Determinación de la concentración de ácido salicílico en hojas de tomate

(Solanum lycopersicum L.) posterior a su aplicación por aspersión

Enrique Guzmán-Téllez1, *Adalberto Benavides-Mendoza1, Daniel Díaz-Montenegro2

1
Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Calzada Antonio Narro No.1923, Col. Buenavista, C.P. 25315,
Saltillo, Coahuila. *Autor para correspondencia: abenmen@uaaan.mx
2
Laboratorios Agroenzymas, S.A. de C.V., Vía Dr. Gustavo Baz 176-3, Col. San Jerónimo Tepetlacalco, C.P. 54090,
Tlalnepantla, Edo. Mex.

Resumen. El ácido salicílico (AS) es utilizado en la
práctica agrícola por su efecto de inducción de
tolerancia al estrés. Varios estudios describen los
beneficios para los cultivos en presencia de este
compuesto, pero se conoce poco acerca de la dinámica
de la concentración del compuesto en los tejidos
vegetales posterior a su aplicación. El objetivo de este
estudio fue determinar el cambio en el tiempo de la
concentración de AS en el tejido foliar, en respuesta a la
aspersión de AS en concentración 10-4 M (0.0138 g L-1)
en hojas de tomate (Solanum lycopersicum L.) bajo
invernadero. Dos días después de una primera
aplicación en plantas de 30 días de edad la
concentración de AS foliar alcanzó un máximo de 8 µg
g-1, el doble de lo observado en el testigo. Esta
concentración disminuyó paulatinamente hasta que
ocho días después igualó al testigo. Una segunda
aplicación realizada en plantas de 42 días de edad
mostró prácticamente la misma respuesta, pero con la
diferencia de que la disminución del AS fue muy
rápida, igualando a la concentración del testigo en dos
días. La aplicación de ácido salicílico bajo las
condiciones de este ensayo no presentó ningún tipo de
beneficio al peso de raíz y tallo, aún en los momentos
cuando se presentó la mayor concentración en el tejido.
Palabras clave: Ácido salicílico, resistencia sistémica,
inductores de tolerancia, elicitores.
Introducción
Las hormonas vegetales modifican el crecimiento y
desarrollo de las plantas induciendo cambios en
procesos celulares, fisiológicos y morfológicos. En años
recientes algunos nuevos grupos de hormonas han sido
identificados, tal es el caso de los salicilatos, que
además de involucrarse en el control del crecimiento y
desarrollo de la planta, actúan también como
señalizadores en los procesos que dan lugar a las
respuestas adaptativas de las plantas al ambiente [1, 2].
El ácido salicílico se encuentra de forma natural en las
plantas, juega papeles importantes en cuanto al
crecimiento y tolerancia al estrés [3, 4, 5], además de
participar como parte de las señales internas que
regulan la respuesta de la defensa de las plantas contra
plagas y patógenos [6, 7], y abióticas [2, 4, 8]. Al
aplicarlo en forma exógena, el ácido salicílico induce
tolerancia al estrés, mejorando la respuesta biológica de
la planta frente a la salinidad y los extremos de
temperatura, modificando además las concentraciones
de antioxidantes, nutrientes y clorofila [9, 10].
La utilización de los salicilatos en la práctica
agrícola parece tener potencial desde el punto de vista
comercial, considerando los resultados positivos
encontrados en diferentes ensayos [11, 12, 13, 14, 15,
16, 17, 18, 19]. Es cada vez más claro que el uso de
compuestos de este tipo se torna una necesidad
considerando que los estándares actuales de producción
exigen la disminución del uso de pesticidas [20]. Por un
sentido práctico, la literatura científica y los trabajos
técnicos realizados para el desarrollo y registro legal de
productos cuyos ingredientes activos contienen
compuestos inductores de tolerancia como el ácido
salicílico, describen los cambios biológicos que se
presentan en las plantas, por ejemplo los ajustes en la
actividad de enzimas, antioxidantes y otros metabolitos
[21, 22, 23] y las modificaciones en la tolerancia a
factores ambientales [19]. Menor atención a recibido el

