U.A.G.R.M.

FACULTAD: CIENCIAS
FARMACEUTICAS Y
2012
BIOQUÍMICA

BIOTECNOLOGIA
 CULTIVOS CELULARES (ANIMALES). MEDIOS Y MÉTODOS DESELECCIÓN,
CRECIMIENTO Y MANTENIMIENTO

1. Introducción

La célula es la unidad más pequeña de vida, esencial para la formación de

unorganismo. La mayoría de tipos celulares tanto vegetales como animales,
sobreviven, se multiplican e incluso expresan propiedades diferenciales en
una placade cultivo en condiciones adecuadas. A pesar de que al microscopio puedeno
bservarse las estructuras de los orgánulos y de las macromoléculas de la célula,
ya pesar de que mediante procesos de tinción específica pueden localizarsemoléculas
determinadas, la comprensión molecular de la célula requiere un análisis bioquímico
detallado. Los procedimientos bioquímicos requieren una gran cantidad de células. Si
la muestra es un trozo de tejido, se mezclarán entre sí en el momento de su rotura
fragmentos de todas las células y si, como ocurre en la mayoría de los casos, el tejido
tenía células de tipos diferentes, se originará una gran confusión. Con el objeto de
preservar toda la información que sea posible sobre cada uno delos tipos celulares, se
han desarrollado técnicas de disociación de células a partir de tejidos y de separación
de los distintos tipos celulares. Como resultado de estas técnicas, pueden analizarse
poblaciones relativamente homogéneas de células dedos maneras distintas, ya sea
directamente o después de que su número se haya incrementado notablemente al
proliferar encultivo.El proceso de cultivo celular (crecimiento de células en condicione
s delaboratorio) ha abierto el camino a importantes avances en el campo de las
ciencias de la vida. Alguno de estos adelantos incluyen el estudio de procesos
celulares, biología molecular y la capacidad para manipular genéticamente células, y el
desarrollo de nuevas drogas. Uno de los más recientes avances en este campo
es eluso de las técnicas de ADN recombinante (por ejemplo, se emplea ADNrecombina
nte para el desarrollo de vehículos para introducir células en el
sistemacardiovascular mediante el uso de un injerto vascular con células endoteliales
genéticamente modificadas). La aplicación final del cultivo de células y tejidos es tener
la capacidad de reconstituir tejidos y órganos equivalentes en un cultivo a partir del
uso de células especializadas y sus moléculas matrices. Un ejemplo de
esto(probablemente la técnica más avanzada) es la regeneración de tejido epitelial in
vitro utilizando queratinocitos, el principal tipo celular de la epidermis que ha
abiertoun gran campo en biología y medicina como un tejido para reconstrucción,man
ipulación farmacológica y
transplantes.Algunos tejidos altamente especializados están enriquecidos en algúnco
mponente directamente relacionado con su función. Si se desea estudiar dicho
componente o dicha función es necesario utilizar dichos tejidos. Por ejemplo: el
músculo esquelético de los vertebrados es muy rico en actina y miosina, las células
secretoras del páncreas contienen altas concentraciones de retículo
endoplásmicorugoso, las células del esperma son ricas en ADN, el hígado contiene alta
concentración de muchas enzimas del anabolismo celular. Si el estudio de alguno de
estos compuestos se tuviese que realizar a partir de organismos completos con
tiempos de generación de meses o años, resultaría inviable. De ahí la necesidad de
obtener cultivos de estos tipos celulares que se puedan reproducir en tiempos cortos
de forma semejante a como ocurre con los microorganismos. Las
ventajas de estos cultivos celulares
son que las células se puedenmantener vivas fuera del cuerpo y se pueden multiplicar
en esas condicionesproduciendo poblaciones de células idénticas (clones) en
cantidades
apreciablespara los análisis bioquímicos. El crecimiento de células de mamífero fuera
delcuerpo abrió las puertas a esta tecnología. Los primeros conocimientos sobre el
cultivo celular se remontan a principios del siglo XX, con un experimento destinado
afinalizar una controversia de la neurobiología. La hipótesis que se examinaba era
conocida bajo el nombre de la teoría neuronal y afirma que cada fibra nerviosa es una
propagación de una única célula nerviosa y no el producto de la fusión de varias
células. Para dilucidar esta disputa, se colocaron pequeños fragmentos de médula
espinal en plasma coagulado sobre una cámara húmeda y caliente y se observaron al
microscopio a intervalos regulares. Al cabo de un día, más o menos, se pudo observar
que las distintas células nerviosas emitían prolongaciones largas y finas hacia el
plasma coagulado. De esta manera quedó demostrada la teoría neuronal y se
establecieron los cimientos de la revolución del cultivo celular. Alexis Carrel, un
investigador francés que trabajaba en el Instituto de Investigación Rockefeller en
Nueva York, colocó unos pequeños fragmentos de músculo cardiaco de embriones de
pollo en una placa de cultivo de laboratorio. El fibroblasto del músculo cardiaco se
mantuvo en este medio durante 34 años. Esto demostraba que las células podían vivir
en cultivo durante un largo periodo de tiempo y que algunas células sobrevivían más
tiempo que otras. Algunas células y tejidos son más adecuados que otros para los
estudios experimentales. Los más empleados tradicionalmente han sido el hígado
de rata y el músculo esquelético de vertebrados. En la actualidad existe una larga lista
de líneas celulares disponibles para su cultivo: células vasculares, células de piel,
células del músculo esquelético, condrocitos, osteoblastos, células del tejido adiposo,
células
decórnea, células mucogingivales y células pigmentadas. Algunas líneas celularesutiliz
adas habitualmente son:
Línea celular

