UNIVERSIDAD AUTONOMA DEL ESTADO DE MEXICO

FACULTAD DE QUIMICA

LABORATORIO DE GENETICA

PRÁCTICA No.4

DAÑO CROMOSÓMICO (ALTERACIONES INESTABLES)

Tiempo de duración:
Esta práctica está programada para dos sesiones.

Propósito de la práctica:

Evaluar el daño al material genético producido por agentes externos.

Conocer la técnica de cultivo de linfocitos para la obtención de cromosomas

a partir de sangre periférica, así como su aplicación en el laboratorio de genética.

Desarrollar en el laboratorio la técnica de inducción de alteraciones

cromosómicas inestables.

Introducción:

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 Se han implementado numerosos sistemas de prueba que permiten
identificar y evaluar el daño ocasionado al material genético por diversos
agentes ya sean físicos, químicos o biológicos. La detección de alteraciones
cromosómicas inestables es claramente una manifestación importante de daño al
ADN y pueden además indicar alteraciones en la homeostasis celular, importante
en la inestabilidad del genoma y es, por lo tanto, crítica para el entendimiento de la
mutagénesis y carcinogénesis.

Las alteraciones cromosómicas inestables pueden ser de varios tipos

dependiendo si afectan a una o a las dos cromátides, pudiendo ser: gaps
cromatídicos y cromosómicos; rupturas, deleciones, figuras radiales,
isocromosomas, cromosomas en anillo, cromosomas dicéntricos, entre otros.

Normalmente aparecen entre 5-8 aberraciones cromosómicas en un

individuo sano, pero este número se incrementa notablemente en las células de
pacientes con síndromes de inestabilidad cromosómica, o en aquellos que han sido
expuestos a un agente inductor, como la luz ultravioleta, rayos X.

Material y equipo de laboratorio:

- Heparina 5000 UI - KCl.

- Jeringa de 3 o 5 ml - Metanol.
- Jeringas de 1 ml - Etanol.
- Torundas con alcohol. 70% - Ácido acético glacial.
- Ligadura. - Portaobjetos.
- Medio de cultivo RPMI-1640 - Cubreobjetos 24X50mm
- Fitohemaglutinina. - Tubos para cultivo.
- Colcemid. - Pipetas Pasteur.

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 - Mitomicina C . - Microscopio
- KH2PO4 - Caja de petri
- Na2HPO4 7H2O - Vaso coplin de 50 ml
- Colorante de Wright. - Colorante de Giemsa

Procedimiento:

A.- CULTIVO DE LINFOCITOS

1.- Con jeringa heparinizada tomar una muestra de 3-5 ml de sangre periférica.

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2.- En un área estéril (de preferencia en gabinetes de seguridad) adicionar a dos

tubos de cultivo 5 ml de medio RPMI-1640 con una jeringa estéril (control y
problema).

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3.- Adicionar 0.1 ml de fitohemaglutinina con jeringa de insulina.

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4.- Adicionar 10 gotas de sangre.

5.- En uno de los tubos, adicionar 100 l de la solución de MMC.

(Cada equipo agregará una cantidad diferente de MMC comenzando con, 15.6,
31.25 , 62.5, 125, y 250ng/ml).

6.- Incubar a 37°C durante 72 horas.

B.- COSECHA.

7.- Adicionar 0.05 ml de colcemid a cada tubo de cultivo y dejar actuar por 30
minutos a 37°C.

8.- Centrifugar a 1500rpm durante 6 minutos.

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9.- Retirar el sobrenadante y adicionar 10 ml de la solución hipotónica de KCl que
ya debe estar a 37°C. Resuspender perfectamente, y dejar actuar por 25 minutos a
37°C.
10.- Adicionar 1 ml de fijador de Carnoy frío y recién preparado. Resuspender
perfectamente.

11.- Centrifugar a 1500rpm durante 10 minutos.

12.- Retirar el sobrenadante y adicionar 5 ml de fijador frío. Resuspender

perfectamente.

13.- Centrifugar a 1500rpm durante 6 minutos.

14.- Retirar el sobrenadante y adicionar 5ml de fijador frío. Continuar haciendo

lavados hasta la obtención de un sobrenadante transparente y un botón celular
claro.

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15.- Preparar laminillas y evaluar bajo contraste de fases.

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16.- Teñir con colorante de Wright y Giemsa 2 min en c/u (47ml buffer fosfatos + 3
ml de colorante)

17.- Revisar 50 metafases de cada cultivo y anotar el número y tipo de AC

observada.

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SOLUCIONES.

1.- Solución Hipotónica

KCl 0.075M a 37°C

5.579 g KCl/ 1000 ml agua destilada

2.- Fijador de Carnoy

3:1 Metanol/Äcido acético glacial

3.- Buffer de fosfatos para diluir colorantes

- KH2PO4 2.041 g /250 ml agua destilada

- Na2HPO4 .7H2O 2.14 g /250 ml agua destilada
Mezclar y ajustar a pH 6.8 con HCl 0.1N o NaOH 0.1N

Evaluación:

1.- ¿Qué es un agente clastogénico, y para qué se usa?

2.- Menciona ejemplos de agentes alquilantes y como causan el daño al ADN

3.- ¿Qué tipo de alteraciones cromosómicas se esperan encontrar?

4.- ¿Qué es una alteración inestable?

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5.- Dibuja lo que observaste

Conclusiones:

1.- ¿Por qué se emplearon diferentes concentraciones de Mitomicina C en los

cultivos?

2.- ¿Por qué los cultivos se incubaron por 72 horas?

3.- Las preparaciones únicamente se tiñeron con Wright y Giemsa por que:

Medidas de seguridad y salud ocupacional. Disposición de desechos

químicos, físicos y biológicos.
Trabajar con guantes y lentes de seguridad.
Los residuos serán desechados de la forma habitual.

Bibliografía:
- Verma R.S. y Babu A. 1995. Human chromosomes, principles and
thecniques. Mc. Graw Hill. USA, pp. 72-125.
- Salamanca F. 1990. Citogenética Humana. Fundamentos y Aplicaciones
Clínicas. Médica Panamericana, México, pp. 37-39, 43-48, 189-198.

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 - Galloway, S. Chromosome aberrations induced in vitro: Mechanisms,
delayed expression and intriguing questions. Enviromental and Molecular
Mutagenesis 23, supplement 24 (1994) 44-53
- Guizar J.J. 2001. Genética Clínica: Diagnóstico y manejo de las
enfermedades hereditarias. El Manual Moderno, México, pp. 22-24, 153-
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- Esmer MC, Carnevale A, Molina B, Cruz-Alcivar R, Sánchez S,Gómez L
y FRIAS S. Variabilidad clínica y citogenética en doce familias mexicanas
con anemia de Fanconi y su relación con el grupo decomplementación al
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