARIO
 Práctica N° ____
FERMENTACION ALCOHOLICA (VARIABLE DE CONCENTRACION DE SUSTRATO)

OBJETIVO.
Evaluar el proceso fermentativo en función a la concentración del sustrato.

INTRODUCCIÓN.

MATERIAL:
3 frascos (boca angosta) de aproximadamente 300 ml.
3 globos medianos que se ajusten a la boca del frasco.
3 etiquetas de maskin-tape.
600 ml. de jugo de uva o piña.
Solución de levadura al 10%.
50 grs. de azúcar.
1 probeta de 10 ml.
1 pipeta de 10 ml.
1 vaso de precipitados con 100 ml de agua destilada.
1 balanza granataria.
1 hoja de papel milimétrico.

PROCEDIMIENTO
1. Lavar los frascos, etiquetarlos, numerarlos del 1 al 3 y anotar datos.
2. Al frasco 1 agregar 80 ml de jugo, (sustrato al 100%). Grupo control o testigo.
3. Al frasco 2 agregar 100 ml de jugo, más 3 gramos de azúcar (sustrato al 120%). Grupo
experimental 1.
4. Al frasco 3, agregar 80 ml de jugo y 20 ml del agua destilada (sustrato al 80%). Grupo
experimental 2.
5. Agregar a cada frasco 10 ml de solución de levadura.
6. Colocar en la boca de cada frasco un globo.
7. En la siguiente clase obtener los resultados de la siguiente manera:
8. El globo que está más inflado se considerará como 100% de fermentación (por el CO2
producido durante el proceso) y de acuerdo a esto se le asignará un porcentaje
aproximado a los otros frascos.

RESULTADOS
Tabular y graficar (histograma) resultados.

CUESTIONARIO:
1. Escribe la ecuación general de la fermentación alcohólica:
2. ¿Qué relación existe entre glucólisis y fermentación?
3. ¿Por qué en la respiración anaerobia o fermentación se produce menor cantidad de
energía (2ATP), que en la respiración aerobia (38 ATP)?
4. ¿Cuál es la importancia de la fermentación en los microorganismos que la realizan?
5. ¿En tu actividad de laboratorio, que microorganismo realizó la fermentación? ¿Cuál es el
nombre científico?
6. ¿Qué aplicación tiene la fermentación alcohólica en la industria?
7. ¿En este experimento, en dónde se encontraban las enzimas y cuál fue el sustrato?
8. ¿Cuál fue la variable que se alteró o modificó?
9. ¿Qué variable permanecieron constantes?
10. ¿Por qué en un experimento se deben controlar variables?.
Práctica N° ____
"ELABORACION DE UN YOGURTH" (FERMENTACION LACTICA)

OBJETIVO.
Efectuar la obtención de un producto fermentado, a partir de la leche de vaca.

INTRODUCCIÓN.
El yogurth se puede definir como la leche fermentada o agria por excelencia. Esre
producto es originado de los países volcánicos y de la región caucásica, en las cuales se
prepara principalmente de la leche de oveja, aunque también se puede utilizar la leche de
cabra, vaca y bufala.

Para la producción del yogurth se pueden utilizar los microorganismos de Lacrtobacillus

bulgaricus, la cual es una termobacteria, la cual puede tener unión con varios
Estreptococcus tales como son el S. lactis, S. cremoris y S. termófilos.

MATERIAL REACTIVOS
1 recipiente metálico limpio Solución de NaOH 0.1N
1 equipo de calentamiento Solución de fenoftaleína
1 baño maría 1lt de leche pasteurizada
1 termómetro de -10°C - 100°C Leche en polvo 2.5 – 3%
Papel aluminio Yogurth natural 2.5 – 3%
1 probeta 100 ml
1 soporte universal
3 matraz Erlenmeyer 250 ml
1 bureta
1 pinzas para bureta

