Practica N° 10

Métodos de cultivo y estudio morfológico de hongos:

Aislamiento y microcultivo
1. Introducción

Los hongos son organismos eucariotas heterótrofos que se destacan por su multiplicidad de
hábitos de vida, así como por la variedad de ambientes y condiciones en que se pueden
desarrollar, debido a su diversidad metabólica. Se pueden clasificar, de acuerdo a su morfología,
en dos grupos principales: los hongos filamentosos, como los mohos y las setas, y las levaduras,
que son unicelulares y han sido aprovechadas para la producción de múltiples compuestos de
importancia industrial y biotecnológica.

Debido a su mecanismo de toma de nutrientes, que se lleva a cabo por absorción, los hongos
producen un amplio arsenal de enzimas que, al ser secretadas, les permiten descomponer
polímeros en moléculas más simples. Esta característica les ha conferido en gran medida la
habilidad de comportarse como parásitos, simbiontes o saprótrofos. Entre las enzimas que
producen, se incluyen las proteasas, amilasas, xylanasas, pectinasas y glucosa isomerasas que son
empleadas en la industria alimentaria, principalmente para el mejoramiento de sabores, texturas,
aromas y propiedades nutricionales. Adicionalmente, las peroxidasas, monooxidasas, lacasas y
oxidasas son utilizadas en procesos de descontaminación. Otras como las alfa-galactosidasas,
glutatión transferasas, lactasas y oxigenasas son aprovechadas en la industria farmacéutica, y las
lipasas son de gran provecho para la industria de manufactura de productos como papel, cuero y
detergentes.

Algunas levaduras tienen la capacidad de fermentar azúcares en condiciones anóxicas, lo que hace
posible la producción de alcohol etílico. Esta propiedad ha sido aprovechada desde la antigüedad
para la fabricación de productos como el pan, la cerveza, el queso y el vino. Actualmente, esta
característica de las levaduras se utiliza, además, para la generación de biocombustibles a partir de
sustratos ricos en almidón. Estos microrganismos también son aprovechados para la producción
de suplementos nutricionales y probióticos y tienen potencial para degradar compuestos
hidrocarbonados y explosivos, y para fijar metales pesados.

Los hongos también llaman la atención por su capacidad para sintetizar diferentes metabolitos
secundarios, moléculas que no son fundamentales para la supervivencia o para su desarrollo, pero
que les pueden conferir una ventaja en su medio ambiente particular. Su producción está
condicionada por la presencia de determinadas fuentes de carbono, nitrógeno, fósforo y otros
minerales, y también se pueden dar efectos estimuladores o inhibidores de acuerdo con la
proporción de sustratos y productos. Entre estas, encontramos antibióticos, agentes
inmunosupresivos y antitumorales, micotoxinas y ácidos grasos. Al producir sustancias que pueden
limitar el crecimiento de otros organismos, los hongos se han utilizado como agentes
biocontroladores de insectos que disminuyen la contaminación generada por el uso de agentes
químicos en el ambiente.

Las innovaciones tecnológicas e industriales y los avances en biología molecular han permitido
potencializar el aprovechamiento de los metabolitos que se pueden producir a partir de los
hongos. La manipulación genética de las levaduras ha favorecido la producción de proteínas de
interés terapéutico. Asimismo, se están produciendo enzimas con características mejoradas a
partir de hongos recombinantes. La ingeniería metabólica también ha permitido alterar las
características de las cepas empleadas, para incrementar la producción o adaptarla a las
condiciones deseadas.

En el presente informe se presentarán las técnicas apropiadas para el aislamiento e identificación

de hongos en base a sus características morfológicas. De la misma forma, se reconocerán las
principales estructuras de los hongos, al microscopio, que permitan su posterior identificación.
 2. Desarrollo experimental
I. Microcultivo
a. Preparación de la cámara de cultivo
 Se cortó cubos de APD (Agar Papa Dextrosa) de 1cm x 1cm y de espesor
0.3 cm de una placa de Petri con un bisturí estéril.

 Se procedió a colocar los cubos APD (ya obtenidos) sobre 2 portaobjetos

dentro una placa de Petri estéril.
 Ambos procedimientos se realizaron dentro de la zona de esterilización
(calor).
b. Siembra
 Se seleccionó un tipo de hongo del que se extraerían para su aislamiento.
 Con el asa de siembra en ángulo recto se extrajo un inóculo de la muestra
previamente seleccionada y se procedió a inocular por picadura a cada
una de las aristas del cubo de ADP. Este procedimiento se repite para los
otros cubos de ADP. Todo dentro de la zona de esterilización (calor).

 Una vez hecho los inóculos, se colocó sobre cada cubo de ADP un
cubreobjetos (previamente esterilizado) y se presionó ligerante para que
se adhiera al medio.
 Se puso trozos de algodón húmedo, en la periferia, dentro de cada una de
las placas de Petri para mantener la humedad.
  Finalmente, se procedió a empaquetarlos para su posterior incubación,
del que se espera la aparición de estructuras reproductivas que podrán ser
visualizados en el microscopio.

c. Montaje de láminas
 Una vez concluido el periodo de incubación se desprendió el cubreobjetos,
se la puso sobre una lámina portaobjetos con 1 gota de azul de lactofenol
y se la dejo actuar unos minutos de manera que se impregne en las
estructuras fúngicas.
 Finalmente, se las observó al microscopio con objetivos de 10x y 40x,
respectivamente, para reconocer sus estructuras.
II. Método de la cinta adhesiva
 Se empleó una cinta adhesiva, la que se pegó sobre la zona con presencia
de hongos, se la retiró y se la pegó sobre una lámina portaobjetos con
lactofenol. Posteriormente, se la observó al microscopio con objetivos de
10x y 40x, respectivamente.
3. Resultados y discusión
A. Microcultivo

Figura N° 1: A la izquierda Paecilomyces y a la derecha, Alternaria sp.