Tipo celular y origen

3T3Fibroblasto de ratónBHK 21Fibroblasto de hamster sirioHeLaCélula epitelial hum

anaPtK 1Célula epitelial de rata canguroL 6Mioblasto de rataPC 12Célula cromafínica
de rataSP 2Célula plasmática de ratón

Muchas de estas líneas celulares derivan de tumores. Todas ellas soncapaces de

dividirse indefinidamente en cultivo tisular y expresan por lo menos algunas de las
propiedades diferenciales de su célula de origen. La BHK 21, He La y SP 2 son capaces
de crecer en suspensión; las otras líneas celulares requieren un sustrato de cultivo
sólido para multiplicarse.

2. Tipos de cultivos de células animales

Existen cinco tipos principales de cultivos celulares animales:-

Cultivos primarios

: son los cultivos recién obtenidos a partir de los tejidos, hasta que son sub cultivados
por primera vez. Son representativos del tejido original y tiene una mezcla de tipos
celulares. Se obtienen por disección de un tejido en condiciones estériles seguido de la
rotura de la matriz extracelular y de las uniones intercelulares que mantienen unidas
a las células. En general, los cultivos derivados de tejidos embrionarios y fetales
sobreviven y proliferan mejor que los de los tejidos adultos debido, seguramente, al
menor grado de especialización de sus células. Los fragmentos de tejido son
disgregados tratándolos con enzimas proteolíticas talescomo la tripsina y la
colagenasa y con agentes que fijan o quelan el Ca+2, del cual depende la adhesión de
una célula a otra. Luego los tejidos pueden disociarse en células aisladas, mediante la
desorganización mecánica suave. Para separar los distintos tipos celulares a partir de
una suspensión celular mixta, se utilizan varios métodos. Uno de ellos consiste en
aprovechar las diferentes propiedades físicas delas células. Por ejemplo, las células
grandes pueden separarse de las pequeñas, y las células densas de las ligeras
mediante sedimentación o centrifugación. Otro método se basa en la tendencia de
algunos tipos celulares a adherirse fuerte menteal cristal o al plástico; estas células
pueden separarse de las que se adhieren con menor intensidad. Una mejora
importante de esta última técnica depende de
laspropiedades específicas de unión de los anticuerpos. Los anticuerpos queúnicamen
te se unen a la superficie de un tipo celular de un tejido pueden ser acoplados a
diversas matrices, tales como colágeno, cuentas de polisacárido o de plástico,
formando una superficie de afinidad a la que sólo se pegarán las células reconocidas
por el anticuerpo. Más tarde, las células unidas se recuperan mediante una agitación
suave o, en el caso de una matriz digerible como es el caso
delcolágeno, mediante la degradación enzimática de la matriz. La técnica mássofistica
da de separación celular se basa en el marcado de células determinadas con
anticuerpos acoplados a un colorante fluorescente y en la separación
posterior de las células marcadas de las no marcadas mediante un clasificador celular
activado por fluorescencia (citómetro). En este aparato las células pasan en fila
indiaa través de un haz de láser, determinándose su fluorescencia. Un poco másadelan
te una boquilla vibratoria forma diminutas gotitas, la mayoría de las cuales contienen
una o ninguna célula. Las gotitas que contienen una única célula reciben
automáticamente una carga positiva o negativa en el momento de formarse, según
contenga o no una célula fluorescente; luego son desviadas al contenedor adecuado
mediante un intenso campo eléctrico. Los grupos de células son detectados por su
mayor dispersión de la luz y no reciben carga, cayendo en un contenedor residual.
Estas máquinas pueden seleccionar 1 célula de entre 1000 células y clasificar una5000
células por segundo. Cuando mediante alguno de los métodos mencionados, se ha
obtenido una población uniforme de células, esta población puede
utilizarsedirectamente para análisis bioquímico. Alternativamente. esta población celu
lar constituye un material de partida adecuado para el cultivo celular, permitiendoest
udiar el complejo comportamiento de las células bajo las condicionesestrictamente
definidas de una placa de cultivo.