Determinación de la concentración de ácido salicílico en hojas de tomate (Solanum lycopersicum L.) posterior a su aplicación por aspersión
tiempo de residencia del compuesto y el
comportamiento de la concentración de los salicilatos
en los tejidos vegetales, así como su efecto residual
cuando este es aplicado vía foliar.
De lo anterior se desprende el presente estudio
que tuvo por objetivo determinar el comportamiento
dinámico de la concentración de ácido salicílico en el
tejido foliar, en respuesta a la aplicación exógena de
este compuesto en hojas de tomate (Solanum
lycopersicum L.) bajo invernadero.
Resultados y Discusión
Dinámica del ácido salicílico (AS) en hojas
Después de realizada la aplicación exógena de
ácido salicílico (AS) la concentración alcanzó un pico al
transcurrir 2 días después de inicio de la aplicación
(DDIA), para posteriormente presentar una disminución
paulatina hasta alcanzar una concentración
estadísticamente igual a la del testigo 10 días después
de la aplicación (Figura 1). Al realizar la segunda
aplicación exógena de ácido salicílico, a los 14 DDIA
se observó una respuesta análoga a obtenida en la
primera aplicación. Sin embargo, con el propósito de
aumentar la información obtenida posterior a esta
segunda aplicación se colectaron tejidos foliares sin
esperar a transcurrir dos días. Para ello se tomaron
muestras a las 8, 14 y 24 horas después de esta segunda
aplicación, encontrando una respuesta significativa a las
24 hrs (15 DDIA). Posterior a ello se observó
prácticamente la misma respuesta descrita para la
primera aplicación.
Este comportamiento dinámico en la
concentración de ácido salicílico (AS) en hojas de
tomate, inducido por las aplicaciones exógenas de este
compuesto, concuerda con lo reportado por He et al.
[24] al aplicar el acaro Tetranichus urticae Koch en
hojas de frijol (Phaseolus vulgaris L.) y por Ogawa et
al. [8] en Arabidopsis con la aplicación de estímulos
mecánicos en las hojas. Los autores mencionados
encontraron incrementos significativos en la
concentración del AS foliar, teniendo los picos
máximos a las 24 hrs después del estímulo, para
2
posteriormente iniciar una disminución en la
concentración, siendo el tiempo de máxima
acumulación similar a lo encontrado en el presente
trabajo. Ello parece indicar una similitud en la dinámica
temporal del AS posterior a una aplicación exógena y a
un estimulo de estrés. Del mismo modo, la inoculación
de patógenos en los cotiledones de plántulas de pepino
(Cucumis sativus L.) con Pseudomonas [25] y con el
virus de la necrosis del tabaco (VNT) [26], dieron lugar
a incrementos en la concentración de AS en las hojas de
las plántulas. El pico de máxima concentración de AS
se encontró a las 18 hrs después de la inoculación de
Pseudomonas para decaer en adelante, mientras que
para la inoculación con el VNT ocurrió a los cuatro días
después de la inoculación igualando la concentración de
las plantas no inoculadas a los ocho días después de la
inoculación, de forma análoga a lo observado en el
presente trabajo. La dinámica descrita puede variar de
acuerdo a los órganos de la planta. Por ejemplo, si la
inoculación del virus ocurre en los cotiledones de
tabaco (Nicotiana tabacum L.), entonces en lugar de
una caída en la concentración de AS en los cotiledones
en los tiempos mencionados anteriormente, se presenta
un incremento durante los diversos periodos de
evaluación. Este fenómeno se ve acompañado, sin
embargo, del mismo comportamiento ya descrito en las
hojas, en donde la caída de la concentración del AS se
hace presente después de 48 hrs [27, 28, 29, 30].
Norman et al. [21] aplicaron el AS en
concentraciones de 1.0, 0.1 y 0.01 mM en cultivos
celulares de tabaco, determinando posteriormente la
concentración citoplasmática del compuesto. Los
autores encontraron que inclusive en esta situación el
AS se encontraba en alta concentración en las células
durante un máximo de 24 horas al aplicar 1.0 mM,
mientras que para las concentraciones de 0.1 y 0.01 mM
el tiempo de permanencia del compuesto en las células
fue de solamente una hora.
La presencia del AS en concentraciones
elevadas en las hojas sujetas a estrés biótico o abiótico
se atribuye a su papel como compuesto señalizador en
la inducción de resistencia sistémica adquirida [31, 30,
20]. En ausencia de un estrés manifiesto que induzca la
síntesis de AS, y en presencia de las aplicaciones
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Determinación de la concentración de ácido salicílico en hojas de tomate (Solanum lycopersicum L.) posterior a su aplicación por aspersión

