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FACULTAD DE CIENCIAS
DE ZIPAQUIRÁ (COLOMBIA)
TESIS
Presentada por
OLGA YANETH VÁSQUEZ OCHOA
Presentado como requisito parcial para optar al título de
DOCTOR EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
ZIPAQUIRÁ (COLOMBIA)
APROBADO:
APROBADO
A mi Esposo Jorge Arturo y a mi hijo Jorge Andrés: gracias por su amor infinito y
apoyo incondicional en cada momento de mi vida.
14 de marzo de 2015
AGRADECIMIENTOS
Quiero expresar mi gratitud a las instituciones y personas que con su ayuda y colaboración
permitieron que esta tesis doctoral pudiera realizarse:
A mi tutor, el Dr. Fabio Roldán, por permitirme participar en su grupo de investigación del
cual hizo parte esta tesis, y por todos los conocimientos que me compartió durante mis
estudios, por sus consejos y amistad.
I would like to thank to Dr. Carmen Neculita my co-advise, who provided me the
opportunity to visit her laboratory in Quebec University (Abitibi-Témiscamingue) and who
guided me through my research and data analyses, thanks for your excellent academic
guidance, encouragement gave me during my studies.
A María Camila Escobar por su aporte en el desarrollo de este trabajo y su ayuda, en los
duros y buenos momentos.
A los profesores Ziv Arbely y Sandra Baena, por sus consejos y orientación.
A todos los integrantes de USBA (Hernan, Luisa, Yaris, Ivan, Carolina y Ginna) por la
buena energía que me transmitieron y especialmente a Johan Saenz por su aporte y
orientación con la bioinformatica.
A mi Familia por su apoyo y amor durante los duros momentos que pasamos.
TABLA DE CONTENIDO
1 INTRODUCCIÓN.......................................................................................................... 4
2 MARCO TEORICO........................................................................................................ 7
3 OBJETIVOS..................................................................................................................25
4 METODOLOGIA......................................................................................................... 26
i
4.8 Determinación de la conductividad hidráulica y la porosidad de las mezclas
reactivas............................................................................................................................ 32
4.11 Remoción de sulfuro, Fe+2 y Mn+2 de los efluentes del biorreactorcon 1 d de TRH
por aireación...................................................................................................................... 35
4.13.2 Determinación del sulfuro ácido volátil (SAV) y de los metales extraídos
simultáneamente (MES) ............................................................................................... 38
5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN.................................................................................. 45
ii
5.5 Determinación de la eficiencia de las mezclas reactivas..................................... 52
5.9 Remoción de sulfuros, Fe+2 y Mn+2 de los efluentes de la columna con 1 d de TRH
por aireación...................................................................................................................... 67
6 CONCLUSIONES..................................................................................................... 109
iii
INDICE DE FIGURAS
Figura 1 Etapas de generación química de DAM.................................................................. 8
Figura 2 Diagrama de flujo para la selección de los biorreactores pasivos como sistema de
tratamiento del DAM.............................................................................................................11
Figura 3 Degradación de materia orgánica en ambientes anaerobios y en presencia de
sulfato.................................................................................................................................... 16
Figura 4 Distrito minero de Zipaquirá y los municipios que lo conforman....................... 26
Figura 5 Montaje batch para evaluación de eficiencia de las mezclas reactivas................ 31
Figura 6 Montaje de los biorreactores pasivos.................................................................. 34
Figura 7 Montaje de columnas con diferentes TRH (1, 2 y 4 d) para el tratamiento de DAM
sintético................................................................................................................................ 35
Figura 8 Montaje de aireación para remoción de sulfuro, Fe+2 y Mn+2 de los efluentes del
biorreactor con 1 d de TRH.................................................................................................. 36
Figura 9 Etapas del sacrificio de los biorreactores pasivos................................................. 37
Figura 10 Montaje empleado para la determinación de sulfuros ácidos volátiles............... 39
Figura 11 Primers para la construcción de los amplicones de la región V4 del gen 16S
rRNA.................................................................................................................................... 41
Figura 12 Fraccionamiento de Fe, Zn, y Mn por extracción secuencia en los substratos
orgánicos............................................................................................................................... 50
Figura 13 Determinación de la eficiencia de las mezclas reactivas durante el tratamiento de
DAM en reactores batch....................................................................................................... 53
Figura 14 Remoción de metales (Fe+2, Zn+2 y Mn+2) durante el tratamiento de DAM en
reactores batch...................................................................................................................... 55
Figura 15 Evolución del pH, ORP y alcalinidad durante el tratamiento de DAM en
biorreactores pasivos.............................................................................................................58
Figura 16 Evolución del sulfato, sulfuros y BSR durante el tratamiento de DAM en
biorreactores pasivos............................................................................................................ 60
Figura 17 Evolución de metales (Fe+2, Zn+2 y Mn+2) durante el tratamiento de DAM en
biorreactores pasivos............................................................................................................ 63
iv
Figura 18 Índice de saturación de algunos minerales formados durante la biorremediación
del DAM en biorreactores pasivos...................................................................................... 65
Figura 19 Remoción de metales (Fe+2 y Mn+2) y sulfuros de los efluentes del biorreactor
con 1 d de TRH por aireación.............................................................................................. 68
Figura 20 ACP de las variables fisicoquímicas evaluadas durante el tiempo de operación
del reactor con 2 y 4 d de TRH............................................................................................ 70
Figura 21 Tamaño de los amplicones de la región V4 del gen 16S rARN........................ 77
Figura 22 Número de secuencias necesarias para considerar un OTU...............................78