- Líneas celulares finitas

. Los cultivos celulares primarios derivados de un tejido normal pueden propagarse

por duplicación de la población un número finito
deveces. La mayoría de las células de vertebrados mueren tras este número dedivision
es: por ejemplo, las células cutáneas humanas en cultivo sobreviven durante algunos
meses, dividiéndose únicamente entre 50 y 100 veces antes de morir. Se sugirió que
esta vida limitada estaba relacionada con la vida limitada del animal del que derivan.
El número de duplicaciones es mucho menor cuando se utilizan
célulasdiferenciadas o adultas. A menudo estas células muestran las propiedadesdifer
enciales de sus orígenes: los fibroblastos continúan segregando colágeno; las células
derivadas del músculo esquelético embrionario se fusionan formando fibras
musculares gigantes que se contraen espontáneamente en la placa de cultivo; las
células nerviosas emiten axones que son excitables eléctricamente y que establecen
sinapsis con otras células nerviosas; y las células epiteliales forman extensas capas
con muchas de las propiedades de un epitelio intacto, Puesto que estos fenómenos se
producen en los cultivos, resultan accesibles al estudio a través de sistemas y técnicas
que no se pueden aplicar a los tejidos intactos.
- Líneas celulares continuas

: También llamadas establecidas. No todas las células de una línea celular mueren con
el tiempo. A veces, siguiendo a una fase de “crisis” en un cultivo primario o en una
línea celular finita, puede surgir una población de células que adquiere la capacidad de
crecer infinitamente. Este fenómeno
sedenomina transformación. La aparición de una línea continua está marcadanormal
mente por una alteración citomorfológica (menor tamaño celular, menoscapacidad de
adherencia, forma más redondeada), altas tasas de crecimiento, alta eficiencia de
clonaje, mayor capacidad para generar tumores. Son clones celulares más constantes
que las células primarias pero con frecuencia presentan alteraciones genéticas y
estructurales que las hacen bastante diferentes de las células de origen.

- Líneas celulares transformadas

: las líneas celulares continuas se originanpor transformación espontánea in vitro de

células normales pero también se puedenobtener líneas celulares transformadas
directamente, cultivando células procedentes