 
exógenas de AS realizadas en el presente trabajo, las que este sea el caso que se observó en la segunda
concentraciones observadas podrían ser atribuidas al aplicación de este trabajo, y que conforme se presente la
balance entre la residualidad y la transformación o saturación de la respuesta más rápidamente se
degradación del AS aplicado. Se supone que la metabolice el AS en los tejidos vegetales.
concentración celular de AS debe mantenerse dentro de
ciertos márgenes, en un nivel adecuado para mantener 9 Aplicación de acido salicílico Testigo
a
la homeostasis redox celular, de acuerdo a las 8
a1

necesidades impuestas por el entorno, en particular por

7
la irradiancia [32], así como por la interacción del AS

AS en hojas (µg g-1)

6 a
con otras actividades celulares [33]. a a
a a a a
5 b
La segunda aplicación realizada en el presente a a a
b b a a
a
trabajo mostró un resultado distinto a la primera, en el 4
b a a
a a
a
sentido de que después de alcanzar su pico de máxima 3
Evaluación
a
inicial (sin
acumulación de AS presentó una caída en su valor más 2 aplicación) y b Evaluación
y posterior
posterior
rápida en comparación a la primera. 1 aplicación de
aplicación de
AS
El rápido cambio en la cantidad detectable de 0
AS

AS, posterior al pico de concentración, parece obedecer 0 2 4 6 8 10 12 14 14.3 15 16 18 20 22

en parte a la transformación del AS en formas Días después de inicio de aplicaciones (DDIA)

conjugadas [34, 35, 24] principalmente como
glucósidos de salicílico y benzoico, o bien formas
metiladas o activadas con coenzima A [36]. Por su parte
Mustafa et al. [37] encontraron, en cultivos celulares de
Catharantus roseus, que el AS aplicado al medio y
absorbido por las células fue metabolizado a glucósido
2,5-hidroxibenzoico. Eso mismo ocurre en situación de
estrés [8] encontrándose en Arabidopsis thaliana sujeta
a estrés mecánico que el ácido O-β-D-glucosilbenzoico
se acumulaba en concentración cercana al doble de la
encontrada de AS, es decir, de 3 a 7 mM. Una vez el
AS pasa a su forma conjugada se supone que conforma
una especie de reserva que, en caso necesario, puede
retransformarse a AS [36]. Este fenómeno fue descrito
por Panina et al. [38] quienes al determinar las
concentraciones de AS y sus conjugados en discos de
papa infectados con Phytophthora infestans observaron
la trasformación de los conjugados de AS en AS libre
en un lapso de 48 horas.
¿Por qué la concentración de AS disminuyó
más rápidamente después de la segunda aplicación en
comparación con la primera? Los sistemas inducidos de
respuesta al estrés son muy sensibles a la presencia del
compuesto o compuestos inductores, pero una segunda
o tercera aplicación poco tiempo después de la primera
normalmente saturan la respuesta [39]. Pudiera pensarse
Figura 1. Dinámica de la concentración de ácido salicílico en hojas
de tomate (Solanum lycopersicum L.) como respuesta a la aplicación
exógena del mismo a 10-4 M (0.0138 g L-1). Comparación de medias
realizado entre el testigo y el tratado (aplicación de ácido salicílico)
cada dos días. Evaluación realizada cada dos días sobre la tercera
hoja joven totalmente expandida. Cada punto es promedio de dos
plantas con dos replicas cada una analizadas en cromatógrafo LC
Agilent 1120, bajo el software EZCrom. 1/medias con la misma letra
son estadísticamente iguales (Tukey, α=0.05).
Por su parte en las plantas testigo, el AS no
presentó mucha variación a excepción de la evaluación
del sexto DDIA donde presentó un cambio muy similar
al presentado por las plantas tratadas (Figura 1). De
manera natural el AS presenta variaciones en la
concentración derivadas de eventos del desarrollo como
diferentes etapas fenológicas y la floración [40],
asimismo se sabe que ocurren ajustes constantes en la
concentración de AS de acuerdo a las condiciones de
temperatura e irradiancia [32]. Por ello, el
comportamiento mostrado por las plantas testigo en
cuanto a las variaciones en la concentración foliar de
AS puede suponerse normal.
Cambio en las concentraciones de AS
Las concentraciones de AS determinadas en el
presente ensayo fluctuaron de 3.0 a 8.27 µg g-1 de peso
fresco (Figura 1), dichos valores rebasaron casi dos

