Epidemiología molecular

Clostridium difficile

Dra Paola Pidal

Laboratorio biomédico Nacional y de
Referencia

Clostridium difficile: Epidemiología molecular

Disciplina que resulta de la aplicación e integración de la Biología Molecular

a la investigación epidemiológica.

La caracterización de los agente es EI

indispensable para análisis epidemiológico.

En los estudios epidemiológicos de brote

Definir la relación existente entre los

aislamientos estudiados

Clon “aislamientos relacionados por el hecho Definición

de descender de un ancestro común” probabilística
 Identificación de Análisis clonal
género y especie

Clones

Clostridium difficile: Métodos de

caracterización molecular

• Método de elección depende de la pregunta

epidemiológica.
• Estudio de brote:
• Marcadores muy discriminativos.
• PFGE
• Monitorizar diseminación a nivel mundial en un largo
periodo
• Clon sufrirá cambios microevalutivos que generan
patrones relacionados pero no idénticos.
• MLST: Identificación de grupos con independencia
de pequeñas variaciones .
Clostridium difficile: Métodos de
caracterización molecular

• PFGE: Electroforesis en campo Pulsado.

• MLST: Tipificación por secuenciamiento de multilocus.
• Ribotipificación: Amplificación y secuenciamiento de genes
ribosomales.
Elementos complementarios:
– PCR y secuenciamiento de gen regulador de la producción
de toxina.
– Determinación de toxina binaria

PFGE
Extracción del ADN cromosómico bacteriano.

Corte del ADN, utilizando enzimas de restricción de corte poco

frecuente. Reconocen sitios específicos en el cromosoma
generando largos fragmentos de ADN (10kb a 10Mb)

Separación de los fragmentos obtenidos según su tamaño.

 Pulsed field gel electrophoresis [PFGE]
Preparación de gel de agarosa y siembra de
plugs La aplicación de un complejo sistema de
pulsos eléctricos alternantes, en diversos
ángulos, permite separar en el gel de
agarosa estos grandes fragmentos de
DNA.
Preparación gel agarosa 1%

Pulsed field gel electrophoresis [PFGE]

Estandarización

S.Braenderup S.Braenderup S.Braenderup S.Braenderup

Gel de agarosa 1%
Generando un patrón de bandas llamado
huella digital bacteriana o fingerprinting
 Criterios de Tenover para la interpretación de
perfiles de PFGE

Categoría Nº bandas Nº eventos Interpretación

diferentes genéticos epidemiológica
Indistinguible 0 0 Aislamiento es
parte del brote
Muy relacionado 2\3 1 Aislamiento
probablemente es
parte del brote
Posiblemente 4\6 2 Aislamiento
relacionado posiblemente es
parte del brote
Diferente >=7 >=3 Aislamiento no es
parte del brote

Dr. J. C. Hormazábal, Bacteriología, ISP.

Tipificación por secuenciamiento de multilocus : MLST

Amplificación de 7 genes
housekeeping

Purificación de producto PCR

 Multi-Locus Sequence Typing [MLST]

Lectura nucleotídica

• Secuenciador Abi 3130

http://pubmlst.org/clostridium/
 MLST
Clonal complex [CC]

Ribotipificación
• Amplificación de región intergénica del RNAr. Secuencias
altamente conservadas.

• Electroforesis tradicional o capilar ( mayor resolución)

• Análisis bioinformático del patrón obtenido en base de datos

internacional. Nomenclatura establecida.

• Entrega en con probabilidades la similitud con respeto a

cepas incorporadas.
Clostridium difficile
• Bacilo G(+), anaerobio estricto, esporulado.

Toxina A (principalmente enterotoxina) y Toxina B

(citotoxina)

Toxina binaria formada por 2 subunidades

Toxina binaria no se conoce claramente su
rol en la patogénesis
Codifica Regulador (+) Codifica Regulador (-)

Codifica Toxina B Codifica Toxina A

Deleción en gen tcdC

Presenta toxina binaria CDT, cepas normales sólo
4%
Resistencia a ciertas fluoroquinolonas (hasta un
100%)
Levofloxacin
Gatifloxacin
Moxifloxacin
 Plos One August 2012

Rol del gen tcdC y Toxina binaria como factores de

virulencia de C. difficile

No aclarado
Estados Unidos
2000-2003
Afectó a 6 estados: Georgia, Illinois, Maine, New Jersey, Oregon y
Pennsylvania
187 aislados
Caracterización Molecular:
PFGE y REA
PCR para Toxina binaria
Deleción en tcdC

100%
Clostridium difficile

•Canadá (2003-2005)
Afectó a diferentes hospitales en la Región de Québec
22,5 casos/mil admisiones hospitalarias.