de tejidos tumorales, o por una transformación in vitro de células normales

usandovirus completos o fragmentos de ADN de un virus transformante o con
sustanciasquímicas. A menudo crecen sin fijarse a ninguna superficie y proliferan en
una placade cultivo hasta una densidad muy superior a la de las células normales. Las
líneascelulares transformadas neoplásicamente resultantes de estas últimastransform
aciones son capaces de provocar tumores si se inyectan en un animal.
Laslíneas celulares continuas, tanto
transformadas como no transformadas, resultanextremadamente útiles para la
investigación celular como fuente de un número muyelevado de células de un tipo
uniforme. No obstante, es importante reconocer quelas células de estas líneas
celulares casi siempre se diferencian de sus antecesorasnormales de los
tejidos a partir de las cuales derivaron, en algunos aspectosimportantes. La
uniformidad genética de una línea celular puede mejorarse medianteel clonaje, que
consiste en el aislamiento de una única célula y su proliferación paraformar una
colonia numerosa. Un clon es cualquier población de células
derivadasde una única célula precursora. Una de las aplicaciones más importantes del
clonado celular ha consistido en el aislamiento de líneas celulares mutantes
condefectos en genes específicos. El estudio de las células que son defectuosas en
unaproteína determinada, a menudo revela muchos datos sobre la función de
estaproteína en la célula normal.

- Líneas celulares híbridas:

Es posible fusionar una
célula con otra paraformar una célula combinada con dos núcleos separados, denomin
adaheterocarionte. La fusión se suele realizar tratando una suspensión de células
conciertos virus inactivados o con polietilenglicol, que alteran las membranasplasmáti
cas de las células de tal forma que éstas tienden a fusionarse entre sí.
Losheterocariontes ofrecen la posibilidad de mezclar los componentes de dos
célulasdiferentes y estudiar sus interacciones. Por ejemplo, el núcleo inerte de un
eritrocitode pollo, cuando es expuesto por fusión al citoplasma de una célula de
cultivo encrecimiento, se reactiva produciendo ARN y, con el tiempo, replicando su
ADN. Laprimera prueba directa de que las proteínas de membrana son capaces de
moverseen el plano de la membrana plasmática se obtuvo en un experimento en el
que sefusionaron células de ratón y células humanas: aunque las proteínas de la
superficiede la célula de ratón y de la célula humana estaban inicialmente confinadas a
suspropias mitades de la membrana plasmática del heterocarionte, rápidamentedifun
dieron y se mezclaron por toda la superficie de la célula. Con el tiempo, el
heterocarionte sufre mitosis y produce una célula híbrida o hibridoma en la
que lasdos envueltas nucleares se han disgregado, permitiendo que todos los
cromosomasse agrupen en un gran núcleo único. Aunque estas células híbridas
pueden ser clonadas para generar líneas celulares híbridas, las células híbridas
iniciales suelenser muy inestables y tienden a perder cromosomas especialmente si
las dos célulasfusionadas proceden de diferentes especie. Por razones desconocidas
estas célulashíbridas hombre-
ratón tienden a perder fundamentalmente los cromosomashumanos. Estos se pierden
de manera aleatoria, dando lugar a diversas líneascelulares híbridas hombre-ratón
diferentes, cada una de las cuales contiene algunoso un único cromosoma humano.
Este fenómeno ha permitido la localización degenes en el genoma humano. Por
ejemplo, únicamente las células híbridas quecontienen el cromosoma humano 11
sintetizan la insulina humana, lo cual
indica queel gen codificante de la insulina se halla situado en el cromosoma 11. Loshib
ridomas que segregan anticuerpos monoclonales se producen como resultado dela
fusión de células B productoras de anticuerpos que proceden de un animal opaciente
inmunizado con una línea celular de mieloma maligno capaz de crecer deforma
indefinida in vitro.