 
 
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Determinación de la concentración de ácido salicílico en hojas de tomate (Solanum lycopersicum L.) posterior a su aplicación por aspersión
 
veces los observados en las plantas testigo (cuyas posterior disminución, presumiblemente para
concentraciones fluctuaron de 1.39 a 4.9 µg g-1 de peso incorporarse en especies químicas conjugadas.
fresco). Los valores máximos encontrados después de
las aplicaciones (a los 2 y 15-DDIA) se asemejan a los Crecimiento de la planta
reportados por He et al. [24] sobre hojas de frijol a las
24 hrs de provocado el estimulo con Tetranichus En cuanto al crecimiento de tallos y hojas se
urticae Koch. En ese caso la presencia del ácaro dio encontraron algunas diferencias a los 4, 12 y 15 DDIA
lugar a una concentración máxima de AS de 12 µg g-1 (Figura 2), pero al concluir el ensayo los valores fueron
de peso fresco, valor que rebasa al aquí obtenido con similares. En ausencia de estrés el efecto del ácido
aplicación exógena del AS como aspersión foliar. Con salicílico dependerá de la concentración con que se
otro modelo biológico, con la infección con virus del aplique y de la especie vegetal en donde se haga,
mosaico del tabaco (VMT), Enyedi et al. [27] encontrándose en ocasiones ausencia de efectos [44,
encontraron que las células infectadas alcanzaban de 3.5 45]. En general, el uso de AS en forma de aspersión
a 6.0 µg g-1 después de 144 horas de aplicar el AS en el foliar muestra beneficios sobre el crecimiento de la
medio de cultivo en concentración de 25 y 100 µM de partes aéreas de las plantas en situaciones en ocurre
AS. Malamy et al. [41] encontraron aumento a 3 µg g-1 algún factor causante de estrés [11, 46, 47, 16, 19, 45].
a las 60 hrs después de someter plantas de tabaco a altas 12 30
AS tallo Testigo tallo
temperaturas, mientras que Shulaev et al. [28] en tabaco a a a
AS raíz Testigo raíz Aplicación
infectado con VMT determinaron concentraciones 10
de AS a
a
a
a 25

máximas de AS equivalentes a 10 µg g-1 de peso fresco, a a

a
a
a
8 a 20
aumentando esta concentración conforme la muestra se a a b
Peso de tallo (g)

Peso de raiz (g)

a
a b b a
acercaba al sitio de infección (a 144 hrs después de a b
a
6 15
b
esta). Por otra parte, Barbaus-Larson, y Jacobsen [42] al a
a
a
a
a
aplicar 50 ppm de probenazole, un compuesto usado en 4
Aplicación
de AS a a
a
10
a
a a b
la práctica agrícola por su habilidad de inducción de a1 a a a b b
a
b a
tolerancia, en remolacha azucarera (Beta vulgaris L.) e 2
a b 5
a a
Iwai et al. [43] aplicando el mismo compuesto sobre a a
0 0
plantas de arroz, determinaron la máxima concentración 0 2 4 6 8 10 12 14 14.3 15 16 18 20 22
de AS en 3.1 y 7.3 µg g-1 de peso fresco Días después de inicio de aplicaciones (DDIA)
respectivamente. Es claro que los valores de Figura 2. Crecimiento del tallo y hojas y la raíz de plantas de tomate
concentración endógena de AS dependerán del tipo de (Solanum lycopersicum L.) en respuesta a la aspersión foliar con
ácido salicílico 10-4 M (0.0138 g L-1). Comparación de medias
ensayo aplicado y las condiciones bajo las cuales se
realizado entre el testigo y el tratado (aplicación de ácido salicílico)
lleve a cabo, manteniéndose como constante la cada dos días. Cada punto es promedio de tres plantas. 1/medias con
derivación de una parte del AS libre hacia formas la misma letra son estadísticamente iguales (Tukey, α=0.05).
conjugadas, incluso si esta respuesta se encuentra
acompañada de concentraciones muy altas de AS y Para el caso del peso de la raíz no se encontró
tiempos de respuesta tan cortos como 30 minutos [21]. diferencia significativa posterior a la primera aspersión
Inclusive en aquellos estudios que reportan con AS, sin embargo, posterior a la segunda aplicación
concentraciones de AS más bajas, como las obtenidas se observó un menor crecimiento radical en las plantas
por Park et al. [30] y Yalpani et al. [35] del orden de tratadas. La mayor parte de los autores consultados
0.35 µg g-1 de peso fresco de hojas de tabaco (Nicotiana indicaron que el efecto del AS es positivo sobre el
tabaccun L.) a las 144 hrs después de infectar las crecimiento de las raíces [11, 48, 13, 49, 16], sin
plantas con VMT, mostraron la misma dinámica embargo en algunos estudios como el de Lian et al. [44]
descrita de elevación de la concentración de AS y se encontraron efectos negativos sobre la biomasa de la