Figura 23 Curvas de rarefacción de las muestras obtenidas de la mezcla reactiva post
tratamiento ............................................................................................................................ 79
Figura 24 Distribución filogenética de las secuencias asignadas a phylum....................... 80
Figura 25 Abundancia relativa (> 0,1%) de las familias asignadas al phylum proteobacteria
en el total de las muestras.................................................................................................... 81
Figura 26 Abundancia relativa (> 0,1%) de las familias asignadas al phylum Bacteroidetes
y cloroflexi en el total de las muestras................................................................................ 82
Figura 27 Distancias de las comunidades microbianas en el espacio y el tiempo de
operación del reactor con tresTRH.......................................................................................84
Figura 28 Abundancia relativa de géneros dominantes (> 0,5%) presentes en la mezcla
reactiva utilizada durante el montaje de los biorreactores pasivos...................................... 86
Figura 29 Análisis de coordenadas principales (ACoP) de muestras de mezcla reactiva
post-tratamiento en la semana 8 .......................................................................................... 88
Figura 30 Abundancia relativa de géneros dominantes (> 0,5%) presentes en los reactores
pasivos en la semana 8.......................................................................................................... 89
Figura 31 Análisis de correspondencia canónica (CCA) entre las variables fisicoquímicas
y los géneros (abundancia relativa > 0,5%) encontrados en la mezcla reactiva post
tratamiento de dos biorreactores pasivos con diferentes TRH (2 y 4 d) que operaron durante
8 semanas...........................................................................................................................91
Figura 32 Análisis de coordenadas principales (ACoP) de muestras de mezcla reactiva
post-tratamiento en la semana 1 7 ....................................................................................... 93
v
Figura 33 Abundancia relativa de géneros dominantes (> 0,5%) presentes en los reactores
pasivos en la semana 17...................................................................................................... 95
Figura 34 Comparaciones de la abundancia de los géneros significativamente diferentes en
la semana 17....................................................................................................................... 96
Figura 35 Análisis de correspondencia canónica (CCA) entre las variables fisicoquímicas
y los géneros (abundancia relativa > 0,5%) encontrados en la mezcla reactiva post
tratamiento de dos biorreactores pasivos con diferentes TRH (2 y 4 d) que operaron durante
17 semanas............................................................................................................................ 97
Figura 36 Análisis de coordenadas principales (ACoP) de muestras de mezcla reactiva
post-tratamiento en lasemana 3 6 .......................................................................................... 99
Figura 37 Abundancia relativa de géneros dominantes (> 0,5%) presentes en los reactores
pasivos en la semana 36...................................................................................................... 101
Figura 38 Comparaciones de la abundancia de los géneros significativamente diferentes en
la semana 36........................................................................................................................ 102
Figura 39 Análisis de correspondencia canónica (CCA) entre las variables fisicoquímicas
y los géneros (abundancia relativa > 0,5%) encontrados en la mezcla reactiva post
tratamiento de tres biorreactores pasivos con diferentes TRH (1,2 y 4 d) sacrificados en la
semana 36........................................................................................................................... 104
Figura 40 Modelo biogeoquímico propuesto en los reactores pasivos en la semana 36 .. 107
vi
INDICE DE TABLAS
Tabla 1 Microorganismos reportados en biorreactores pasivos..........................................22
Tabla 1 Microorganismos reportados en biorreactores pasivos (Continuación)..................23
Tabla 2 Análisis fisicoquímicos y microbiológicos realizados a los substratos orgánicos . 29
Tabla 3 Análisis fisicoquímicos realizados a la mezcla reactiva post-tratamiento..............38
Tabla 4 Caracterización fisicoquímica del DAM presente en cinco minas activas del
distrito minero de Zipaquirá..................................................................................................45
Tabla 5 Propiedades fisicoquímicas de los substratos orgánicos...................................... 47
Tabla 6 Contenido de metales (Fe, Zn y Mn) en los substratos orgánicos (El valor
corresponde a la suma de las fracciones)............................................................................. 49
Tabla 7 Composición de las cinco mezclas reactivas evaluadas durante el ensayo batch .. 52
Tabla 8 Calidad de los efluentes de reactores pasivos comparados con el DAM y con los
valores máximos permitidos en la legislación colombiana...................................................67
Tabla 9 Caracterización fisicoquímica y microbiológica de la mezcla reactiva post
tratamiento ............................................................................................................................ 71
Tabla 10 Concentración de metales totales y sulfato en la mezcla reactiva post
tratamiento........................................................................................................................... 73
Tabla 11 Concentración SAV, MES y relación molar MES/SAV determinados en la
mezcla reactiva pos-tratamiento...........................................................................................74
vii
INDICE DE ANEXOS
viii
RESUMEN
ix
media y alta de los biorreactores y los de BSR en la parte baja. El TRH tiene efecto
significativo sobre la mezcla reactiva de los biorreactores y esto crea una presión de
selección sobre los microorganismos funcionales que participan en la biorremediación del
DAM.
x
ABSTRACT
The major type of contaminated generated by the mining industry is acid mine
drainage (AMD). A sustainable approach to remediate AMD is passive bioreactors;
however there is need for information to assess if hydraulic retention time (HRT), space
and operation time could affect the microbial community involved in the bioremediation.
During the study one reactive mixture containing 15% cow manure, 10% mushroom
compost, 25% sajo sawdust, 20% gravel, 15% limestone, and 15% sediment was selected
for use in continuous-flow column experiments. Seven passive reactors (10 cm diameter x
73 cm height) operated under upward flow during 36 weeks were used to evaluate the
effect of HRT (1, 2 and 4 days) on the efficiency to increase pH and alkalinity, as well as,
enhancing sulfate reduction and metal removal of the synthetic AMD. Moreover, the effect
(temporal and spatial) of HRT on reactive mixture post-treatment and microbial community
(Illumina MiSeq) was evaluated in 8, 17 and 36 weeks.