3. Medios de cultivo

La mayor parte de las células de los tejidos no están adaptadas a crecer ensuspensión
y necesitan una superficie sólida sobre la que poder crecer y
dividirse.Originariamente este soporte mecánico lo constituía un coágulo de plasma,
pero
enla actualidad suele sustituirse por la superficie de plástico o vidrio de loscontenedor
es donde se realiza el cultivo. Sin embargo, las células difieren en susexigencias, y
alguna de ellas no crecerán o no se diferenciarán a menos que la placade cultivo esté
cubierta por componentes de matriz extracelular, como por ejemplo elcolágeno.Hasta
principios de 1970, el cultivo de tejidos era algo así como una mezclade ciencia y
brujería. Aunque los coágulos plasmáticos fueron sustituidos por placasde medios
líquidos con una mezcla bien definida de sales, aminoácidos y vitaminas,la mayoría de
los medios incluía también una proporción de material biológico maldefinido, como
por ejemplo, suero de caballo, suero fetal de ternera o un extracto deembriones de
pollo. Estos medios se utilizan aún hoy en día para la mayoría de los
cultivos histológicos rutinarios, pero resultan inapropiados para determinar lasnecesi
dades específicas para el crecimiento y la diferenciación de un tipo particular de
célulaEsta dificultad ha conducido al desarrollo de varios medios definidosquímicame
nte que permiten el crecimiento de diferentes tipos de células. Ademásque pequeñas
moléculas conocidas, contienen a menudo uno o más factores decrecimiento
protéicos, que la mayoría de las células necesitan para poder sobrevivir y proliferar en
cultivo: por ejemplo, ciertas células nerviosas necesitan trazas delfactor de
crecimiento nerviosos (NGF) para diferenciarse y sobrevivir en cultivo
igualque en el animal intacto. Se han descubierto otros factores de este tipo quedesem
peñan un papel vital en el desarrollo y/o en la proliferación de tipos
celularesdeterminados. La búsqueda de nuevos factores se ha visto facilitada gracias a
laexistencia de los medios químicamente
definidos.En general, los medios para el cultivo de células tratan de simular lascondici
ones fisiológicas dentro de los tejidos. Tienen un pH próximo a la
neutralidady normalmente necesitan de la incorporación de suero en concentraciones
quevarían desde el 5 al 20%, aunque hay algunos procesos de producción yprocedimi
entos experimentales que requieren el uso de condiciones libres de suero.La fuente
más común de suero es bovina y puede ser de adulto, recién nacido o deorigen
fetal.Además el medio contiene varios componentes complejos como un
sistemade tampón (fosfato, bicarbonato, CO2
o HEPES), aminoácidos (incluyendoglutamina), vitaminas, glucosa y otros (fosfato de t
ryptosa, piruvato, 2-mercaptoetanol, etc). La elección de un tipo particular de medio
depende del tipo decélula a
crecer.Los medios de cultivo más empleados son: medio DMEM (Dulbecco,sModified
Eagles Medium) y el medio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute1640). DMEM
es el más utilizado, las células que crecen en este medio necesitanun aporte de CO2
atmosférico al 10%. Es una ligera modificación del medio esencialmínimo que
contiene 4 veces más vitaminas y aminoácidos y de 2 a 4 veces másglucosa. Contiene
hierro y otros elementos traza. La mayor parte de las célulashumanas, de mono,
hamster, rata, ratón y pollo se crecen en este medio. Loshibridomas también. RPMI es
el medio tradicionalmente utilizado para las líneas
celulares de linfoblastoides humanos. Tiene gran cantidad de fosfato y se formulacon
un 5 % de CO 2. Este medio siempre está suplementado con suero.

La glucosa se utiliza a una concentración de 5-10 mM. Los aminoácidos son todos de
laforma L y, con una o dos excepciones, se utilizan a concentraciones de 0,1-0,2 mM;
las vitaminas seusan a una concentración 100 veces menor, es decir, de
aproximadamente 1µM.

El suero quegeneralmente es de caballo o de ternera, se añade hasta formar el 10%

del volumen total. Lapenicilina y la estreptomicina se añaden para inhibir el
crecimiento de bacterias. El rojo fenol es uncolorante indicador de pH, cuyo color se
monitoriza para asegurar que el pH sea aproximadamente de7,4. Generalmente, los
cultivos se mantienen en recipientes de plástico o vidrio, con una superficiepreparada
adecuadamente que permita la adherencia de las células.

