Facultad de Química UDELAR

Curso de Química Analítica III – 2015

PRÁCTICA H

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA PRESIÓN (HPLC II)

12/06/2015
 1. OBJETIVOS

Parte A

 Evaluar la influencia de la composición de la fase móvil sobre el cromatograma.

 Evaluar la pureza espectral de los picos obtenidos con distinta composición de la fase
móvil.

 Estudiar el uso de un gradiente de elución.

 Comparar los parámetros cromatográficos para las distintas composiciones de fase

móvil.

Parte B

 Realizar y comparar las curvas de calibración correspondientes a nuestros dos analitos

a las longitudes de onda seleccionadas.

 Determinar la longitud de onda de detección óptima para cada analito.

2. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL

2.1 Materiales y Equipos

Materiales

 5 matraces aforados de 5 mL

 2 pipetas graduadas de 1 mL

 2 jeringas de plástico

 Filtros de membrana de 0,45 µm de tamaño de poro

Equipos

 Cromatógrafo de líquidos de alta presión (HPLC), modular

Módulos

 Sistema de detección UV-Visible Agilent Modelo 1260 DAD VL

Características técnicas:

Sistema fotométrico: tipo doble haz

Fuente de lámpara: deuterio y tungsteno

Intervalo de longitudes de onda: 190-950 nm

Exactitud de la longitud de onda: ± 1 nm

Ancho de banda: 1, 2, 4, 8, 16 nm

Ruido (pico a pico): < ± 0,7x10-5 UA a 254 y 750 nm

Deriva: <0,9x10-3 UA/hora a 254 nm

 Bomba Agilent Modelo 1260 Quat Pump VL

Características técnicas:

Sistema de bombeo: Bomba cuaternaria reciprocante de doble pistón

en serie

Intervalo de caudal: 0,001-10 mL/min en incrementos de 0,001

mL/min

Presión máxima de funcionamiento: 400 Bar

Exactitud de caudal: ± 1%

Reactivos:

 Solución Stock Conjunta de cafeína (800 mg/L) y acetaminofeno (4000 mg/L),

preparada en metanol.
2.2 Procedimiento Experimental

Condiciones experimentales:

o Flujo: 1,5 mL/min

o Volumen de inyección: 10 µL

o Columna de 150 x 4,6 mm con fase estacionaria tipo C-18 (con octadecilsilano
químicamente unido a sílica gel), tamaño de partícula: 5 µm

o Parte A

Configuraciones de la parte móvil

Corrida %MeOH %H2O

1 28 72
2 36 64
3 20 80
4 t0: 20 t0: 80
(Gradiente) t3 min: 40 t3 min: 60
o Parte B

Configuraciones de la fase móvil:

Corrida %MeOH %H2O

1 28 72

Procedimiento

o Parte A

- Se preparó una dilución de proporciones 1:10 a partir de la solución Stock con

mezcla MeOH:H2O 28:72.

- Con ella se realizan las corridas siguiendo el cuadro de configuraciones de la fase

móvil, con el fin de evaluar la pureza de los picos obtenidos dependiendo de cada
 configuración.

o Parte B

- Se preparan los patrones de calibración a partir de la solución Stock con el mismo

disolvente de la parte A, en proporciones 1:50, 1:25, 2:25 y 1:10.

- Configurando el instrumento a las longitudes de onda de 205 nm , 245 nm, y 273

nm, realizar las inyecciones de los patrones y el blanco (la fase móvil), para
obtener las curvas de calibración correspondientes.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1 Resultados

PARTE A

Pureza Espectral Tiempo de Retención (min)

Corrida Acetaminofeno Cafeína Acetaminofeno Cafeína
1 97,0 99,9 1,710 3,127
2 99,5 99,9 1,366 1,978
3 98,9 99,9 2,442 6,397
4 98,5 99,9 2,335 3,762

Corrida Platos teóricos

(mg/L) 205 nm 245 nm 273 nm
Cafeína
1 6471 6478 6493
2 5068 5045 5059
3 8247 8198 8263
4 19639 20318 20403
Acetaminofeno
1 3358 4030 4283
2 2755 3205 3577
 3 4532 5232 5309
4 5802 7006 7348

PARTE B

Concentración Areas (mUA*s)