 
 
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Determinación de la concentración de ácido salicílico en hojas de tomate (Solanum lycopersicum L.) posterior a su aplicación por aspersión
 
raíz en algunas de las concentraciones de AS aplicado, contenedor. La fertilización se realizó a partir de los 12
indicando los autores como causa probable del días después de la germinación utilizando una solución
resultado una mayor derivación del presupuesto Steiner al 25%. Inicialmente se aplicaron 30 ml de
energético de la raíz a respuestas de defensa inducidas solución por cada plántula por día, transcurridos 30 días
por el AS. después de la germinación la cantidad de solución
nutritiva se elevó a 50 ml por plántula por día. Las
Conclusiones plantas crecieron bajo invernadero.

Descripción de tratamientos y aplicación

La concentración de ácido salicílico aplicado
por vía foliar mostró una dinámica de acumulación y
Se aplicaron dos tratamientos: ácido salicílico y
posterior disminución parecida a la reportada por
un testigo (agua destilada). Se utilizó ácido salicílico
inducción bajo condiciones de estrés. El efecto se hizo
grado reactivo (CTR Scientific) a una concentración de
patente en dos eventos de aspersión foliar.
10-4 M (0.0138 g L-1). La primera aplicación se realizó
El ácido salicílico aplicado como aspersión
con un aspersor manual a temprana hora del día,
foliar incrementó la concentración foliar del compuesto
aplicando lo necesario para obtener una cobertura total
a 8 µg g-1 de peso fresco en comparación con el testigo
del área foliar, realizando dicha aplicación a los 30 días
que mostró valores máximos de 5 µg g-1.
después de la germinación (08 de noviembre), una vez
De acuerdo con los resultados del estudio las
las plántulas presentaron la tercera hoja verdadera.
aplicaciones de ácido salicílico, que se lleven a cabo
Transcurridos doce días después de la primera
con propósitos de manejo agronómico en plantas de
aplicación se realizo una segunda aplicación de este
tomate, deben realizarse con un intervalo mínimo de
compuesto.
ocho días entre aplicaciones.
Bajo las condiciones probadas la aplicación de
Colecta de material vegetal para las determinaciones
ácido salicílico no reportó beneficios en forma de
mayor acumulación de biomasa.
Se tomo como órgano de evaluación la tercera
hoja desarrollada. Antes de aplicar el ácido salicílico se
Materiales y Metodos realizó la primera colecta de material foliar, para
realizar las evaluaciones y determinar la concentración
Ubicación del ensayo inicial del ácido salicílico en los tejidos foliares. Las
hojas fueron cortadas de la planta y envueltas en papel
El trabajo se llevo a cabo en las instalaciones de
aluminio etiquetado para inmediatamente ser
la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro,
sumergidas en nitrógeno líquido y ser trasladadas en ese
Buenavista, Saltillo, México.
medio a un congelador a -2.0 °C para su conservación.
Material vegetativo Después de la aplicación del ácido salicílico la anterior
operación fue repetida cada dos días durante un periodo
Se utilizaron plantas de tomate (Solanum de 22 días, tomando las hojas de dos plantas por cada
lycopersicum L.) cv. Rio Grande (Petoseed). Las tratamiento en cada muestreo. La hora de colecta fue
semillas, fueron sembradas el día 08 de octubre del entre las 8:00 y las 11:00 hrs.
2010 de forma directa en contenedores de poliestireno
de 0.32 L con sustrato (peat moss TKB y agrolita en Determinación del ácido salicílico
relación 70:30 en base volumen), depositando 3
semillas por contenedor. Transcurridos 10 días después El proceso de análisis constó de dos fases: 1)
de la germinación se conservó una sola plántula en cada Preparación de la muestra para la extracción, 2)
determinación de la concentración de ácido salicílico en