All bioreactors were efficient in remediate the AMD, but longer HRT (4 days)
increased residual sulfides which deteriorated the quality of treated effluent and entailing
adverse impacts on sulfate reducing bacteria (SRB). Short HRT (1 day) washed out
biomass and increased input of dissolved oxygen in the reactors, leading higher redox
potential and decreased efficient metal removal. HRT had significant effects on changes in
the reactive mixture and microbial community. The nutrients were consumed rapidly at the
bottom layer of the bioreactors of 4 days HRT and metal sulfide were accumulate in bottom
layer of the bioreactors of 2 days HRT. The microbial community change temporal and
spatial in the bioreactor. At the beginning of study, the communities were abundant in
organic matter degraders, but then there was a shift towards the increase of cellulolytic and
fermentative taxa in middle and top layer of bioreactors, while SRB were located at the
bottom layer. The HRT present effect on physicochemical composition of reactive mixture
post-treatment and it created a selection pressure on functional taxas.
1
LISTA DE PUBLICACIONES Y ASISTENCIA A EVENTOS
Artículos
Vasquez Y., Escobar M.C., Neculita C.M., Arbeli Z., Roldal F. (2015). Selection of
reactive mixture for biochemical passive treatment of acid mine drainage. (Environmental
Earth Sciences DOI: 10.1007/s12665-016-5374-2)
Vasquez Y., Escobar M.C., Neculita C.M., Arbeli Z., Roldal F. (2015). Biochemical
passive reactors for treatment of acid mine drainage: Effect of hydraulic retention time on
changes in efficiency, composition of reactive mixture, and microbial activity.
(10.1016/j.chemosphere.2016.03.052)
Vasquez Y., Escobar M.C., Neculita C.M., Saenz J., Arbeli Z., Roldal F. (2015).
Biochemical passive reactors for treatment of acid mine drainage: Effect of hydraulic
retention time, space and opetation time on diversity of microbial community.
(Sometimiento previsto para octubre de 2016).
Eventos
Vasquez Y., Escobar M.C., Neculita C.M., Arbeli Z., Roldal F. Efecto del tiempo de
retención hidráulico (TRH) sobre eficiencia de un biorreactor sulfato reductor durante la
remediación de drenajes ácidos de minas (DAM). XXII Congreso Latinoamericano de
Microbiología ALAM 2014. 5 al 8 de noviembre 2014.Cartagena Colombia.
Escobar M.C., Vasquez Y., Neculita C.M., Arbeli Z., Roldal F. Efecto del tiempo de
retención hidráulico (TRH) sobre la actividad microbiana y el sustrato orgánico de un
biorreactor sulfato reductor durante la biorremediación de drenajes ácidos de minas
(DAM). XXII Congreso Latinoamericano de Microbiología ALAM 2014. 5 al 8 de
noviembre 2014. Cartagena Colombia.
2
Roldan F., Vasquez Y., Escobar M.C., Neculita C.M., Arbeli Z. Biorremediación de
drenajes ácidos de minas (DAM). SUMA, Convención Científica Colombiana. Julio 2 de
2014. Cartagena Colombia.
3
1 INTRODUCCIÓN
Una opción viable para la remediación del DAM son los biorreactores pasivos con
un bajo costo de mantenimiento, facilidad de operación en áreas remotas y
aprovechamiento de desechos agroindustriales de la región (Doshi, 2006). Los biorreactores
pasivos son columnas empacadas con una mezcla reactiva conformada por sustratos
orgánicos y celulósicos como fuentes de carbono y energía para los microorganismos, un
componente inorgánico (piedra caliza, arena, gravilla) como material de soporte y un
inóculo microbiano. Durante el funcionamiento, el DAM pasa a través de la mezcla
4
reactiva bajo un tiempo de retención hidráulico (TRH), con el fin de incrementar la
alcalinidad y el pH, reduciendo los sulfatos y generando sulfuro que reacciona con los
metales disueltos para forman minerales insolubles y así lograr su remoción (Luptakova et
a l, 2010).
Estudios previos han reportado que la cuidadosa selección de una mezcla reactiva
capaz de suministrar carbono y nitrógeno orgánico a los microorganismos a corto y largo
plazo, asegura mayor eficiencia al biorreactor (Neculita et al., 2011; Ayora et al., 2013;
Yim et al., 2014). Además, la mezcla reactiva se prepara con sustratos orgánicos de la
región minera, por lo cual no existe una “receta” para un buen diseño y es necesario realizar
estudios en batch y a escala de laboratorio que aseguren el futuro funcionamiento del
reactor en campo (Gusek, 2008). Por otro lado, la eficiencia y el funcionamiento del
biorreactor a largo plazo también dependen de la composición química del DAM, las
variaciones en el flujo y las propiedades hidráulicas, especialmente del TRH (Adams et al.,
2015). Younger et al. (2002) estimó que el TRH es el objetivo de diseño más importante y
el más difícil de lograr cuando se implementan los biorreactores en campo. A la fecha el
efecto del TRH sobre la eficiencia de los biorreactores pasivos ha sido evaluado durante la
remediación del DAM con alta carga de metales (Chang et al., 2000; Neculita et al., 2008);
sin embargo, el efecto del TRH sobre DAM con alta concentración de sulfato y baja
concentración de metales como el caracterizado en el distrito minero de Zipaquirá, aún no
ha sido estudiado.
Aunque los efectos de los parámetros de diseño sobre la eficiencia de los reactores
han sido descritos, todavía no se entiende bien la relación entre los parámetros de operación
y la comunidad microbiana presente durante el funcionamiento de los biorreactores. Este
tipo de estudios son esenciales para asegurar el funcionamiento de los biorreactores y
ayudar a mejorar su diseño y rendimiento a largo plazo (Lu et al., 2011). Hasta ahora la
mayoría de investigaciones se han enfocado en correlacionar la eficiencia de los
biorreactores con el número de bacterias sulfato-reductoras (BSR) a través de la técnica del
número más probable (NMP) dejando de lado las bacterias celulolíticas y fermentadoras,
que son las encargadas de degradar fuentes de carbono complejas, haciéndolas disponibles
5
a las BSR. Además el NMP es una técnica de recuento que limita el conocimiento de las
comunidades microbianas, mientras que técnicas moleculares modernas permiten
cuantificar y entender la dinámica de las comunidades en diferentes ambientes.
