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ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

INGENIERIA GENETICA

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION INGENIERIA GENETICA

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

En 1968 se purificó la primera endonucleasa de restricción,

la K12 en E coli.

Cortaba fragmentos largos y concretos, por lo que se pensó que reconocía secuencias específicas del DNA.

Se abandonó porque aunque reconocía una zona determinada del DNA, cortaba al DNA a varias Kb de distancia.

En 1970 se aisla otra endonucleasa de restricción en

Haemophilus influenzae, que reconoce y una secuencia en un

duplex de DNA y la rompe en ese lugar produciendo

fragmentos discretos de longitud y secuencia bien definidos.

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

Fenómeno de restricción: reconocimiento por parte de una bacteria de un DNA extraño y lisis del mismo en pequeños

fragmentos.

El fenómeno de restricción se descubrió en E coli, cuando

se hizo crecer el bacteriófago lambda. Si la bacteria crece

encontraremos varias colonias por placa. Si no crece, no

encontaremos colonias.

En la cepa C de E coli crecía bien el bacteriófago

En la cepa C de E coli crecía bien el bacteriófago , pero si este se

, pero

si este se crecía en la cepa K o la R, la eficiencia de

crecimiento era mucho menor o nula. El fago era restringido

por esta cepa.

MODIFICACION- RESTRICCION

TÍpico ejemplo de

restricción de crecimiento

del bacteriófago lamda

en una cepa determinada

de E. coli

La eficiencia con la que el fago

crece en una cepa depende de la última cepa donde fue propagado.

de E. coli La eficiencia con la que el fago crece en una cepa depende de

MODIFICACION- RESTRICCION

Explicación:

El DNA del fago es degradado en cuanto se incorpora, y a la endonucleasa responsable de esta degradación se le llama

endonucleasa de restricción o enzima de restricción.

El huésped restrictivo debe proteger a su propio DNA de la

acción de las enzimas de restricción y para ello modifica

a su propio DNA.

Modificación: metilación de ciertas bases en un número muy

limitado, justo en los lugares de reconocimiento de las enzimas de restricción.

El DNA del fago que sobrevive algún ciclo en el huésped restrictivo

se replica y también es metilado por las metilasas de la bacteria, y

por lo tanto modificado y protegido, y puede crecer bien en una nueva

reinfección.

METILACION Y RESTRICCION

METILACION Y RESTRICCION
METILACION Y RESTRICCION

SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION

Se conocen cuatro tipos de sistemas de restricción y

modificación:

Tipo I:

En la misma enzima tienen 2 subunidades para

la restricción, 2 subunidades para la modificación (metii

lación) y una subunidad para el reconocimiento.

Tanto la metilación como el corte requieren de ATP.

El corte se da a alguna distancia del lugar de

reconocimiento.

Poco valor para manipulación genética.

SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION

Tipo II:

La restricción (división) y modificación las provocan diferentes

enzimas de la bacteria, por lo que puede haber división del

DNA en ausencia de modificación.

No requieren de cofactores como ATP o S-adenosilmetionina

por lo que su uso es más sencillo.

El lugar de reconocimiento generalmente es simétrico y cortan

al DNA en el lugar de reconocimiento.

SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION

SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION

SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION

Tipo IIs:

Son parecidos a los del tipo II, pero la restricción ocurre en

Lugares del DNA alejados del lugar de reconocimiento, por

Lo que su uso en ingeniería genética también es reducido.

Tipo III:

Tienen lugares de reconocimiento simétricos, pero se

parecen en lo demás a los sistemas del tipo I, por lo que

son poco útiles.

Algunas enzimas de restricción no entra dentro de

esta clasificación.

SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION

Nomenclatura:

Tres letras:

1a letra de género de la bacteria donde se encontró

2a y 3a letras especie de la bacteria donde se encontró

Letra de la cepa donde se produce la enzima de restricción (si es alguna cepa especial)

Si en la misma bacteria hay varios sistemas de restricción, se especifica

por números romanos.

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

Ejemplos:

HindII

Haemophilus influenzae, cepa d, 2 a enzima de restricción

HindIII

Haemophilus influenzae, cepa d, 3 a enzima de restricción

SmaI

Serratia marcescens, 1a enzima de restricción

BamHI

Bacilus amyloliquefaciens, cepa H, 1a enzima

Los nombres de las enzimas de restricción se escribe en itálica.

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

Endonucleasas de tipo II

Reconocen y cortan secuencias de entre 4 y 8 nucleótidos, que tienen un eje rotacional de simetría: Secuencias palíndrome

Se marca con /: lugar donde actua la endonucleasa de

restricción

Se marca con *: lugar donde se metilan las bases por

modificación

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION Plegado típico Tipo II CAP “Motif” (topoisomerasas)

Plegado típico Tipo II

CAP “Motif”

(topoisomerasas)

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

Para EcoRI:

5 ´- GAATTC- 3 ´

3 ´- CTTAAG-5 ´

5 ´- G/AA*TTC- 3 ´ 3 ´- CTT A*A/G-5

Generalmente solo se escribe la secuencia desde el 5 ´

G/AATTC

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

Cuando la enzima de restricción actua deja dos extremos

5 ´que son complementarios entre sí:

5 ´- G

3 ´- CTTAA - 5

5 ´- AATTC - 3 ´

G - 5 ´

A estos extremos creados por las endonucleasas tipo II

se les denomina extremos coheisvos o pegajosos.

No todas las enzimas de restricción tipo II dejan así los

extremos.

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION Extremos cohesivos Extremos romos

Extremos cohesivos

Extremos romos

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION Para reconocer el tamaño de los fragmentos que se producen tras la

ENDONUCLEASAS DE

RESTRICCION

Para reconocer el tamaño de los fragmentos que se

producen tras la acción de una endonucleasa de restricción

se utiliza la electroforesis

en gel de agarosa y la

tinción con bromurod de

etidio.

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION Se han estudiado 10,000 bacterias para Encontrar enzimas de restricción. Se han encontrado

Se han estudiado 10,000 bacterias para

Encontrar enzimas de restricción.

Se han encontrado 3,000 enzimas de

Restricción específicas para aproximada

mente 200 secuencias de DNA.

Las enzimas diferentes que tienen

especificidad por la misma secuencia

de DNA y que cortan en el mismo sitio

se les llama isoschizomeros.

Si reconocen la misma secuencia pero cortan en diferente lugar

al DNA se les denomina neoeschizomeros.

www.rebase.neb.com

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

El número y el tamaño de fragmentos de DNA generados por

una enzima de restricción depende de la frecuencia de aparición

De los lugares diana en el DNA.

Teóricamente, si tenemos un DNA que sea:

- 50% de frecuencia de C+G

- las cuatro bases distribuidas al azar

El número de cortes en sería cada:

si la secuencia diana es de 4 bases corte cada 4 4 (256) bases si la secuencia diana es de 6 bases corte cada 4 6 (4096) bases

En la práctica, no ocurre exactamente así.

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

Revisa las siguientes ligas (material de estudio):

“Restriction Endonucleases Overview”

Restriction Enzymes Quality Controls