METODE VALIDASI LABORATORIUM

Definisi Validasi

Validasi adalah metoda analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter
tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut
memenuhi persyaratan untuk penggunaannya.

parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode analisis

diuraikan dan didefinisikan sebagaimana cara penentuannya.

1. Kecermatan (accuracy)

Definisi:

Kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan
kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan dinyatakan sebagai persen perolehan kembali
(recovery) analit yang ditambahkan. Kecermatan hasil analis sangat tergantung kepada
sebaran galat sistematik di dalam keseluruhan tahapan analisis. Oleh karena itu untuk
mencapai kecermatan yang tinggi hanya dapat dilakukan dengan cara mengurangi galat
sistematik tersebut seperti
menggunakan peralatan yang telah dikalibrasi, menggunakan pereaksi dan pelarut yang baik,
pengontrolan suhu, dan pelaksanaannya yang cermat, taat asas sesuai prosedur.

2. Spesifitas/Selektifitas

 Merupakan kemampuan suatu metode analisa untuk membedakan senyawa yang diuji
dengan derivat/metabolitnya.
 Adanya perbedaan nyata antara resolusi antara dua puncak yang berdampingan dan
kemurnian tiap puncak dalam kromatogram.
 Untuk HPLC, Rs : 1,2 – 1,5.
 Untuk Spektrofotometer UV/Vis: jarak dua puncak berdampingan: resolution factor
(Rf) > 2,5.
  Lakukan scanning (pemindaian) sampel yang diuji lihat kromatogram dari dua puncak
yang berdekatan (Rs) harus tidak kurang dari 1,5 atau terlihat adanya puncak yang
terpisah dari scanning dengan spektrofotometer UV/Vis.
 Pemisahan dua puncak yang berdekatan dalam kromatogram, resolusi (R) ditentukan
dengan persamaan :

Di mana t2 dan t1 adalah waktu retensi dua komponen, W1 dan W2 adalah lebar puncak.
Komponen pertama dan komponen kedua yang diukur dengan jalan ekstrapolasi sisi puncak
yang relatif lurus sampai garis dasar (base line).

Resolusi harus lebih besar dari 1,5.

Hasil Kromatogram Uji Selektifitas/Spesifitas yang memenuhi persyaratan

Hasil Kromatogram uji selektifitas yang tidak memenuhi persyaratan

3. Linearitas

 Merupakan kemampuan suatu metode analisa untuk menunjukkan hubungan secara

langsung atau proporsional antara respons detektor dengan perubahan konsentrasi
analit
 Diuji secara statistik, yaitu Linear Regression (y = a + bx); dimana b adalah
kemiringan slope garis regresi dan a adalah perpotongan dengan sumbu y.

∑ (x – Xbar)(y- Ybar)

Koefisien korelasi (r) = ——————————–

√[ ∑ (x –Xbar)∑ (y- Ybar)]

x adalah pengukuran individual dalm N pengukuran x (bar) adalah nilai rata-rata pengukuran;
y adalah nilai individual sebenarnya dalam N nilai sebenarnya dan y (bar) adalah nilai rata-
rata sebenarnya.
  Pengujian dilakukan paling tidak dengan menggunakan 5 kadar yang berbeda,
kemudian dilihat apakah memberikan respons yang linear apa tidak, yang ditunjukkan
dengan nilai r ≥ 0,98.

Pegujian Linearitas

4. Akurasi (ketepatan)

 Merupakan kemampuan suatu metode analisa untuk memperoleh nilai yang

sebenarnya (ketepatan pengukuran).
 Terdapat 5 metode penentuan akurasi untuk penetapan kadar bahan aktif obat dalam
bahan baku dan produk obat, yaitu :
1. Menggunakan metode analisis untuk menetapkan kadar analit dalam bahan baku
berkhasiat yang diketahui kemurniannya (misalnya bahan baku pembanding
sekunder).
2. Bahan baku berkhasiat atau cemaran dalam jumlah yang diketahui ditambahkan
kedalam plasebo. Metode analisis ini akan digunakan untuk penetapan kadar bahan
baku berkhasiat/cemaran dalam produk obat.
 3. Bila plasebo tidak bisa diperoleh, verifikasi akurasi metode dapat dilakukan dengan
teknik standar adisi, yaitu dengan menambahkan sejumlah tertentu analit kedalam
produk obat yang telah diketahui kadarnya. Metode analisis ini digunakan untuk
penetapan kadar bahan baku berkhasiat/cemaran dalam produk obat
4. Menambahkan cemaran dalam jumlah tertentu ke dalam bahan baku
berkhasiat/produk obat. Metode analisis ini digunakan untuk penetapan kadar
cemaran dalam bahan baku berkhasiat dan produk obat
5. Membandingkan dua metode analisis untuk mengetahui ekivalensinya, yaitu
membandingkan hasil yang diperoleh dari metode analisis yang divalidasi terhadap
hasil yang diperoleh dari metode analisis yang valid (akurasi metode analisis yang
valid ini telah diketahui). Metode analisis ini digunakan untuk penetapan kadar bahan
baku berkhasiat dalam bahan baku berkhasiat, produk obat dan penetapan kadar
cemaran.

 Akurasi dinyatakan sebagai prosentase (%) perolehan kembali (recovery).

 Akurasi dinilai dengan menggunakan sedikitnya 9 penentuan dengan sedikitnya 3
tingkat konsentrasi dalam rentang pengujian metode analisis tersebut (misalnya 3
konsentrasi/3 replikasi untuk tiap prosedur analisis lengkap).
 Ketepatan metode analisa dihitung dari besarnya rata-rata (mean, x) kadar yang
diperoleh dari serangkaian pengukuran dibandingkan dengan kadar sebenarnya.