6
2 MARCO TEORICO
Los iones férricos (Fe+3) son un poderosos agente oxidante de los minerales
sulfurados, incluso más activo que el oxígeno (entre 18 a 170 veces) (Sánchez-Andrea et
al., 2014). Cuando el pH decrece estos permanecen en solución y son reducidos por la pirita
generando más iones ferrosos (Fe+2) y mayor acidez (Ec. 3) (Johnson y Hallberg, 2005).
7
Inicialmente la oxidación de la pirita es un proceso lento, pero a medida que la
capacidad de neutralizar del medio se pierde y el pH desciende, la capacidad del Fe+3 para
oxidar la pirita incrementa (Ec.3) siendo la causa de la rápida formación del DAM (Figura
1). Además la tasa de formación del DAM se ve afectado por factores como: oxígeno, agua,
microorganismos, textura (tamaño de grano y superficie), solubilidad del mineral y
concentración de elementos traza.
El DAM puede ser neutralizado por carbonatos, especialmente por calcita (CaCO3),
dolomita (CaMg(CO3)2) y menos común magnesita (MgCO3). Estos minerales producen
carbonatos (Ec. 5 y 6) que incrementa la alcalinidad y el pH, facilitando la precipitación de
los metales (Evangelou y Zhang, 1995).
8
2.2 Microorganismos involucrados en la generación del DAM
9
Estas observaciones de campo permitieron desarrollar la idea de contruir humedales
artificiales para el tratamiento del DAM y el consecuente desarrollo de la tecnología de los
sitemas de tratamiento pasivos. Con base en las investigaciones desarrolladas por Tuttle et
al. (1969) sobre el metabolismo de las BSR y su potencial uso en el tratamiento DAM,
investigadores como Hedin (1989), Fukui (1990), Dvorak (1992), Bjorn et al. (1996) y
Cheong (1998), desarrollaron los biorreactores pasivos. Actualmente, la busqueda se ha
encaminado hacia el incremento de la eficiencia de remoción de los metales y hacia la
prolongación del tiempo de operación (Rose, 2010; Ayora et al., 2013; Yim et al., 2014).
Esto ha permitido el desarrollo de varios sistemas de tratamiento pasivos como son:
humedales aerobios y anaerobios, sistema sucesivo de producción de alcalinidad (SAPS),
drenaje anoxico de piedra caliza, canales abiertos de piedra caliza y biorreactores
sulfatoreductores. La selección del sistema depende de varios factores como la composición
química del DAM, el caudal y la geografía de la zona minera (Figura 2) (Watzlaf et al.,
2004)
10
condiciones redox) y por lo general requiere de la sucesión de varios sistemas de
tratamiento o de la combinación de ellos (ITRC, 2013).
alca i na acida
Determ inar OD
Fe*3. A l+3
Estanque de Estanque de
sedim entación sedim entación
¿Metales
pesados ¡
Canal abierto
Sistema de piedra caliza
Biorreactor productor de
bioquím ico alcalinidad
Hum edal
aerobio Estanque de sedim entación Estanque de
y a ir e a c ió n sedim entación
Descarga
Figura 2 Diagrama de flujo para la selección de los biorreactores pasivos como sistema de
tratamiento del DAM (Gusek, 2008).
Una opción promisoria para la remediación de los DAM son los reactores pasivos
(Gusek, 2002) o biorreactores bioquímicos pasivos (ITRC, 2013). Los dos nombres definen
un sistema donde se remedia el DAM por medio de la remoción de los metales y el sulfato,
mientras se incrementa el pH y la alcalinidad. Este proceso se lleva a cabo por medio de
una serie de reacciones secuenciales que son mediadas por varios grupos de
11
microorganismos. Además no requiere la adición de sustancias químicas, ni de consumo de
energía durante su funcionamiento que puede ser hasta por 10 años. Los reactores son
columnas o pozos empacados con una mezcla reactiva conformada por sustratos orgánicos
como fuentes de carbono y energía, un componente inorgánico (piedra caliza, arena,
gravilla) como material de soporte y un inóculo microbiano con bacterias degradadoras de
celulosa, fermentativas y BSR. Por la mezcla reactiva empacada se hace pasar el DAM bajo
un TRH con el fin de favorecer la formación de minerales insolubles reduciendo así los
metales disueltos (Gusek, 2002).
12
utilizado rápidamente durante la puesta en marcha del reactor por las BSR y los
microorganismos que los consumen durante el establecimiento del sistema de tratamiento
(Place et al., 2005). La celulosa es degradada lentamente hasta moléculas simples, por
degradadores de celulosa y su tasa de descomposición determina a largo tiempo la tasa de
sulfato-reducción (Adams et al., 2014). Finalmente, la lignina que se considera no
degradable por los microorganismos anaerobios y se recomienda en baja concentración en
la mezcla reactiva (Gibert et al., 2004).
13
sulfato y la producción de sulfuros se realiza en períodos más cortos (Pruden et al., 2007).
Como inóculo se puede utilizar sedimentos de lagos y de rios contaminados con DAM en
donde se encuentren microorganismos aerobios que favorezcan el rápido consumo de
oxígeno y nitrato así como organismos anerobios que se establescan en el reactor (ITRC,
2013). Diferentes estudios indican que en gran medida el rendimiento y longevidad de los
biorreactores depende de la actividad de las BSR (Hiibel et al., 2008; Pereyra et al., 2008).