(mg/L) 205 nm 245 nm 273 nm
Cafeína
0 0 0 0
16 656,2948 59,91595 232,54492
32 1670,34448 158,2224 596,41498
64 3316,20483 322,93402 1219,30579
80 4229,28662 412,08105 1551,69421
Acetaminofeno
0 0 0 0
80 2442,58895 1739,56531 401,07697
160 6111,58529 4358,55811 1000,92773
320 11969,127 8692,03223 1996,34131
400 14861,727 11003 2532,43433
 Curva de Calibración - Cafeína, 245 nm
450.00

400.00

350.00

300.00
Área de pico (mUA*s)

250.00

200.00

150.00

100.00

50.00
y = 5.065899565x
R² = 0.995786282

0.00
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0
Concentración de Cafeína en Patrón (mg/L)
 Curva de Calibración - Cafeína, 205 nm
4,500.0

4,000.0

3,500.0

3,000.0
Área de pico (mUA*s)

2,500.0

2,000.0

1,500.0

1,000.0

500.0
y = 52.185103505x
R² = 0.997189513
0.0
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0
Concentración de Cafeína en Patrón (mg/L)
 Curva de Calibración - Cafeína, 273 nm
1,800.0

1,600.0

1,400.0

1,200.0
Área de Pico (mUA*s)

1,000.0

800.0

600.0

400.0

200.0
y = 19.104713438x
R² = 0.996422155

0.0
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0
Concentración de Cafeína en Patrón (mg/L)
 Curva de Calibración - Acetaminofeno, 205 nm
16000

14000

12000

10000
Área de Pico (mUA*s)

8000

6000

4000

2000
y = 37.187745228x
R² = 0.997997014

0
0.0 50.0 100.0 150.0 200.0 250.0 300.0 350.0 400.0 450.0
Concentración de Acetaminofeno en Patrón (mg/L)
 Curva de Calibración - Acetaminofeno, 245 nm
12000

10000

8000
Área de Pico (mUA*s)

6000

4000

2000

y = 27.239078927x
R² = 0.997600686

0
0.0 50.0 100.0 150.0 200.0 250.0 300.0 350.0 400.0 450.0
Concentración de Acetaminofeno en Patrón (mg/L)
 Curva de Calibración - Acetaminofeno, 273 nm
3000

2500

2000
Área de Pico (mUA*s)

1500

1000

500

y = 6.263714489x
R² = 0.997614791

0
0.0 50.0 100.0 150.0 200.0 250.0 300.0 350.0 400.0 450.0
Concentración de Acetaminofeno en Patrón (mg/L)
3.2 Discusión de los Resultados

Parte A

Al estar trabajando con una fase estacionaria apolar, tipo C-18, se observa que al
aumentar la proporción del componente más apolar (MeOH), sobre el polar (H20), los
tiempos de retención de nuestros analitos disminuyen, esto se debe a las interacciones
que se dan entre ellos.

Al ir variando estas proporciones a fases móviles de mayor polaridad se observa una

elución más lenta, con picos más espaciados.

Esta diferencia en separación entre picos se debe esencialmente a la afinidad entre los
analitos y las fases estacionaria y móvil. Si bien ambos analitos eluyen más rápido
cuando aumenta la proporción del componente más apolar de la fase móvil, para cada
uno se observan variaciones distintas en esa velocidad de elución. Para la cafeína, por
ser muy apolar, se ve que el tiempo de retención para la corrida 2 (fase móvil más
apolar), es tres veces menor que para la corrida 3 (fase móvil más polar). Sin embargo,
para el caso del acetaminofeno, la velocidad de elución en la corrida 2 es sólo dos
veces mayor que para la corrida 3.

Por otra parte, comparando la corrida 2 con la corrida 3, se observa que esta última
presenta una mayor eficiencia, pues tiene un mayor número de platos, de lo que se
deduce que la corrida con una fase más polar es más eficiente. A pesar de tener
buenas resolución y eficiencia, esta última corrida tiene la desventaja de presentar
tiempos de retención demasiado prolongados, lo que la tornaría poco práctica para
análisis de rutina.

