Práctica N° 5

Coloración Gram y Ziehl Neelsen

1. Introducción

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan

difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta
de contraste entre la célula y el medio que la rodea. Para aumentar el
contraste de los microorganismos y lograr una mejor observación de los
mismos, se emplean diferentes técnicas de tinción, las cuales se basan en la
capacidad de los microorganismos para retener (o no) ciertos colorantes lo
que depende de la carga de la célula y del colorante. Las tinciones
diferenciales de Gram y de Ziehl Neelsen se basan en la composición y
estructura de la pared celular de las bacterias, que determina que unas
bacterias retengan el primer colorante, en tanto que otras lo pierdan, lo
que les permite reaccionar con el colorante de contraste y visualizarlo
claramente al microscopio.
2. Desarrollo experimental

a. Tinción Gram

 Se colocó 1 gota de agua en el centro de un portaobjeto. Seguido, con el asa de

siembra, se extrajo una pequeña cantidad de cultivo bacteriano y se le homogenizó
sobre la gota de agua en el portaobjeto.

 Una vez fijada la muestra al calor, se le cubrió con cristal-violeta, dejando que esta
accionara durante 4 minutos y se procedió a lavar con abundante agua.

 Se cubrió con lugol durante 2 minutos y 30 segundos y se lavó con abundante

agua.
 Se removió el complejo azul-violeta-yoduro con alcohol-acetona durante 45
segundos y se lavó con abundante agua.
 Finalmente, se cubrió el preparado con fucsina durante 4 minutos, se lavó con
abundante agua, se dejó secar para luego visualizarlo, con aceite de inmersión, al
microscopio.

b. Coloración Ziehl-Neelsen

 Se extrajo una muestra de esputo de un compañero y se le extendió sobre una

lámina portaobjeto.
 Se secó la muestra al calor (fijación) y se le cubrió con fucsina fenicada.
 Se calentó la lámina con el mechero hasta la emisión de vapores, evitando que el
colorante no hierva, durante 5 minutos y se procedió a lavar con abundante agua.
 Se decoloró la muestra con alcohol ácido durante 2 minutos y lavar con agua.
 Finalmente, se tiñó con azul de metileno como colorante de contraste, durante 2
minutos, se lavó con agua, se dejó secar y se procedió a observarlo, con aceite de
inmersión, al microscopio.
 3. Resultados y discusión de resultados
a. Tinción Gram

Figura N° 1: Salmonella. Bacterias gran positivas de púrpura y bacterias gram negativas, de

fucsia.

 Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes

celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas. La clave es el
peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular
bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las
Gram negativas.
 La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de
peptidoglicano. Por el lado contrario, la capa de peptidoglicanos de las Gram
negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática
exterior. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a
estas diferencias constitutivas de su pared.
 La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la
membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como
por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano que posee es
demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo
que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la
coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una
pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son
susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando
los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal
violeta/yodo, y manteniendo la coloración.
b. Coloración Ziehl-Neelsen

Figura N° 2: BAAR, proporcionada por el profesor. Prueba positiva.

Figura N° 3: Muestra de Micobacterium tuberculosis proporcionada por el profesor.

Prueba positiva. Se ven algunos Micobacterium.

Figura N° 4: Muestra de esputo proporcionada por un compañero. Prueba negativa. Solo
hay existencia de células epiteliales.

 Esta tinción demuestra la capacidad de bacterias teñidas de resistir a la

decoloración por ácidos y alcoholes. Esto se correlaciona con su alto contenido en
lípidos de su pared celular y presencia de ácidos micólicos que aumentan el
carácter hidrófobo.
 Los Bacilos Alcohol Ácido Resistente (BAAR) tras la unión de la fucsina, resisten el
tratamiento orgánico y se verán teñidas de rosado o fuscia. El resto de las bacterias
se decolorarán y se contrastarán con azul de metileno.

4. Conclusiones
 La tinción Gram es una prueba potente y rápida que nos permite diferenciar dos
clases de bacterias estas son: Bacterias grampositivas y las gramnegativas.
 Las bacterias ácido-alcohol resistentes no pueden ser clasificados según la tinción
de Gram.
 El proceso de decoloración en la tinción Ziehl Neelsen es muy energético.
Cualquier bacteria que no contenga abundantes lípidos como Micobacterium o
Nocardia, perderá fácilmente el colorante primario.
 La tinción de Ziehl-Neelsen es una coloración diferencial útil en la identificación de
micobacterias, aunque no permite la diferenciación de distintas especies. Las
características de ácidoresistencia de estos microorganismos hace de esta
 coloración un método rápido en el diagnóstico presuntivo de infección
micobacteriana.

5. Cuestionario

a) ¿Qué factores influyen en una correcta tinción Gram?

Los principales factores son:

 Pureza del colorante.- a mayor grado de impurezas mayor error y menor calidad de tinción.
 Concentración del colorante.- a mayor concentración mayor error en la tinción; igual que a menor
concentración.
 El pH del colorante.- este es un factor fundamental ya que depende de las estructuras que se
desee observar para elegir el pH adecuado.
 Conservación del colorante.- se debe conservarse en lugares frescos, secos, y oscuros ;
envasados y etiquetados.
 Técnica Empleada.- se deberá seguir rigurosamente paso a paso cada técnica de tinción.
 Temperatura.- en la mayoría de los casos se utiliza la temperatura ambiental pero si existe
algunas técnicas que requieran de temperatura adecuada.
 Cantidad de la muestra.- deberá ser representativa y homogénea pero no muy grande.
 Realizar correctamente el frotis.- se debe fijarse bien para que cuando se les añada los
colorantes mordientes y decolorantes no arrastren a los microorganismos que se desee observar.
 Soluciones mordientes.- en ciertos casos son necesarios ya que actúan como fijadores y ayudan
a la fijación del colorante a las correspondientes estructuras.
 Tiempos de Tinción.- es necesario que todas las sustancias se mantengan en la preparación un
tiempo preciso y variable según la tinción.

b) ¿Qué funciones tiene el lugol y el alcohol acetona en la tinción Gram?

 La función del yodo- lugol es actuar como un mordiente, que sirve para fijar los
colorantes en un proceso de tinción. El yodo realiza esta función mediante la unión a
cristal violeta y la creación de un complejo insoluble que se adhiere mucho mejor a la
capa de peptidoglicano de espesor presentes en las Gram (+).
 El alcohol-acetona se emplea como agente de blanqueo. El alcohol disuelve lípidos
presentes en la membrana celular externa de las bacterias Gram-negativas. En este
punto del proceso de tinción Gram, los organismos Gram-negativos son incoloros
mientras que las bacterias Gram-positivas todavía retienen el cristal violeta.
 c) ¿Para qué se utiliza el aceite de inmersión?

En general el aceite de inmersión sirve para aumentar la resolución de un microscopio

mediante la inmersión de la lente objetivo y el espécimen en un aceite transparente de
alto índice de refracción.

6. Bibliografía
 Prácticas de Microbiología. Departamento de Microbiología y Genética - Universidad de
Salamanca. Fecha de consulta: 24/09/17.
 Bailey & Scott, Diagnóstico microbiológico, 11ª edición, Editoria lPanamericana, Buenos
Aires – Argentina, 2 004. Fecha de consulta: 24/09/17.