Sin embargo, las BSR no pueden oxidar directamente fuentes complejas de carbono y
dependen del metabolismo de otras bacterias como las fermentadoras y celulolíticas. Esto
implica que el número de bacterias degradadoras de fuentes complejas de carbono presentes
en el inóculo es otro factor crítico (Hiibel et al., 2008). La inoculación con bacterias de
precultivos o con estiércol suple el sistema con BSR, pero estos microorganismos son
obligados a pre-adaptarse a los metales lo que puede demorar el arranque del biorreactor
(Pruden et al., 2007; Sánchez-Andrea et al., 2014). Las BSR se encuentran en variedad de
ambientes como suelos, sedimentos, desechos industriales y mineros. Adicionalmente,
tienen la capacidad de acoplar su crecimiento a la oxidación de compuestos orgánicos o al
hidrógeno molecular y a la reducción de sulfatos (Muyzer y Stams, 2008).
Las BSR son anaerobios estrictos; sin embargo, pocas especies pueden tolerar e
incluso resistir el oxígeno por períodos de tiempo muy limitados (Muyzer et al., 2008).
Algunas pueden utilizar el sulfito (SO32-), tiosulfato (S2O32-) o el azufre (S0) como
aceptores de electrones alternativos, y reducirlos de igual manera, a sulfuro (Rabus et al.,
2006). Por último, también se ha observado que las BSR pueden usar compuestos orgánicos
como el fumarato o el dimetilsulfóxido, como aceptores finales de electrones para su
crecimiento (Hao et al., 2014). Estos microorganismos no pueden oxidar directamente
moléculas orgánicas de alto peso molecular como celulosa, hemicelulosa, lípidos y
proteínas, por lo cual habitan en sinergismo con bacteria celulolíticas, fermentativas y
acidogénicas (Figura 3) (Pereyra et al., 2010). La degradación de los sustratos orgánicos
debe llevarse a cabo en condiciones anaeróbicas, donde la primera etapa es la hidrólisis de
biopolimeros por acción de enzimas celulolíticas, proteolíticas y lipoliticas (Madigan et al.,
2002). La etapa hidrolítica puede ser el proceso limitante en la degradación anaerobia,
14
sobre todo cuando se trata de sustratos orgánicos porque depende varios factores como:
contenido de biopolimeros, temperatura, pH y concentración final de los productos de la
hidrólisis (Cook et al., 2008). Al finalizar la etapa hidrolítica los compuestos deben ser
fermentados para producir otros que puedan ser metabolizados por las bacterias
acetogénicas para producir acetato e H2 , productos que puede ser utilizado por las BSR para
reducir el sulfato hasta sulfuro (Madigan et al., 2002).
En presencia de sulfato las BSR pueden competir con las metanogénicas por los
productos de la acetogénesis, pero bioquímicamente las BSR presentan una mayor afinidad
por el hidrógeno, cuando las concentraciones de este gas son menores de 5-10 pM, las
metanogénicas no son capaces de crecer a esas concentraciones, sin embargo las BSR
pueden sobrevivir. En cuanto al acetato, la afinidad de las BSR es diez veces superior que
la de las metanogénicas y esta diferencia es mayor cuando el acetato se encuentra en
niveles limitantes, lo cual impide la metanogénesis (Muyzer y Stams, 2008).
15
Macromoléculas orgánicas
(proteínas, polisacáridos y lípidos)
V_______________________________________ J
Hidrólisis
Fermentación
Compuestos reducidos
Reducción de
(lactato, butirato y propionato)
su Ifatos
Reducción de
sulfates
W
Reducción de
Acetato
sulfatos
Reducción de
su fatos
16
sustrato tiende a compactarse y disminuye la conductividad hidráulica (Neculita et al.,
2007; Haakensen et al., 2015). El material de soporte dentro del biorreactor permite que los
microorganismos se puedan establecer y llevar a cabo los procesos metabólicos.
Adicionalmente cuando se presentan poros o espacios entre la mezcla reactiva se favorece
el flujo y se evita la compactación (Tsukamoto et al., 2004). En los biorreactores
empacados con sustratos orgánicos es común la compactación debido a la precipitación de
sulfuros metálicos y del incremento de la biomasa microbiana, debido a esto se han
evaluado diferentes soportes físicos (gravilla, arena cuarzo disco de cerámica, plástico
peletizado, piedra pomez) que permitan una buena conductividad hidráulica y el
funcionamiento de los biorreactores por décadas (Lyew y Sheppard, 1997).
„ * Ah
Q- KSat A
17
operación. Por lo tanto, se recomienda una mezcla reactiva con diferentes substratos
orgánicos (cascaras de nuez, astillas de madera) y en especial con aserrín, debido a su alta
conductividad hidráulica (10-2a 10-3 cm/seg) que previene el taponamiento (URS, 2003).
18
El TRH tiene influencia directa sobre la eficiencia de los reactores pasivos (Bolis et
al., 1992; Younger et al., 2002; Neculita et al., 2008a) y es dependiente del flujo o caudal
que ingresa al reactor y puede calcularse de la siguiente forma:
VT x 9
v TRH
19
liberando protones que terminan afectando el pH celular (Sánchez-Andrea et al., 2014). La
adición de carbonato de calcio a la mezcla reactiva durante el montaje del reactor favorece
el incremento del pH durante los primeros meses, pero durante el tratamiento la alcalinidad
es generada por la actividad de las BSR (Waybrant et al., 1998; Cocos et al., 2002; Zagury
et al., 2006).