Cuando se trabajó con un gradiente de concentración, se comenzó con una baja fuerza
eluotrópica (mayor polaridad de fase móvil), y se fue aumentando de forma lineal dicha
fuerza (se disminuyó la polaridad de fase móvil), se logró que los tiempos de retención
fueran más cortos y mejoró la separación entre los picos.

A su vez, con el uso del gradiente se logró obtener picos más finos, es decir, una más
alta eficiencia. Esto se puede apreciar en la cantidad de platos teóricos de las distintas
corridas, la cual es mucho mayor para la corrida en cuestión.

Al comparar la pureza espectral de las diferentes corridas, no encontramos una

relación entre la composición de las distintas fases móviles utilizadas y la pureza, pero
se considera buena en todos los casos ya que la cafeína mantiene en todas las
corridas una pureza del 99,9% y para el acetaminofeno su menor pureza espectral se
da en la corrida 1 con un 97%, la cual encontramos aceptable.
 Parte B

Se realizaron las curvas de calibración mediante el uso de planilla electrónica Excel

para cada analito a las tres longitudes de onda de trabajo. Escogimos el modelo lineal
sin ordenada en el origen por lo visto en la práctica anterior (Práctica G), lo que se
confirma con un valor del coeficiente de correlación cercano a uno para todas ellas.

A la hora de elegir la longitud de onda óptima de trabajo consideramos el rango de

longitudes de onda en las que trabaja el equipo que va desde 190nm a 900nm
encontrándose que el trabajar a 205nm nos sitúa muy cerca del extremo de dicho
rango por lo cual no es recomendable utilizarla, pues el equipo en esa situación tiene
un rendimiento inferior.

A 245nm se encuentra un mínimo de absorción de la cafeína y máximo del

acetaminofeno. A la hora de analizar una muestra que presente interferencias, estas
influirían de forma apreciable en el valor de la señal total, pues el correspondiente a
nuestro analito sería bajo. Por lo expuesto tampoco consideramos correcto el trabajo a
esta longitud de onda.

Al realizar el estudio del trabajo a 273nm encontramos un máximo de absorbancia para

la cafeína y no presenta los inconvenientes de las anteriores longitudes de onda.
También encontramos un buen ajuste en las curvas con un valor aceptable del
coeficiente de correlación, por lo que concluimos que lo mejor sería trabajar a dicha
longitud de onda.

4. CONCLUSIÓN

Evaluando la influencia de la composición de la fase móvil sobre el cromatograma,

podemos concluir que al aumentar la polaridad de la misma mejoramos los parámetros
cromatográficos, como por ejemplo el número de platos teóricos y la separación de los
picos pero tendríamos tiempos de retención bastante altos. Este problema lo podemos
solucionar con una elución por gradiente que disminuye considerablemente los tiempos
de retención y a su vez presenta buen número de platos teóricos.

En cuanto a la pureza espectral de picos no se encontró una relación entre ella y la

composición de la fase móvil, pero se observó que su variación no era muy significativa,
pudiéndose utilizar cualquiera de las mismas, si nos basamos en este criterio.

Además se realizaron las curvas de calibración para los dos analitos a las longitudes
de onda de trabajo presentando buenos ajustes. Por los motivos expuestos en la
discusión se determinó que la longitud de onda óptima para la detección de los mismos
es 273 nm.
 Para finalizar podemos decir que la HPLC es un método que nos permite trabajar
rápido, proporciona una gran cantidad de información, es muy versátil, reduce la
participación del operador. Además la presencia de los detectores de arreglo de diodos
y una interfaz virtual nos permite la visualización de una tercera dimensión de los datos
analíticos, lo que nos brinda valiosa información extra.

5. BIBLIOGRAFÍA

 Tema: GLP (Good Laboratory Practice) buenas prácticas de laboratorio, página 21.

 Tema: Pautas para la realización de los informes, página 19

 Skoog, D.A., Holler F.J. y Nieman T.A., “Análisis Instrumental”, 5ª Edición. McGraw-Hill,
1997. Capítulos 26 y 28

 Rubinson, K.A. y Rubinson J.F. “Análisis Instrumental”. Pearson Educación SA, Madrid.
2001. Capítulo 14: Tipos de cromatografía líquida.

 Huber, L. George, S. A. “Diode Array Detection in HPLC”. Marcel Dekker Inc., Nueva
York. 1993