Todos los componentes que se requieren para los medios de cultivo estándisponibles
comercialmente. Pueden ser suministrados como un medio en polvo querequiere su
reconstitución en agua desionizada o destiladas que se esterilizaposteriormente por
filtración, o alternativamente, se puede suministrar en formalíquida con distinto
grado de concentración.Es muy importante seleccionar el suero adecuado. La mayoría
de las líneascelulares se crecen en DMEM suplementado con un 10% de suero de
ternero o 10%de suero fetal de ternero. Las células transformadas crecen mejor en
suero deternero. Las células normales no transformadas suelen requerir el suero fetal
que esmás rico y tiene una menor cantidad de anticuerpos que afectan negativamente
alcrecimiento celular. Algunos clones de células T también crecen mejor en suero
fetaly para las células con más dificultad de crecimiento suele usarse el suero fetal
peroal 20%. Debido al costo y escasez de suero fetal de ternero, en algunos casos
seutiliza como alternativa el suero de caballo. Dada la complejidad de este tipo de
cultivo los medios deben ser ensayados antes de su utilización a gran escala.
Estaspruebas pueden ser tan sencillas como colocar las células en el suero a
ensayar examinando señales morfológicas de toxicidad o determinando la eficiencia d
eplaqueo o pruebas mucho más complejas estudiando la eficiencia de clonaje
usandohibridomas o líneas celulares tumores.

4. Crecimiento celular

Los cultivos de células animales pueden crecer en suspensión o adheridos aplacas de

cultivo. En el caso de las células capaces de mantenerse en
suspensión(normalmente son los cultivos primarios), el crecimiento presenta tres fas
es: laprimera es la fase de latencia, que dura aproximadamente 1 o 2 días durante la
cualno se incrementa el número de células. Cuando se trata de cultivos primarios
dondelas células acaban de ser disgregadas, esta fase puede alargarseconsiderableme
nte. En este tiempo las células se aclimatan al medio de
cultivo,sufriendo cambios en su citoesqueleto y sus enzimas para ajustarlos al nuevom
edio. La siguiente fase se llama fase logarítmica, durante la cual el número
decélulas se incrementa
exponencialmente. Este crecimiento se mantiene mientrashaya suficientes nutrientes.
Cuando alguno de los nutrientes esenciales se agota, elcultivo llega a la fase
estacionaria durante la cual el número de células permanececonstante (aunque no
todas son necesariamente viables). Si no se resiembra oañade medio fresco, las
células mueren. Este tipo de curva de crecimiento seobtiene experimentalmente de
forma semejante a los cultivos bacterianos utilizandomedidas de turbidez o contando
las células en un contador celular (células por ml)frente al tiempo de cultivo.En el caso
de las células que crecen adheridas a una superficie, las célulasprimero se adhieren a
la placa y después crecen formando un cultivo en “monocapa”que continuarán
creciendo hasta que dejen de dividirse, en este caso no porque seagoten los nutrientes
sino porque presentan una inhibición por contacto que para ladivisión cuando las
células alcanzan la confluencia. En estos casos, para hacer curvas de crecimiento no se
pueden ir tomando alícuotas a distintos tiempos paradeterminar su concentración,
sino que se mide la densidad de las células que estáncreciendo sobre la superficie de
la placa utilizando un microscopio de contraste defase invertido. La densidad celular
medida como células por cm se representa enescala logarítmica frente al tiempo de
cultivo.

Para el cultivo de este tipo de células se deben utilizar placas que han
sidotratadas químicamente para facilitar la adhesión de las células. Se denominanplac
as para cultivo de tejidos y son diferentes a las placas de Petri normales. Si unacélula
adherente se resiembra en placa de Petri normal, se agregará en grupos, nocolonizará
toda la placa y dejará de crecer rápidamente. Este proceso es reversibleal pasarlas de
nuevo a la placa adecuada. Las células no adherentes se puedencrecer en cualquier
tipo de placa de Petri u otro tipo de vial.

5. Contaminación

Una de las condiciones esenciales de los cultivos celulares es la completaausencia de

organismos distintos de las células en cultivo que puedan interferir ensu crecimiento
o matarlas. Por lo tanto, los contenedores de cultivo deben estar estériles y si son de
vidrio ser autoclavados al igual que los medios de cultivo.Además, los medios suelen
incluir en su composición antibióticos que eviten
laproliferación de microorganismos como bacterias o hongos. Todas lasmanipulacione
s deben llevarse a cabo en ambiente estéril bajo cabinas de flujolaminar.

