Enzimas de Restricción

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
INGENIERIA GENETICA
En 1968 se purificó la primera endonucleasa de restricción,

la K12 en E coli.
Cortaba fragmentos largos y concretos, por lo que se

pensó que reconocía secuencias específicas del DNA.
Se abandonó porque aunque reconocía una zona

determinada del DNA, cortaba al DNA a varias Kb de distancia.
En 1970 se aisla otra endonucleasa de restricción en

Haemophilus influenzae, que reconoce y una secuencia en un
duplex de DNA y la rompe en ese lugar produciendo
fragmentos discretos de longitud y secuencia bien definidos.
Fenómeno de restricción: reconocimiento por parte de una
bacteria de un DNA extraño y lisis del mismo en pequeños
fragmentos.
El fenómeno de restricción se descubrió en E coli, cuando

se hizo crecer el bacteriófago lambda. Si la bacteria crece
encontraremos varias colonias por placa. Si no crece, no
encontaremos colonias.
En la cepa C de E coli crecía bien el bacteriófago , pero

si este se crecía en la cepa K o la R, la eficiencia de
crecimiento era mucho menor o nula. El fago era restringido
por esta cepa.
MODIFICACION- RESTRICCION
TÍpico ejemplo de
restricción de crecimiento
del bacteriófago lamda
en una cepa determinada
de E. coli
La eficiencia con la que el fago

crece en una cepa depende de la
última cepa donde fue propagado.
MODIFICACION- RESTRICCION
Explicación:
El DNA del fago es degradado en cuanto se incorpora, y a la

endonucleasa responsable de esta degradación se le llama
endonucleasa de restricción o enzima de restricción.
El huésped restrictivo debe proteger a su propio DNA de la

acción de las enzimas de restricción y para ello modifica
a su propio DNA.
Modificación: metilación de ciertas bases en un número muy

limitado, justo en los lugares de reconocimiento de las
enzimas de restricción.
El DNA del fago que sobrevive algún ciclo en el huésped restrictivo

se replica y también es metilado por las metilasas de la bacteria, y
por lo tanto modificado y protegido, y puede crecer bien en una nueva
reinfección.
METILACION Y RESTRICCION
SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION
Se conocen cuatro tipos de sistemas de restricción y
modificación:
Tipo I:
En la misma enzima tienen 2 subunidades para

la restricción, 2 subunidades para la modificación (metii
lación) y una subunidad para el reconocimiento.
Tanto la metilación como el corte requieren de ATP.
El corte se da a alguna distancia del lugar de

reconocimiento.
Poco valor para manipulación genética.

Tipo II:
La restricción (división) y modificación las provocan diferentes

enzimas de la bacteria, por lo que puede haber división del
DNA en ausencia de modificación.
No requieren de cofactores como ATP o S-adenosilmetionina

por lo que su uso es más sencillo.
El lugar de reconocimiento generalmente es simétrico y cortan

al DNA en el lugar de reconocimiento.
Tipo IIs:
Son parecidos a los del tipo II, pero la restricción ocurre en

Lugares del DNA alejados del lugar de reconocimiento, por
Lo que su uso en ingeniería genética también es reducido.
Tipo III:
Tienen lugares de reconocimiento simétricos, pero se

parecen en lo demás a los sistemas del tipo I, por lo que
son poco útiles.
Algunas enzimas de restricción no entra dentro de

esta clasificación.
Nomenclatura:
Tres letras: 1a letra de género de la bacteria donde se encontró
2a y 3a letras especie de la bacteria donde se encontró
Letra de la cepa donde se produce la enzima de restricción (si es alguna

cepa especial)
Si en la misma bacteria hay varios sistemas de restricción, se especifica

por números romanos.
Ejemplos:
HindII Haemophilus influenzae, cepa d, 2 a enzima de restricción
HindIII Haemophilus influenzae, cepa d, 3 a enzima de restricción
SmaI Serratia marcescens, 1a enzima de restricción
BamHI Bacilus amyloliquefaciens, cepa H, 1a enzima
Los nombres de las enzimas de restricción se escribe en itálica.