 

 

Determinación de la concentración de ácido salicílico en hojas de tomate (Solanum lycopersicum L.) posterior a su aplicación por aspersión
el extracto obtenido. Para la preparación de las muestras
de extracción se recongeló el material vegetativo
recolectado con nitrógeno liquido para posteriormente
molerlo y pesar 0.05 g colocando dicha cantidad en un
tubo ependorf de 1.5 ml, al que se le agregó 1 ml de la
solución de extracción (10% de metanol: 1% de ácido
acético: 89% agua destilada) utilizando para tal fin una
pipeta automática (Accumax PRO 100-1000 µL). Con
el objetivo de conseguir contacto de la solución de
extracción y la totalidad de la muestra, el tubo ependorf
se sometió a vibración por 20 segundos en un agitador
vortex (Scientific products S.A.), para posteriormente
desgasificarlo durante 5 minutos en un desgasificador
(Bronsom S.A.) y centrifugar durante 10 minutos a
10000 G en una centrifuga spectrofuge (Labnet
International, Inc.). Después de este proceso se recuperó
el sobrenadante traslúcido con pipeta manual, para
colocarlo en un tubo ependorf nuevo y etiquetado. A los
tubos ependorf con la muestra vegetal se les agregaron
nuevamente 0.5 ml de la solución de extracción para
repetir todo el procedimiento y nuevamente retirar el
sobrenadante traslucido y agregarlo al ependorf nuevo y
etiquetado, obteniendo así, un aproximado de 1.5 ml de
solución, la cual se hizo pasar a través de filtros tipo
pirinola de 0.45 µm (siringe-driven filter unit, marca
Millipore). Sobre el filtrado se realizó la determinación
del ácido salicílico utilizando un cromatógrafo LC
marca Agilent modelo 1120 manejado bajo el programa
computacional EZChrom Elite Compact versión 3.3.0B
(Agilent 2005-2008MR) con las siguientes condiciones:
la separación del cromatógrafo fue realizada en una
columna Phenomenex Luna C18 de 100x20 mm a 35
°C, manejando dos gradientes de solventes 100% A
(94.9% H2O: 5% CH3CN: 0.1% CHOOH) a 100% B
(5% H2O: 94.9% CH3CN: 0.1% CHOOH) por 10 min.
El solvente B se inyecto en los últimos minutos para
posteriormente inyectar nuevamente solvente A y
realizar la limpia del sistema para la posterior inyección
de una nueva solución de extracción. La inyección del
la solución de extracción constó de 20 µl. Cada muestra
de hoja fue analizada por duplicado. Los resultados
obtenidos mediante el cromatógrafo en mg L-1 de AS
fueron convertidos a µg de AS por g de peso fresco.
6
Determinación de peso de raíz y parte aérea
Se determinó el peso de raíz y peso de la parte
aérea de las plantas tomando al azar tres plantas por
tratamiento. Para el caso de la raíz se desprendió el
sustrato mediante agua corriente hasta eliminar las
partículas adheridas y se peso mediante balanza
granataria. Una vez obtenido el peso fresco, la muestra
se secó a 60 °C en una estufa desecante. Para el caso de
peso de parte aérea se realizó el conteo de forma directa
sobre balanza de tres pesas (Ohaus, 2620 g).
Diseño experimental y Análisis de datos
Se aplicó un diseño completamente al azar,
manejando como unidad experimental una planta en un
contenedor, y tomando para la determinación del ácido
salicílico 2 plantas por tratamiento por evaluación y tres
plantas para la determinación de peso de raíz y parte
aérea por tratamiento por evaluación. Cada tratamiento
consto de 80 repeticiones. Los datos obtenidos del
análisis de las muestras fueron sometidos a un análisis
de varianza, realizando una comparación de medias
mediante la prueba de Tukey (α=0.05). Se utilizó el
programa computacional SAS para Windows.
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Octubre del 2011