  Se logró identificar, después del tiempo incubación, Paecelomices y Alternaria a
partir de la muestra dada.

B. Método de la cinta adhesiva

Figura N° 2: A la izquierda Penicillium sp. y a la derecha, Rizopus sp.

 A través de esta metodología rápida y simple, se logró identificar las principales

características de hongos como Penicillium sp. (carecen de vesículas) y Rizopus
sp. de las muestras (tomate y naranja, respectivamente).

4. Cuestionario
I. Explique esquemáticamente el método de aislamiento por diluciones.
Mencione y describa brevemente otros métodos de cultivo.
II. ¿Qué tipo de ambientes dan condiciones para el desarrollo de mohos?

El moho se desarrolla mejor en condiciones cálidas y húmedas, y se propaga y reproduce mediante

esporas. Las esporas del moho pueden sobrevivir en condiciones ambientales, como la
resequedad, que no favorecen el crecimiento normal del moho. A continuación presentamos
algunos factores que afectaran el desarrollo de los mohos:

a. Humedad y Agua disponible

La cantidad de agua existente en el ambiente y en los sustratos es uno de los factores importantes
para el desarrollo de los hongos y para la producción de micotoxinas.
b. Temperatura
La temperatura óptima para el desarrollo de los hongos se encuentra entre 25 y 30ºC y el límite
máximo entre 40 y 45ºC. Destacamos que la mayor parte de los hongos no crecen por debajo de
5ºC y que sin embargo hay hongos como el Aspergillus flavus, Aspergillus candidus y Aspergillus
fumigatus que pueden crecer sin problemas hasta los 55ºC y otros como el Penicillium expansum y
el Penicillium cyclopium que son capaces de crecer a 0ºC.
 c. pH.
Los hongos toleran un gran intervalo de pH ( 2,5 - 7,5 ), de un modo general soportan mejor el
medio ácido que el alcalino.
d. Composición del sustrato.
Los hongos no son exigentes desde el punto de vista nutricional y ellos se nutren de los micro y
macro-elementos existentes en el sustrato donde se desarrollan.
e. Potencial de oxi-reducción (O2/CO22 )
La mayor parte de los hongos son aerobios y por lo tanto necesitan oxígeno para el desarrollo de
sus reacciones metabólicas. Una carencia de oxígeno condiciona el crecimiento de los hongos y la
ausencia total puede llegar a producir la muerte de éstos.

III. ¿Qué características permiten diferenciar a los hongos de otros

eucariontes?

Las características que diferencian a los hongos de los demás eucariontes son:

 Son organismos que poseen células no diferenciadas que se agrupan formando filamentos
llamados hifas (exclusivas de los hongos).
 Sistema de nutrición: Heterótrofa por absorción.
 Son descomponedores.
 No poseen clorofila, a pesar de estar fijos en el sustrato y no realizan fotosíntesis.
 Se reproducen por esporas.
 Las levaduras (hongos unicelulares) producen el proceso de fermentación.
 Algunos son saprófitos y otros son parásitos.
 Algunos hongos son beneficiosos, ya que liberan sustancias nutritivas como compuestos
de carbono, nitrógeno y fósforo y liberan minerales que pueden usar las plantas.
 Poseen pared celular constituida por quitina, en cambio los vegetales su pared celular es
de celulosa.
 Algunos son unicelulares (mohos y levaduras) y otros pluricelulares.
IV. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la técnica de microcultivo
empleado?

Ventajas: Permite observar las estructuras de los hongos filamentosos en forma casi intacta.

Desventajas: No es idónea para un diagnóstico rápido.

V. ¿Qué otras técnicas que permitan la identificación morfológica de hongos

existen?

•Técnica de emparedado

Con esta técnica se tienen dos planos de enfoque.

•Técnica de gota pendiente

Es útil para seguir la evolución completa de un hongo. Se emplea para observar la germinación de
las esporas

•Técnica de montaje húmedo

Es un viejo método rápido para preparar colonias de hongos para examen microscópico.

•Técnica de cinta adhesiva o Scotch

Método que puede considerarse como el más simple, económico y adecuado para la identificación
de hongos

•Técnica de Rivalier

Es una técnica de microcultivo que permite evidenciar de forma clara las estructuras morfológicas
en su arreglo y disposición natural. Se realiza para la identificación de cultivos o bien, para
preparar material de enseñanza

VI. ¿Por qué se utiliza el azul de lactofenol-? Mencione otros colorantes de

contraste.
 La tinción de Azul de lactofenol se emplea para observar hongos.
 Es una tinción simple (un sólo colorante) y como tal está basada en la afinidad del
colorante por componentes de las células, en este caso por las estructuras fúngicas.
 El azul de lactofenol tiene tres características que lo hacen especial para observar dichas
estructuras en los hongos del tipo moho obtenidos en los cultivos por aislamiento:
 El fenol destruye la flora acompañante (algunas veces en los cultivos, juntos a los
hongos pueden crecer colonias de bacterias).
 El ácido láctico conserva las estructuras fúngicas al crear, por decirlo de algún
modo, una película que las protege provocado por un cambio de gradiente
osmótico entre el interior y el exterior de dicha estructura.
 El azul de algodón tiene la capacidad de adherirse a las hifas y conidios de los
hongos microscópicos.

5. Bibliografía
 Koneman R., Micología Prácticas de laboratorio, Editorial Panamericana,
Argentina, 1993.
 Bonifaz Alejandro, Micología Médica Básica, Méndez Editores, México,
D.F., 1994.
 https://www.engormix.com/micotoxinas/articulos/principales-factores-
condicionantes-desarrollo-t26065.htm