INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS

LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

GRUPO : 5QM2 SECCIÓN: 3

PROFESOR :CAROLINA ACUÑA GONZALEZ

Práctica

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS PROTEOLITICAS

MÉTODO DE KUNITZ

02/03/18

OBJETIVOS

 Elaborar una curva la cual refleje la actividad enzimática de dichas enzimas

  Determinar la actividad proteolítica de enzimas como la bromelaína, papaína, entre otras proteasas.

Fundamento

El método de kutniz se emplea para determinación de la actividad de las enzimas proteolíticas , el

cual se basa en medir la cantidad de péptidos y aminoácidos solubles liberados durante la hidrolisis
de la caseína proteolítica (bromelaina y papaína) aprovechando la capacidad , de ciertos de ellos y
puedan absorber selectivamente a 280 nm .

Resultados

Tabla 1: Actividad enzimática de la tripsina.

Concentración A280
Tubo de tripsina Problema Testigo A280 corregida
(mg/mL)
T1 y 1 0.04 0.240 0.0 0.240
T2 y 2 0.08 0.342 0.018 0.324
T3 y 3 0.12 0.495 0.028 0.467
T4 y 4 0.16 0.565 0.030 0.535
T5 y 5 0.20 0.667 0.059 0.608
Problemas
Tl y l Bromelaína1:10 0.714 0.094 0.62
Tll y ll Bromelaína1:20 0.543 0.074 0.469
Tlll y lll Papaína 1:1.5 0.333 0.197 0.136
TlV y lV Papaína 1:2 0.194 0.146 0.048

0.7
y = 2.3675x + 0.1507
0.6 R² = 0.9823
Absorbancia corregida

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
concentracion de tripsina (mg/mL)

Grafica 1: Curva de actividad enzimática de la tripsina a 280 nm.

Tabla 2: Curva de actividad enzimática específica para la digestión de caseína por tripsina.
Tubo Unidades tripticas A280 corregida
 1 0.00472 0.240
2 0.00944 0.324
3 0.01416 0.467
4 0.01888 0.535
5 0.0236 0.608

Calculo de unidades tripticas

𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑡𝑎 Unidades tripticas por por mg de
[𝑈𝑇]𝑐𝑎𝑠
𝑚𝑔 = tripsina
20
2.3675 UT= 0.118/mg
[𝑈𝑇]𝑐𝑎𝑠
𝑚𝑔 = = 0.118
20

El resultado obtenido es por 1mg de tripsina. Posteriormente se realiza una regla de tres para calcular el valor
correspondiente de cada concentración.

0.04(0.118𝑈𝑇)
𝑈𝑇 = = 4.72𝑥10−3
1𝑚𝑔

0.7

y = 20.064x + 0.1507
0.6 R² = 0.9823
Absorbancia corregida

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025
Unidades Tripticas (UT)

Grafica 2: Curva de actividad enzimática específica a 280 nm.

a)Indique la actividad especifica , en unidades tripticas por gramo de muestra , de la piña (bromelaina ) y la
papaya(papaina) .

Ec. De la recta
Y=20.044x+0.1507

X representa el valor de las UT, donde despejamos :

 (𝑦 − 0.1507) 0.469 − 0.1507
x= = = 0.0158 𝑈𝑇
20.064 20.064

1ml ----0.0158 UT β=0.50765 UT 25g ----0.50765

32ml--- β 1g ----- µ µ=0.02 UT

DISCUSIÓN

Se cometieron errores al momento de pesar y preparar las soluciones de tripsina , ya que no se peso
la cantidad adecuada , se peso menos de lo requerido , en este caso necesitabamos 0.040g y lo que
se peso fue 0.0040 g es decir 4 mg muy poca enzima para que se llevara la reacción junto con el
sustrato , por lo cual no pudo efectuarse provocando que dieran lecturas de absorbancias negativas ,
por que no se habia llevado la reaccion y no tuvo el efecto esperado, por lo cual , estos datos
experimentales se descartaron y tuvimos que tomar otros datos teoricos proporcionados por el
profesor para poder hacer el análisis y discusiones de el comportamiento y el efecto que provocan las
enzimas proteoliticas.