PROCEDIMIENTO.
1. Vierta la leche pasteurizada en un recipiente limpio y agregue 2.5 – 3% de leche en
polvo hasta disolver completamente y mezclar.
2. Calentar la leche a una temperatura de 85°C y mantenerla así por un tiempo de 30
minutos bajo condiciones de baño maría
3. Enfríe rápidamente hasta una temperatura de 43°C e inocule con proporción de 2.5 –
3% de iniciador (yogurth natural).
4. Incube a 45°C por un tiempo de hasta más de 3 horas, hasta que obtenga un coagulo
firme y que el producto fermentado contenga de 0.65 a 0.70% de acidez expresada
como ácido láctico.
5. Una vez iniciada la incubación, tome muestras cada hora y determine la acidez.
6. Una vez alcanzada la acidez final, refrigere el producto.
El procedimiento para determinar el porcentaje de ácido láctico: Colocar en un matraz
Erlenmeyer de 250 ml, 10 ml de leche fermentada, y agregar 5 gotas de fenoftaleína y
titular con solución de NaOH al 0.1N.
Práctica N° ____
PRODUCCIÓN DE BIOGAS A PARTIR DE CÁSCARAS DE FRUTAS

OBJETIVO.

INTRODUCCIÓN.

PROCEDIMIENTO.

Determinación del porcentaje de cáscara en el girasol, banana y naranja.

Procedimiento A:
1. Pesar las semillas de girasol
2. Pelar las semillas de girasol
3. Pesar las cáscaras y las pepas
4. Calcular el porcentaje
En el caso de las naranjas y bananas, el procedimiento es diferente porque deben
deshidratarse. Para la obtención de energía a partir de biomasa las cáscaras deben
quemarse en estado deshidratado.

Procedimiento B:
1. Pesar las bananas y naranjas
2. Pelar las bananas o naranjas
3. Dejar las cáscaras al sol por 1 semana en un lugar seco
4. Pesar las cáscaras deshidratadas
5. Calcular los porcentajes (las cáscaras deshidratadas es el material útil para
biomasa)

Determinación de la energía liberada por combustión por gramo de cáscara de

girasol, banana y naranja
La hipótesis de trabajo se basó en la siguiente ecuación:
Q = m x c x ∆t
Q = energía en forma de calor. m
= masa del agua.
c = capacidad calórica específica del agua
∆t = cambio en la temperatura del agua.

Esta fórmula determinará la cantidad de calor absorbida por el agua al calentarla

quemando las cáscaras.
Q absorbido por el agua = Q liberado por combustión de la masa de cáscara
quemada

Para que sea posible y más fácil prender las cáscaras, se utilizarán tres gotas de etanol
en cada porción de cáscara que se use. Luego se calculará el valor de “Q” para
estas tres gotitas de etanol y se le restará a los resultados.

Material.
• Tubos de ensayo, cuchara de postre de metal, pinza de metal, pipetas,
fósforos, probetas, agarraderas y pie
• Termómetro, balanza
• Cáscaras de girasol, banana y naranja deshidratadas, alcohol

Procedimiento.
1. Pesar aproximadamente 0,20 g de cáscaras
2. Colocar la cáscara pesada en una cuchara para quemar y agregar 0,2 cm3 de
etanol para comenzar la combustión.
3. Medir15 cm3 de agua destilada dentro del tubo de ensayo. Medir la
temperatura inicial
4. Armar el dispositivo de la Figura 2.
5. Encender las cáscaras + el alcohol con un fósforo
6. Medir la temperatura final cuando las cáscaras se hayan quemado
completamente.
7. Calcular el calor liberado en la combustión de las cáscaras (Qcáscara+etanol)
8. Repetir el procedimiento para etanol sólo y calcular el calor liberado en la
combustión del mismo (Qetanol)
9. Restar Qcáscara+etanol - Qetanol

Figura 1- Aparato utilizado en la combustión de las muestras

 Figura 2: Calorímetro escolar

Construcción de un biodigestor y determinación de biogas producido por

cáscaras de banana y naranja
El biogás se obtiene a partir de la fermentación bacteriológica de las cáscaras frescas
de banana y de naranja. En la producción de biogás las cáscaras de banana y naranja
brindan la fuente de carbono. Como fuente de urea se usó orina humana. Las bacterias
existentes en las cáscaras se multiplican y fermentan generando gas metano. Un primer
grupo de microorganismos hidroliza los biopolímeros y los lípidos en unidades
estructurales como ácidos grasos, monosacáridos, aminoácidos y compuestos
relacionados.

Un segundo grupo de bacterias anaerobias, acidógenas, fermenta los productos

descomponibles del primer grupo en ácidos orgánicos simples, como el ácido
acético. Un tercer grupo de microorganismos, metanogénicos, convierte el
hidrógeno y el ácido acético en gas metano y dióxido de carbono. El biogás que
sirve como biocombustible es el metano.