•Reino Unido (2002-2006)

•Otros países: Bélgica, Irlanda, Francia, Finlandia, Polonia, Alemania, Australia,

Hong Kong, Costa Rica.
88 Hospitales Quebec 10-8%
478 aislados

NAP1
57%
Clostridium difficile
Sistema de Vigilancia

• Vigilancia ante el
aumento de casos
notificados.

• Estudio de Toxina
positivo.

• Envío de muestras
o cepas al ISP.
Instituto de Salud Pública de Chile
Caracterización molecular de
aislamientos Clostridium difficile

•Tipificación genética por Electroforesis de Campo Pulsado

(PFGE) según:
Protocolo estandarizado ISP con asistencia técnica del Instituto
Nacional de Salud de Québec, Canadá
•Tipificación por secuenciación de multilocus MLST
•Ribotipificación
Complementariamente
•Estudio de deleción gen regulador tcdC por PCR y
secuenciación

Clostridium difficile
Cepas y muestras según procedencia

Año Cepas Muestras Total

2011 5 87 92
2012 19 857 876
Total 24 944 968
Clostridium difficile
Cepas y muestras según procedencia
Presencia Clostridium difficile, Chile 2012.
2012

42%

66 % recuperación
Fuente: Laboratorio de Agentes Emergentes y Zoonosis
Instituto de Salud Pública de Chile

Fuente: Laboratorio de Agentes Emergentes y Zoonosis

Instituto de Salud Pública de Chile

Clostridium difficile
Cepas y muestras según fecha de recepción
 Clostridium difficile
Cepas y muestras según edad del paciente

Caracterización Genética

Clostridium difficile
Herramientas Epi-Mol
Tipificación Genética.

MLST RIBOTIP. PFGE

Tiempo evolutivo medido en cambios.

MLST: Gold Standard para relaciones evolutivas
PFGE: Gold Standard para análisis de brotes
 Instituto de Salud Pública de Chile
Tipificación Molecular C. difficille, Abril de 2012

Electroforesis de Campo Pulsado PFGE

Hallazgos Iniciales
¿Fenómeno Local?
¿Fenómeno Global?

Clones Circulantes Chilenos

Comparación Bases Genética INSPQ-Quebec – ISP Chile

001 CHILE
NAP1

Clon no identificado en base de datos PFGE del INSPQ-Québec

Tres bandas de diferencia, correspondería a variante chilena de NAP-1 ??

MLST Tipificación por Secuenciación de Multilocus

Amplificación y Secuenciación de fragmentos internos de 7 genes altamente

conservados

Fragmentos

Secuenciar MLST
C. difficile
Perfil Alélico DataBase
ST

Secuenciación de multilocus (MLST) revela ST1, perteneciente a

complejo clonal relacionado a cepas NAP-1

Resultados de Caracterización molecular por PFGE y Ribotipificación en

cepas de Clostridium difficile. Instituto de Salud Pública. Chile. 2012.

Tipo de Perfil PFGE Nº cepas Nº aislados

Estudiadas Ribotipo 027
1 Ribotipo
Clon 001 14 13
413 altamente
relacionado
Otros Clones “no 001” 10 0

TOTAL cepas estudiadas 24

Variante chilena de
NAP-1
 Tipo de Perfil Nº cepas %

001 354 74 Clon

Variante NAP1 predominante

003 18 3.7

009 12 2.5

otros 94 19.6

TOTAL cepas estudiadas 478 100

Perfil por PFGE Nº cepas Nº cepas % cepas

Estudiadas con deleción con deleción

001 354 354 100

003 18 0 0
009 12 0 0
Otros perfiles* 94 17 18
TOTAL cepas estudiadas 478 371 77
*5 cepas no se logra amplificar en TcdC.
 Perfil por PFGE Nº cepas Nº cepas % cepas
Estudiadas con deleción 117 con deleción
001 354 354 100
003 18 0 0
009 12 0 0
Otros perfiles* 94 6 6%
TOTAL cepas 478 357 75
estudiadas

*5 cepas no se logra amplificar en TcdC.

Nº cepas con
Nº cepas
desarrollo CL-CDF-SMA-001
estudiadas
Clostridium
PFGE
REGION difficile Nº %
ANTOFAGASTA 52 40 36 90
ARAUCANIA 12 12 1
ATACAMA 4 4 4
BIOBIO 3 2 0
COQUIMBO 13 11 10
MAULE 68 52 40 77
METROPOLITANA 263 206 137 67
O´HIGGINS 46 45 35 78
VALPARAISO 114 106 91 86
Total 575 478 354 74
 Sma Sma