Con base en los resultados obtenidos en la realización de la práctica podemos observar en la tabla 1
que de acuerdo al incremento de la concentración de tripsina la cual es una enzima proteolítica,
aumenta la cantidad aminoácidos y péptidos, producidos por minuto de digestión, este aumento puede
ser mejor analizado en la gráfica 1, donde encontramos la curva tipo de la actividad de la tripsina,
donde a partir de esta obtuvimos una ecuación de la recta y de la cual tomamos el valor de la pendiente
para calcular la cantidad de unidades tripticas por miligramo de tripsina obteniendo un valor de 0.118
, este valor nos dice que hay 0.136 de tripsina en cada aumento de unidad de absorbancia a 280nm
por minuto de digestión.

Posteriormente en la tabla 2 encontramos los valores para la realización de la gráfica 2 la cual muestra
una gráfica la actividad enzimática especifica de la digestión de la caseína por medio de la tripsina, en
la cual observamos nuevamente el aumento de la actividad enzimática, y a partir de esta grafica se
obtuvo la ecuación de la recta para calcular las unidades tripticas pero ahora de nuestros problemas,
bromelaina y papaína, y de acuerdo los resultados se observa que hay una mayor actividad enzimática
en la bromelaina con respecto de la papaína.

Conclusiones
  La tripsina aumenta su actividad con el incremento de la concentración.
 La bromelaina tiene una mayor actividad respecto de la papaína.
 Las unidades tripticas por miligramo de tripsina es 0.118 UT.

CUESTIONARIO

a)Defina actividad enzimática y actividad enzimática especifica

-Actividad enzimática: Capacidad de la enzima para inducir una reacciónquímica determinada. A menudo esta reacción
se mide de forma indirecta

-Actividad enzimática específica: Es la relación entre la actividad enzimáticay la cantidad de proteína.

b)Escriba la clasificación de las proteasa, en función de su mecanismo de acción y diga en que grupo se
ubican las determinadas en la práctica.
Se clasifican en :

•Serín Proteasas
•Cisteín Proteasas
•Treonin Proteasas
Las utilizadas en la práctica pertenecen al grupo de las Cisteín proteasas.

c)¿Para que se adiciona cisteína en las muestras de piña, y de ablandador?

El mecanismo usado para romper un enlace péptidico implica utilizar un residuo del péptido que contenga
Cisteína y Treonina o una molécula de agua, de tal forma que sea posible atacar al grupo carbonilo del
péptido.Una forma de hacer nucleófilos es mediante una triada catalítica, en donde un residuo de histidina es
usado para activar la serina, cisteína o treonina como nucleófilodrolizar los enlaces peptídicos de proteínas y la
inhibición por reactivos con grupo sulfhidrilo.
d)¿cuál es la especificidad de enlace de la tripsina?
Es una enzima específica ya que liga al péptido en las posiciones del carboxilo de residuos de Arginina o lisina
en la cadena, ambos aminoácidos con grupos R cargados positivamente fragmentando al péptido inicial.
-Aplicaciones que tienen las proteasas
Las proteasas han sido utilizadas en alimentos durante siglos. La renina, un tipo de proteasa obtenida de los
estómagos de los terneros, ha sido utilizada tradicionalmente para la fabricación de quesos. Las proteasas
también tienen un papel en la producción de salsa de soja, embutidos, fiambres y harinas.
Las proteasas son usadas para tratar coágulos sanguíneos, limpiar heridas y aumentar la efectividad de
algunos antibióticos. Un tipo de proteasa obtenida de los tallos de piñas es utilizada como antiinflamatorio y
otras enzimas proteasas degradadoras de proteínas se utilizan para tratar las sepsis severas.
Las proteasas microbianas se utilizan en la industria del cuero para eliminar el pelo de la piel de los animales y
ablandar el cuero. También ayudan a evitar que se encoja la lana. Agregadas a los detergentes, las proteasas
ayudan a eliminar las manchas producidas por proteínas.
 Bibliografía

 Horton, H. Moran, L (2008).Principios de Bioquímica.4ta Edición. México: Pearson Educación de

México.649-653
 http://www.iib.unsam.edu.ar/archivos/docencia/licenciatura/biotecnologia/2017/BioProt/149565805
8.pdf
 Principios de Bioquímica 3ª/4ª edición. (2000/2005) David L. Nelson y M. M. Cox. Editorial Omega
(http://www.freeman.com/lehninger).pp494-495
 Bioquímica 3ª Ed. (2002) C.K. Mathews, K.E. van Holde, K.G. Ahern. Pearson Educación S.A.pp371-372