Endonucleasas de tipo II
Reconocen y cortan secuencias de entre 4 y 8 nucleótidos,

que tienen un eje rotacional de simetría: Secuencias palíndrome
Se marca con /: lugar donde actua la endonucleasa de

restricción
Se marca con *: lugar donde se metilan las bases por

modificación
Plegado típico Tipo II
CAP “Motif”
(topoisomerasas)
Para EcoRI:
5´- GAATTC- 3´
3´- CTTAAG-5´
5´- G/AA*TTC- 3´
3´- CTT A*A/G-5
Generalmente solo se escribe la secuencia desde el 5´
G/AATTC
Cuando la enzima de restricción actua deja dos extremos

5´que son complementarios entre sí:
5´- G 5´- AATTC - 3´
3´- CTTAA - 5 G - 5´
A estos extremos creados por las endonucleasas tipo II

se les denomina extremos coheisvos o pegajosos.
No todas las enzimas de restricción tipo II dejan así los

extremos.
Extremos cohesivos Extremos romos

ENDONUCLEASAS DE
RESTRICCION
Para reconocer el tamaño de

los fragmentos que se
producen tras la acción de una
endonucleasa de restricción
se utiliza la electroforesis
en gel de agarosa y la
tinción con bromurod de
etidio.
Se han estudiado 10,000 bacterias para

Encontrar enzimas de restricción.
Se han encontrado 3,000 enzimas de

Restricción específicas para aproximada
mente 200 secuencias de DNA.
Las enzimas diferentes que tienen

especificidad por la misma secuencia
de DNA y que cortan en el mismo sitio
se les llama isoschizomeros.
Si reconocen la misma secuencia pero cortan en diferente lugar

al DNA se les denomina neoeschizomeros.
www.rebase.neb.com
El número y el tamaño de fragmentos de DNA generados por
una enzima de restricción depende de la frecuencia de aparición
De los lugares diana en el DNA.
Teóricamente, si tenemos un DNA que sea:
- 50% de frecuencia de C+G

- las cuatro bases distribuidas al azar
El número de cortes en sería cada:
si la secuencia diana es de 4 bases corte cada 44(256) bases

si la secuencia diana es de 6 bases corte cada 46 (4096) bases
En la práctica, no ocurre exactamente así.

Revisa las siguientes ligas (material de estudio):
“Restriction Endonucleases Overview”

http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/overview.asp
Restriction Enzymes Quality Controls

http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/quality_controls.asp

Enzimas de Restricción

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ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

En 1968 se purificó la primera endonucleasa de restricción,

Cortaba fragmentos largos y concretos, por lo que se

Se abandonó porque aunque reconocía una zona

En 1970 se aisla otra endonucleasa de restricción en

El fenómeno de restricción se descubrió en E coli, cuando

En la cepa C de E coli crecía bien el bacteriófago , pero

La eficiencia con la que el fago

El DNA del fago es degradado en cuanto se incorpora, y a la

El huésped restrictivo debe proteger a su propio DNA de la

Modificación: metilación de ciertas bases en un número muy

El DNA del fago que sobrevive algún ciclo en el huésped restrictivo

En la misma enzima tienen 2 subunidades para

Tanto la metilación como el corte requieren de ATP.

El corte se da a alguna distancia del lugar de

Poco valor para manipulación genética.

La restricción (división) y modificación las provocan diferentes

No requieren de cofactores como ATP o S-adenosilmetionina

El lugar de reconocimiento generalmente es simétrico y cortan

Son parecidos a los del tipo II, pero la restricción ocurre en

Tienen lugares de reconocimiento simétricos, pero se

Algunas enzimas de restricción no entra dentro de

Tres letras: 1a letra de género de la bacteria donde se encontró

2a y 3a letras especie de la bacteria donde se encontró

Letra de la cepa donde se produce la enzima de restricción (si es alguna

Si en la misma bacteria hay varios sistemas de restricción, se especifica

HindII Haemophilus influenzae, cepa d, 2 a enzima de restricción

HindIII Haemophilus influenzae, cepa d, 3 a enzima de restricción

SmaI Serratia marcescens, 1a enzima de restricción

BamHI Bacilus amyloliquefaciens, cepa H, 1a enzima

Los nombres de las enzimas de restricción se escribe en itálica.

Reconocen y cortan secuencias de entre 4 y 8 nucleótidos,

Se marca con /: lugar donde actua la endonucleasa de

Se marca con *: lugar donde se metilan las bases por

Plegado típico Tipo II

Generalmente solo se escribe la secuencia desde el 5´

Cuando la enzima de restricción actua deja dos extremos

5´- G 5´- AATTC - 3´

A estos extremos creados por las endonucleasas tipo II

No todas las enzimas de restricción tipo II dejan así los

Extremos cohesivos Extremos romos

Para reconocer el tamaño de

Se han estudiado 10,000 bacterias para

Se han encontrado 3,000 enzimas de

Las enzimas diferentes que tienen

Si reconocen la misma secuencia pero cortan en diferente lugar

Teóricamente, si tenemos un DNA que sea:

- 50% de frecuencia de C+G

El número de cortes en sería cada:

si la secuencia diana es de 4 bases corte cada 44(256) bases

En la práctica, no ocurre exactamente así.

“Restriction Endonucleases Overview”

Restriction Enzymes Quality Controls

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