Procedimiento:
1. Obtener 240 gramos de cáscara de banana.
2. Cortar y picar 240 gramos de cáscara de banana e introducir los trocitos de
cáscara en un contenedor de capacidad de 5.0 dm3.
3. Obtener una muestra de orina de 100 cm3 (la orina humana contiene unos 20 g
de urea por litro) e introducir la orina en el contenedor.
4. Agregar agua destilada suficiente para completar 3.0 dm3.
5. Tapar la entrada de aire al contenedor, poniendo el corcho con el tubo en “S”
que desemboca en la probeta invertida, llena de agua, encima del contenedor
con agua, como se muestra en la Fotografía Nº 1.
6. Registrar el volumen de agua desplazada por el gas producido cada 24 horas
aproximadamente.
7. Repetir este procedimiento con cáscara de naranja.

Fotografía Nº 1: Biodigestor de cáscara de banana y naranja

PRACTICA N°______
OBTENCIÓN DE BIOGAS

OBJETIVO.

INTRODUCCIÓN.

MATERIAL.

• botella plástica de dos litros de capacidad, con tapa

• manguera de goma
• pinza o llave para cerrar la manguera
• tapón agujereado por donde atravesar la manguera de goma o un tubo de vidrio al
que se unirá la manguera de goma
• mechero
• caja de cartón, de madera
• lámpara de 60-75 watt que proveerá de calor al sistema
• estiércol de caballo, de vaca o de aves y restos vegetales
• agua hervida (sin cloro)
• agua de cal (se utiliza para comprobar la presencia de dióxido de carbono).

PROCEDIMIENTO
Armado del digestor

• Colocar los restos orgánicos dentro de la botella hasta la mitad de su capacidad;

• Llenar la botella con agua hasta cubrir la materia orgánica (y un poco más);
• Cerrar la botella con el tapón que ya tiene atravesada la manguera o el tubo de vidrio;
• Además de poner el tapón se puede sellar la botella con una resina o con la misma
tapa a rosca de la botella (que debe estar perforada para que entre el tapón) para
evitar la fuga de gas o que el tapón se libere (ya que puede ser despedido por la
presión que ejerce el gas que se acumula en la botella);
• Unir la manguera al mechero y cerrarla con la pinza;
• Colocar la botella dentro de la caja junto con la lámpara que debe permanecer
encendida todo el tiempo para mantener la temperatura a 40oC aproximadamente.
 Desarrollo

• Al cabo de 7 - 10 días, aproximadamente, el líquido de la botella tendrá burbujas. al

tocar la manguera que la cierra, es posible comprobar que la presión es diferente a
ambos lados de la llave.
• Colocar el extremo de la manguera dentro de un recipiente con agua de cal. Abrir la
manguera para dejar salir el gas acumulado en la botella. Si el agua se pone turbia
indica que la manguera despidió dióxido de carbono que se produjo en la botella.
“Estrangular” la botella para sacar la mayor cantidad posible de dióxido de carbono.
• Volver a cerrar la llave de la manguera.
• A partir de este momento, habiendo poco oxígeno en la botella (consumido en una
primera etapa por la respiración de algunos microbios) se intensifica la producción de
gas metano por otro tipo de bacterias que no necesitan oxígeno. La producción de
biogás (metano) lleva varios días y, a medida que se produce, la botella “estrangulada”
se hincha.
• Para comprobar la producción de biogás abrir la llave de la manguera y prender el
mechero.

CUESTIONARIO
a) ¿Cuál es el significado del término “bioenergía”?
b) ¿Cómo se denomina al tipo de bacteria responsable de la producción de metano?
c) ¿Por qué será necesaria una temperatura de 40oC para lograr la producción de
biogás?
d) ¿Se obtendrían los mismos resultados si se realizara esta experiencia a 0ºC o a
100ºC? ¿Por qué?
e) ¿A qué se debe la aparición de burbujas en el líquido y la presión que se siente en la
manguera a los 7-10 días de la experiencia?
f) ¿Por qué se debe eliminar del digestor el dióxido de carbono que se genera en la
primera etapa?
g) ¿Cuál es la ventaja de la utilización del biogás como fuente de energía?