Hasil analisis

Recovery = —————– x 100%

Nilai sebenarnya

Syarat recovery : 98 – 102 %

5. Presisi (Ketelitian)
  Merupakan kemampuan suatu metode analisis untuk menunjukkan kedekatan dari
suatu seri pengukuran yang diperoleh dari sampel yang homogen.

 Terdapat 3 kategori pengujian presisi, yaitu :

1. Keterulangan (repeatability), dinilai dengan menggunakan minimum 9 penentuan
dalam rentang penggunaan metode analisis tersebut (misalnya 3 konsentrasi/3
replikasi).
2. Presisi Antara, yaitu perbedaan antar operator/analis dengan sumber reagensia dan
hari yang berbeda.
3. Reprodusibilitas, dengan menggunakan beberapa laboratorium untuk validasi metode
analisis, agar diketahui pengaruh lingkungan yang berbeda terhadap kinerja metode
analisis.

Macam-macam Presisi

 Presisi dinyatakan dalam bentuk RSD (relative standart deviation) atau SRB (sebaran
baku relatif) .
 Persyaratan RSD sebagai berikut :
6. Batas Deteksi (Limit of Detection/LOD)

 Merupakan jumlah analit terkecil yang masih bisa dideteksi namun tidak perlu dapat
terukur.
 Beberapa pendekatan yang dapat digunakan untuk menentukan batas deteksi
tergantung pada jenis metode analisis apakah metode analisis instrumental atau
noninstrumental.
1. Berdasarkan evaluasi visual
Evaluasi visual dapat digunakan untuk metode analisis noninstrumental, tapi dapat
juga digunakan untuk metode analisis instrumental. Batas deteksi ditentukan dengan
melakukan analisis terhadap sampel yang diketahui konsentrasinya dan menetapkan
kadar terendah yang dapat dideteksi dengan baik.
2. Berdasarkan rasio signal terhadap noise
Pendekatan ini hanya dapat diterapkan pada metode analisis yang memberikan
baseline noise. Penentuan signal to noise dilakukan dengan membandingkan
pengukuran signal sampel yang diketahui mengandung analit dalam konsentrasi
rendah dan blanko, kemudian dapat ditetapkan konsentrasi minimum analit yang
dapat dideteksi dengan baik. Rasio signal to noise sama dengan 3 atau 2 : 1 umumnya
dianggap dapat diterima untuk memperkirakan batas deteksi.

 Simpangan respon dan kemiringan (“slope”) kurva kalibrasi :

Batas deteksi dapat dinyatakan sebagai :
 LOD

7. Batas Kuantitasi (Limit of Quantitation/LOQ)

 Merupakan jumlah analit terkecil yang yang masih bisa diukur dengan akurat (tepat)
dan presisi (teliti)/reprodusible.
 Beberapa pendekatan yang dapat digunakan untuk penentuan batas kuantitasi
tergantung pada jenis metode analisis instrumental atau noninstrumental.
1. Berdasarkan evaluasi visual
Evaluasi visual dapat digunakan untuk metode analisis noninstrumental, tapi dapat
juga digunakan untuk metode analisis instrumental. Batas kuantitasi ditentukan
dengan melakukan analisis terhadap sampel yang diketahui konsentrasinya dan
menetapkan kadar terendah analit yang dapat ditentukan secara kuantitatif dengan
akurasi dan presisi yang dapat diterima
2. Berdasarkan rasio signal terhadap noise :
Pendekatan ini hanya dapat digunakan pada metode analisis yang memberikan
baseline noise. Penentuan rasio signal terhadap noise dilakukan dengan
membandingkan signal yang diukur dari sampel yang mempunyai konsentrasi analit
yang rendah dan blankonya, kemudian ditentukan konsentrasi terendah analit yang
dapat ditetapkan secara kuantitatif dengan baik, umumnya pada rasio signal terhadap
noise 10:1.
 3. Simpangan baku dari respon dan kemiringan (slope) kurva kalibrasi :
Batas kuantitasi dapat dinyatakan sebagai :

LOQ

8. Ketegaran (robustness)

 Merupakan kapasitas suatu metode analisis untuk TIDAK terpengaruh oleh variasi-
variasi kecil dalam parameter metode analisa.
 Contoh variasi kecil dalam metode analisa secara HPLC, antara lain: pH fase gerak,
suhu, tekanan, stabilitas, jumlah pelarut organik yang dimodifikasi, konsentrasi
buffer, konsentrasi additive, flow rate, suhu kolom, dan lain-lain.

Kriteria Penerimaan

Metode Analisa dinyatakan memenuhi syarat (valid), jika :

 Seluruh parameter uji (Spesifitas/selektifitas, Linearitas, Akurasi, Presisi, LOD, LOQ

dan Robustness) memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan.
 Tidak ada perbedaan bermakna antar analis atau antar dosis yang diuji atau antar lab.
(t uji < t tabel).
Validasi Ulang

Validasi ulang mungkin diperlukan pada kondisi sebagai berikut:

 perubahan sintesis bahan aktif obat;

 perubahan komposisi produk jadi; dan
 perubahan prosedur analisis.

Tingkat validasi ulang yang diperlukan tergantung pada sifat perubahan. Perubahan tertentu
lain mungkin juga memerlukan validasi ulang.