20
et al., 1998), pero durante la etapa de operación la sulfato reducción es un indicador de la
actividad de las BSR. La tasa de remoción de sulfato se ve afectada por el área disponible
de la mezcla reactiva, el TRH, el número de BSR y las variaciones en la concentración de
sulfato en el DAM (Chang et al., 1999). Diferentes compuestos del azufre presentes en la
mezcla reactiva durante la etapa de operación pueden causar toxicidad sobre los
microorganismos en el siguiente orden: sulfato, tiosulfato, sulfito y sulfuros (Reis et al.,
1992). Los estudios de toxicidad de los metales sobre los microorganismos son reportados
con base en la concentración inicial en el DAM, pero no se tiene en cuenta su remoción
cuando ingresan al reactor (Hao et al., 2003). Los metales pueden ser removidos del DAM
por varios mecanismos: a) cuando incrementa el pH en el biorreactor algunos metales
precipitan por formación de hidróxidos (Fe , Cr y Al ) o carbonatos (Fe y Mn ), b)
adsorción en la materia orgánica, c) precipitación como sulfuros metálicos (Pb+2, Co+2,
Cd+2, Cu+2, Ni+2, Fe+2 y Zn+2) (Neculita et al., 2007). Aunque la precipitación por
hidróxidos y carbonatos es ampliamente usada en la industria para la remoción de metales,
la precipitación por sulfuros presenta algunas ventajas, como son: baja solubilidad,
potencial recuperación de los metales, rápida tasa de reacción, ligera decantación y
recuperación de los metales por fundición (Lewis, 2010). Además, factores como la
cantidad de materia orgánica, las condiciones ambientales (pH, carga iónica y temperatura)
y la cantidad de biomasa influyen sobre la absorción de los metales en la mezcla reactiva
(Martins et al., 2009).
21
microbiana en los reactores pasivos está relacionada con factores como el inoculo (Pruden
et al., 2007; Pereyra et al., 2010), el tipo de substrato (Hiibel et al., 2011; Schmidtova y
Baldwin, 2011) y el tiempo de operación (Pereyra et al., 2008).
Los phylum dominantes en los reactores pasivos empacados con material ligno-
celulosico corresponden a Chloroflexi, Chlorobi, Proteobacteria, Firmicutes,
Actinobacteria, Planctomycetes, Spirochaetes, Acidobacteria, Bacteroidetes,
Verrucomicrobia, Gemmatimonadetes, Synergistetes y Caldiserica (Mirjafari et al., 2012;
Sánchez-Andrea et al., 2014). Se han reportado más de 100 géneros (Tabla 1), siendo los
microorganismos heterótrofos que degradan celulosa y otros polisacáridos los más
abundantes (25 al 30%) del total de la comunidad (Pereyra et al., 2010). Los géneros
celulolíticos de mayor abundancia reportados en estudios de biorreactores pasivos
corresponden a Bacteroides, Clostridium, Acetivibrio, Spirochaeta, Ruminococcus y
Cellullomonas. De igual manera, los fermentativos más reportados son Paludibacter,
Clostridium, Devosia y Treponema (Pruden et al., 2007; Hiibel et al., 2008; Lindsay et al.,
2011; Baldwin et al., 2015).
R hodococcus
Hiibel e t al., 2008
Actinobacteria Actinobacteria C ellulom onas
Nancucheo e t al., 2012
M icrobacterium
A rth ro b a cter
22
Tabla 1 Microorganismos reportados en biorreactores pasivos (Continuación).
Phylum Clase Género Referencia
Chlorobi Chlorobi Ignavibacterium Kaksonen et al., 2004
23
Con el desarrollo de las técnicas moleculares se han reconocido 40 géneros que han
sido agrupados por su fisiología y rol ecológico en completas (22 géneros) e incompletas
(16 géneros) oxidadoras de compuestos orgánicos y un remanente formado por
Desulfotomaculum y Desulfomonile, que presentan las dos características (Hao et al.,
2014). Diversos géneros han sido encontrados en los biorreactores pasivos, pero los de
mayor abundancia son Desulfovibrio, Desulfobulbus, Desulfomicrobium que pertenecen al
grupo de las incompletas oxidadoras y Desulfobacter que es el género dominante de las
completas oxidadoras (Sánchez-Andrea et al., 2014). Aunque se han realizado importantes
estudios sobre la diversidad microbiana asociada a la biorremediación del DAM,
investigaciones recientes utilizando técnicas de secuenciación masiva han detectado nuevos
grupos sin asignación taxonómica, sugiriendo que el potencial metabólico involucrado en la
degradación de la materia orgánica y de la biotransformación de metales es más diverso de
lo conocido hasta ahora ( Baldwin et al., 2015).
24
3 OBJETIVOS
25
4 METODOLOGIA
26
artesanal con bajas condiciones tecnológicas. Este tipo de minería se caracteriza por baja
inversión, inadecuados canales de comercialización y deficiente infraestructura (Prieto y
Duitama, 2004). En la región hay 525 minas activas, 27 inactivas y 47 abandonadas, de las
cuales 452 explotaciones tienen un grado de tecnificación bajo. Las minas artesanales de
carbón no producen daños ambientales de manera individual, pero la acumulación de
pequeñas operaciones puede generar ~ 70.400 m3 de Drenajes/mes (FENALCARBON,
2006). Además se han contabilizado 772 hornos de coquización que consumen altas
cantidades de agua para el apague y generan vertimientos ácidos con residuos metálicos. De
acuerdo con el estudio realizado por la Corporación Autónoma Regional de Cundinamarca
(2010), el 55% de las minas realiza tratamiento de DAM por adición de sustancias
alcalinas, el 27% no realiza ningun tratamiento y en un 18% no se conoce. En cuanto a los
vertimientos el 10% de las minas lo hace en fuentes de agua y el 90% a campo abierto.