6. Mantenimiento de cultivos celulares

Independientemente del tipo de células, para mantener un cultivo celular
encondiciones óptimas es esencial mantener las células en la fase logarítmica
decrecimiento tanto tiempo como sea posible. El tiempo de duplicación normal para
lascélulas animales es de 24-46 h. Si las células se dejan durante prolongadosperiodos
de tiempo en la fase estacionaria perderán su eficiencia de plaqueo ydisminuirá su
calidad. Cada línea celular debe ser transferida o refrescada con unafrecuencia
distinta y cuando alcanzan densidades celulares diferentes. Algunascélulas no
sobreviven si son sembradas o inoculadas con muy baja densidad, otraslo hacen
escasamente si el cultivo llega a estar demasiado concentrado. Algunascélulas
transformadas son capaces de agotar su medio tan rápidamente cuando elcultivo está
denso que se deterioran en solo una noche. Obviamente, la frecuenciade los
subcultivos dependerá de varios factores que varían de unas células a otras:densidad
de inoculación, tasa de crecimiento, eficiencia de plaqueo, densidad desaturación etc.
Existen dos métodos generales de realizar subcultivos según se tratede células
adherentes o no adherentes. En ambos casos se puede partir de cultivosque ya están
creciendo en sus placas o bien de células congeladas en estado decriopreservación.

- células adherentes: estas líneas celulares tienen una inhibición de sucrecimiento

cuando alcanzan la confluencia. En este caso es fundamental examinar rutinariamente
las células al microscopio para observar cuando ocurre este procesoya que ese es el
momento para realizar el subcultivo. Este requiere la eliminacióndel medio de cultivo
lavando la capa de células con PBS (tampón fosfato salino),deshacer la capa de células
usando enzimas proteolíticas (normalmente tripsina),resuspenderlas y dispensar las
células en nuevos recipientes para el cultivo detejidos donde se ha añadido ya el
volumen de medio fresco adecuado (existe unvolumen mínimo necesario para
neutralizar la tripsina). Si las células muestran unatendencia a agregarse, es necesario
centrifugar la suspensión celular y lavarla conmedio de cultivo utilizando la menor
velocidad de centrifugación posible y no agitar las células para su resuspensión. Se
realiza después un contaje de células viables yse calcula el factor de dilución preciso
para realizar la resiembra. El subcultivo yapreparado se gasea con aire enriquecido
con un 5% de CO2 en condiciones de esterilidad y se incuba a 37º C.

Es importante que el trabajose realice en estrictas condiciones de esterilidad y

asepsia.- Líneas de células en suspensión: como en el caso anterior, el primer pasoes el
examen microscópico de los cultivos para comprobar los signos de deteriorocomo la
lisis o muerte celular que son indicativos de un sobrecrecimiento. A veces,el color del
medio puede utilizarse como indicador de la densidad celular: rojo-naranja es normal
mientras que el amarillo indica que el medio ha llegado a ser demasiado ácido con el
peligro de entrar en fase estacionaria. En este caso elproceso es más simple y
semejante al que se realiza con los cultivos bacterianos.Primero se debe realizar un
contaje de células viables. Se preparan los viales con elmedio de cultivo precalentado
a 37 º C y gaseado con la mezcla de aire y CO2
estériles. Se añade el volumen adecuado de células del cultivo anterior.Normalmente
no se debe permitir que la viabilidad de las suspensiones celularesbajen del 90%. Sin
embargo, cultivos con viabilidad menor pueden recuperarse alrealizar el subcultivo
aunque será necesario centrifugar las células y decantar elmedio agotado. Un caso
extremo de la necesidad de realizar subcultivos en elmomento adecuado son algunas
líneas celulares hemotopoyéticas dependientes decitoquinas que cuando se colocan
en un medio con una concentración inadecuada de IL-2 o se les deja agotarlo, sufren
inmediatamente apóptosis y no se puedenrecuperar y esto puede ocurrir en menos de
24 h.Como ya se ha mencionado, es imprescindible realizar estos subcultivos si nose
quiere degenerar la línea celular originando una línea transformada. De hecho,esta es
la forma de obtener células transformadas, dejando que células “normales”crezcan
hasta altas densidades y seleccionar aquellas que puedan crecer bien enestas
condiciones.Durante los procesos de subcultivo y criopreservación es importante
estimar el porcentaje de células viables que hay en una población. El método más
simple
esexaminar las células al microscopio utilizando una cámara de recuento(hemocitome
tro) utilizando un marcador de vitalidad como es el azul de tripanoaunque existen
otros métodos. El cálculo de la viabilidad de la suspensión celular serealiza dividiendo
el número de células viables por el número de células totales.
Unaviabilidad inferior al 90% es la señal de que los cultivos están creciendo encondici
ones sub-óptimas o que han agotado los nutrientes.