100
Tipo Genético Deleción Casos Clínicos 2012 Linaje Hipervirulencia

60

80
Cl-Cdf-Sma-009 WT 12
Cl-Cdf-Sma-010 WT 10
Cl-Cdf-Sma-006 WT 2
Cl-Cdf-Sma-017 WT 1

Clostridium difficile Cl-Cdf-Sma-025

Cl-Cdf-Sma-014
WT
WT
2
8

Subtipificación por
Cl-Cdf-Sma-047 WT 1
Cl-Cdf-Sma-057 WT 3
Cl-Cdf-Sma-018 WT 2

PFGE. Cl-Cdf-Sma-040
Cl-Cdf-Sma-032
WT
WT
3
1

Clones Circulantes Cl-Cdf-Sma-034

Cl-Cdf-Sma-052
del18pb/stop codon 62 . 1
WT 1
Cl-Cdf-Sma-048 WT 1

en Chile Cl-Cdf-Sma-024
Cl-Cdf-Sma-011
del39pb/stop codon 184. 2
WT 1
Cl-Cdf-Sma-008 del18pb/del117 2
Cl-Cdf-Sma-042 del18pb/del117 2 Relacionado con
Cl-Cdf-Sma-001
Cl-Cdf-Sma-053
del18pb/del117
WT
368
1
I cepa NAP1/027
Cl-Cdf-Sma-046 del18pb/del117 2
Cl-Cdf-Sma-038 del18pb/del117 1
Cl-Cdf-Sma-049 WT 1
Cl-Cdf-Sma-036 del18pb/del117 2
Cl-Cdf-Sma-058 stop codon 64 aa 1
Cl-Cdf-Sma-003 WT 18
Cl-Cdf-Sma-028 WT 2
Cl-Cdf-Sma-012 WT 1
Cl-Cdf-Sma-026 WT 3
Cl-Cdf-Sma-015 WT 1
Cl-Cdf-Sma-027 WT 2
Cl-Cdf-Sma-051 WT 1
Cl-Cdf-Sma-020 WT 4
Cl-Cdf-Sma-043 WT 1
Cl-Cdf-Sma-029 WT 2
Cl-Cdf-Sma-002 WT 2
Cl-Cdf-Sma-055 del18pb/- 1
Cl-Cdf-Sma-035 del36pb/stop codon 64 . 1
Cl-Cdf-Sma-044 WT 1
Cl-Cdf-Sma-045
Cl-Cdf-Sma-021
WT
del54pb/del117
1
3
Se han identificado
Cl-Cdf-Sma-023 del18pb/W T 2 47subtipos genéticos
Cl-Cdf-Sma-039 WT 2
distintos
Cl-Cdf-Sma-022 WT 1
Cl-Cdf-Sma-031 WT 1
Cl-Cdf-Sma-004 WT 2
Cl-Cdf-Sma-037 WT 1
Cl-Cdf-Sma-007 WT 8

Análisis filogenético de C. difficile en Base de Datos Global MLST

ST2 (CLCDFSMA002)
ST13
ST26
ST12
ST56
ST59
ST9 (CLCDFSMA011)
ST15
ST6
ST36
ST7
ST4
ST53
ST14
ST17
GROUP 1/HA1
ST33
ST3 (CLCDFSMA003)
ST42
ST18
ST8
ST16
ST31
ST51
ST149 (CLCDFSMA012)
ST10
ST35 (CLCDFSMA007)
ST19
ST20
ST54 (CLCDFSMA014;010;006;014)
ST34
ST69
ST114 (CLCDFSMA016)
ST41 (CLCDFSMA026) GROUP 2/Hyoervirulent

ST67
ST1 (CLCDFSMA001)
ST122 (CLCDFSMA023)
ST5 (CLCDFSMA021)
GROUP 3/HA2
ST22
ST38
GROUP 4/ A-B+ clade
ST37
ST39
Outlier
ST11 (CLCDFSMA026)

0.002
 Subtipo 003

Subtipo 001
Variante NAP-1
Ribotipo 027
MLST ST1

Subtipo 009

Clostridium difficile: estudio genoma completo

Secuenciamiento genoma completo NAP1/027 1985-
2010 . 151 cepas

Dos Linajes con mutación confiere resistencia a

Fluoroquinolonas : FQR 1 / FQR2 no descritos
anteriormente

Análisis probabilístico:
FQR1 emerge en USA
FQR1 emerge USA (59% Prob) Canadá
(33% prob) Ventaja selectiva ??
Clostridium difficile: Conclusiones

• Problema a nivel mundial.

• Requiere de vigilancia coordinada.
• En el estudio genético de los aislamientos de C. difficile han
integrado herramientas de epidemiología molecular:
PFGE
MLST
Genoma Completo
• Predomina el clon 001, demostrándose que corresponde a una
variante del clon internacional NAP-1.
• Los hallazgos en la caracterización insertan a Chile dentro del
fenómeno de expansión global que desafortunadamente ha
desarrollado el C. difficile a través del clon norteamericano NAP-1 y
sus variantes.

Gracias