27
Para la medición del sulfatos a 10 mL de muestra filtradas (0,45 |im) se les adicionó
2 mL de solución Buffer (30 g de MgCl2*6H2O, 5 g de CH3COONa*3H2O, 1 g de KNO3 y
20 mL de CH3COOH (99%), aforado a 1 L con agua destilada) y una punta de espátula de
cristales de BaCl2. Finalmente, se agitó a velocidad constante durante 60 ± 2 s y se
cuantifico por espectrofotometría UV-VIS a 420 nm (Genesys 10, Thermo Scientific,
Waltham, MA) por el Método 4500-SO4 (APHA 2005).
28
4.4 Caracterización fisicoquímica y microbiológica de los sustratos orgánicos
29
4.5 Ensayo de lixiviación de metales y sulfatos en los substratos orgánicos.
30
mecánicamente durante 12 h. Posteriormente, se adicionaron las sales de sulfato de acuerdo
con los metales encontrados en el drenaje (1,6 g MnSO4*5H2O, 1,3 g ZnSO4, y 4,5 g
MgSO4) se agitó fuertemente y luego se agregaron 30 g FeSO4*7H2O disueltos en un 1 L de
H2SO4 (1,25 N), se agitó nuevamente por 1 h y se dejó en reposo por 24 h para la completa
disolución de las sales. Finalmente, el pH se ajustó a ~3,0 usando 1 L de NaOH (1,6 N),
(Anexo C).
Para seleccionar una mezcla reactiva para la construcción del biorreactor de flujo
continuo se evaluó la efieciencia de cinco mezclas previamente preparadas, cada una se
evaluó por triplicado durante 45 d, teniendo en cuenta la capacidad para incrementar el pH
y la alcalinidad así como de remover el sulfato y los metales del DAM. Se colocaron 250 g
(ps) en una botella de vidrio (2 L) junto con 1 L de DAM sintético. Las botellas se agitaron
fuertemente para mezclar los componentes y se taparon con un tapón de caucho con dos
puertos de fácil acceso para los muestreos. Por uno de los puertos se adicionó nitrógeno
gaseoso (N2 ) durante 10 min mientras el otro permanecía abierto, este procedimiento
pretendía crear condiciones anaerobias en el espacio de cabeza de la botella y así favorecer
el establecimiento de las BSR. Finalmente los puertos fueron sellados, las botellas se
envolvieron en papel aluminio para prevenir el crecimiento de bacterias fototróficas y los
biorreactores se dejaron en aclimatación por 9 d (Figura 5).
31
El fondo de las botellas fue revisado diariamente y nueve días después se observó la
presencia de sulfuros metálicos (precipitado negro), que indicaba la reducción de sulfato a
sulfuro producido por el establecimiento de BSR en el biorreactor. Los eventos de muestreo
se realizaron los días 9, 16, 23, 30, 37 y 45 en cada uno de ellos, se extrajo por uno de los
puertos y con ayuda de una jeringa 50 mL de DAM tratado, mientras se aplicaba nitrógeno
por el otro puerto. El pH y el ORP fueron inmediatamente medidos con sonda
multiparamétrica, la alcalinidad fue determinada por titulación (TitroLine alpha plus 20,
Schott) de 10 mL de muestra sin filtrar por el método 2320B (APHA, 2005). El resto de la
muestra fue centrifugada a 8.000 x g for 10 min y filtrada (0,45 pm) y se utilizó para
cuantificar sulfatos por UV-VIS y metales solubles por AA.
32
restado de la unidad y el producto de la diferencia fue considerado como la porosidad,
(Anexo D).
33
Figura 6 Montaje de los biorreactores pasivos: A) mezcla reactiva; B) capa de gravilla y 10
cm de mezcla reactiva; C) plato poroso y geomembrana; D) tapa superior del biorreactor;
E) saturación del biorreactor con DAM sintético; F) aclimatación de los biorreactores.
4.10 Determinación del efecto del TRH sobre la eficiencia de los biorreactores pasivos
34
Figura 7 A) Montaje de columnas con diferentes TRH (1, 2 y 4 d) para el tratamiento de
DAM sintético B) toma de muestra para analisis
4.11 Remoción de sulfuro, Fe+2 y Mn+2 de los efluentes del biorreactor con 1 d de
TRH por aireación.
35
el método azul de metileno. Posteriormente, uno de los extremos de la manguera fue
conectado a una bomba de aire (power life p-500) y el efluente fue sometido a un flujo de
1,5 L/min durante 300 min. Se realizaron 8 eventos de muestreo, los 6 primeros cada 30
min y los dos últimos cada 60 min. En en los efluentes aireados se analizaron nuevamente
los parámetros fisicoquimicos y se determino la calidad con base en la legislación
Colombiana para vertimientos mineros (Resolución 0631 de 2015).
Figura 8 Montaje de aireación para remoción de sulfuro, Fe+2 y Mn+2 de los efluentes del
biorreactor con 1 d de TRH.
36
Figura 9 Etapas del sacrificio de los biorreactores pasivos; A) columna de 4 d de TRH en
la 17 semana; B) plato poroso; C) mezcla reactiva post tratamiento; D) capa de la parte
baja; E) homogenización y muestreo; F) muestras fisicoquímicas y biológicas.
4.13 Determinación del efecto del TRH sobre la composición de la mezcla reactiva
post-tratamiento.
37
utilizado previamente durante la caracterización de los substratos orgánicos. Además, para
la mezcla reactiva post-tratamiento se realizaron análisis de carbono orgánico total (COT),
metales totales y metales extraídos simultáneamente (MES) que junto con sulfuros ácidos
volátiles (SAV), permitieron determinar los mecanismos de remoción durante el tiempo de
operación de los biorreactores.