7. Criopreservación

Para la mayoría de los laboratorios es imposible mantener líneas celular encultivo de

manera indefinida, además los cultivos celulares sufren cambios
genéticoscon las continuas resiembras con el riesgo de perder sus característicasdifer
enciadas. Por tanto es necesario almacenar un stock de células par sus
usosposteriores. Es una práctica recomendable limitar el número de resiembras de
cadalínea celular y reemplazarlas por las que están almacenas en congelación. Esto
esmenos importante para las líneas celulares no diferenciadas que se pueden
dividir de forma
infinita.En principio todas las líneas celulares pueden ser criopreservadas ennitrógen
o líquido a –196 ºC. Es esencial para una eficiente criopreservación, elcongelado lento,
bajando de 1 a 3ºC por minuto, y una rápida descongelación que sepuede obtener
colocando los viales en un baño de agua a la temperatura requeridapara
el crecimiento. La adición
de un crioprotector como glicerol o dimetil sulfóxido(DMSO) aumenta la
supervivencia de los productos criopreservados. Sin embargo el DMSO tiene algunas
propiedades tóxicas. Por tanto se debe tener cuidado si
seutiliza el crioprotector y lavar las células inmediatamente después de sudescongelac
ión. Se pueden utilizar viales de cristal o de plástico y sólo depende dela necesidad del
cierre hermético que sólo se consigue con los de cristal.Las células a congelar deben
estar en fase logarítmica de crecimiento y enestado saludable y nunca se deben
utilizar cultivos con viabilidad inferior al 80%. Sedebe rellenar cada vial con un alto
número de células (4 x 10

6) pero sin exceder de 2x 10

7. Se recomienda usar como medio para la congelación suero fetal de ternerocon un 7-

10% de criopreservador y eliminar el medio de cultivo normal que
contienebicarbonato manteniendo el pH próximo a la neutralidad. Los viales ya
preparadosse congelan poco a poco hasta alcanzar los –
60ºC y se transfieren despuésrápidamente a nitrógeno líquido donde se mantienen. La
s células animalesmantenidas a –
70ºC pierden su viabilidad después de unos pocos meses dealmacenamiento. Para
“resucitar las células, la descongelación debe ser rápida. Aveces, el nitrógeno atrapado
en el vial explota con la descongelación. Para evitarlose puede dejar el vial 2 minutos a
temperatura ambiente antes de pasarlo al baño.Una vez descongelado el contenido de
los viales se transfiere a tubos donde seañade muy lentamente un pequeño volumen
del medio de crecimiento. Después sepasa al recipiente normal de cultivo

CONTROLES DE CALIDAD

1.Cuantificación de la viabilidad. Mediante el test de exclusión decolorante con azul de

tripano.2.Verificación de la línea celular. Cada tipo de célula cultivadatiene un
protocolo definido para verificar su autenticidad que puede ser
unensayo funcional (producción de un anticuerpo) o mediante análisiscitogenético o
isoenzimático.3.Detección de contaminación. La contaminación por bacterias
uhongos es fácil de detectar visualmente. Sin embargo no ocurre asícuando el cultivo e
stá contaminado con micoplasmas (bacterias máspequeñas que existen con solo
0,3µm de diámetro) y se necesita un test de control específico. Este control se debe
realizar cada 4-6 semanas.

BIBLIOGRAFIA:

http://es.scribd.com/doc/64172154/10-Cultivos-celulares-animales

http://www.buenastareas.com/ensayos/Cultivo-De-Celulas-Animales/1614199.html