Los sulfuros ácidos volátiles (SAV) y los metales extraidos simultaneamente (MES)
se determinaron por el método de purga y trampa utilizando HCL (6M) modificado por
38
Neculita et al. (2008b) y en triplicado. Antes de iniciar la extracción se preparó la solución
buffer sulfuro antioxidante compuesta por NaOH (2 M), ácido ascórbico (0,1 M) y EDTA
(0,1 M). En el fondo del erlenmeyer se colocó 1 g de mezcla reactiva húmeda y en el vial
adherido a una de las paredes del erlenmeyer se colocó 2 ml de solución buffer sulfuro
antioxidante (Figura 10). Posteriormente, el sistema se tapó y lentamente se adicionaron 20
mL de HCL (6M) a través de una manguera instalada en el tapón teniendo cuidado de no
salpicar el vial y de sellar rápidamente el sistema para evitar la perdida de gases. El sistema
se colocó en agitación durante 1 h a 150 rpm y el contenido del vial fue retirado para
análisis de sulfuros, por el método azul de metileno. La solución del fondo del erlenmeyer
fue filtrada (0,45 pm) para cuantificar los metales (Fe+2, Mn+2 y Zn+2) por AA.
39
de HCLO4y 1 mL de HF (grado analítico) y se continuó con el calentamiento a baño maría
por 2,5 h más. Finalmente la mezcla se dejó enfriar y se diluyó a 100 mL con agua
deionizada para luego filtrarse (0,45 pm). Los metales disueltos fueron cuantificados por
AA.
Cada uno de los extractos fue amplificado por triplicado en 30 pL: 1,2 ng DNA
molde, buffer (1X), dNTP (0,2 mM de cada uno), MgSO4 (2 mM), primers (0,2 pM de
40
cada uno) y polimerasa (Platinum Taq DNA Polimerasa High Fidelity-Hot Start,
Invitrogen) (0,02 U/pL). Las condiciones de amplificación fueron las siguientes:
denaturación inicial 94°C por 3 min; 30 ciclos de denaturación a 94°C por 45 seg,
anillamiento a 50°C por 60 seg y extensión a 72°C por 90 seg; y un ciclo de extensión final
a 72°C por 10 min. El tamaño del producto (400 pb) se verificó en gel de agarosa al 1,5%
P/V. Las tres amplificaciones de cada extracto fueron unidas en un sólo tubo y purificadas
utilizando el kit UltraClean® PCR Clean-Up Kit (MO BIO; Carlsbad, CA). Finalmente,
una sola muestra compuesta fue preparada por combinación equi-molar de los productos de
PCR de todas las muestras y verificada en gel de agarosa al 1,5% P/V, donde debía estar
presente una sola banda, (Anexo E).
Primer 806R
< ------------ T AAT CTWT GGGVH CAT CAGG CCGACTGACTGATTGCGATCCCTA TAGAGCATACGGCAGACGAAC'5
Am plicon prim er Reverse Linker Pad Barcode Adaptador ¡ilumina
Primer 515F
5'AATGATACGGCGACCACCGAGACGTACGTACGGT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA ------------
Adaptador ¡ilumina Pad linker prim er Forward Am plicon
Figura 11 P rim ers para la construcción de los amplicones de la región V4 del gen 16S
rRNA, (Caporaso e t a l ., 2012).
41
4.16 Calidad, ensamblaje y limpieza de las secuencias
4.18 Determinación del efecto del TRH sobre la composición y diversidad de las
comunidades microbianas
42
el número total de secuencias obtenidas o normalizadas por muestra. Los análisis de
diversidad se llevaron a cabo utilizando la herramienta QIIME 1.7 y el sofware Phyloseq
1.5.21 a través de Rstudio version 3.0 (McMurdie y Holmes, 2013) con matrices de
distancias calculadas con el método de UniFrac teniendo en cuenta la ausencia/presencia y
la abundancia de los OTUS (Lozupone y Knight, 2005).
43
usando el software CANOCO fBraak y Smilauer, 1998). Las variables fisicoquímicas
utilizadas en el CCA fueron estandarizadas con ((x+1)/sd) (Ramette, 2007).
44
5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 4 Caracterización fisicoquímica del DAM presente en cinco minas activas del
distrito minero de Zipaquirá.
Las concentraciones de los metales y el sulfato, fueron muy variables debido a las
condiciones climáticas de los muestreos. Durante los últimos cuatro muestreos se presentó
un fuerte invierno (alta precipitación) que ocasiono inundaciones en la región (año 2011).
45
Los contenidos de metales Fe+2, Mn+2 y Zn+2 presentaron correlación con el sulfato (0,98,
0,66 y 0,62; p < 0,05, respectivamente), esto es debido a la composición del DAM, donde
el bajo pH ocasionado por la presencia de ácido sulfúrico incrementa la disolución de
minerales. Otros metales (Al+3, Cd+2, Pb+2) no fueron detectados, aunque han sido
reportados en las cenizas del carbón y en estudios previos (Pérez et al., 1987; Prieto y
Duitama, 2004).
46
encuentra en forma de celulosa (50,2 ± 0,1%) y lignina (5,5 ± 0,5%) y este debe ser
degradado hasta moléculas de bajo peso molecular antes de ser utilizado. El análisis de
STV se utiliza para estimar la biodegradabilidad de un material sólido durante largos
periodo de tiempo (Matthiessen et al., 2005). Los mayores porcentajes de STV fueron para
el aserrín, el ensilaje y el estiércol (96,3; 82,0 y 82,5%, respectivamente), indicando que
estos substratos pueden ser utilizados en el reactor como fuente de carbono a largo plazo. El
más alto contenido de lignina fue para el residuo de papel y la gallinaza (24,0 ± 0,5%) esto
puede dificultar la biodegradabilidad y la capacidad de desarrollar la actividad microbiana,
porque la lignina no es fácilmente disponible para las BSR (Cocos et al., 2002; Waybrant et
al., 2002; Gibert et al., 2004).
47
cenizas y lignina, así como la baja concentración de COD encontrados en este estudio la
hace un sustrato no recomendado para ser utilizado a largo plazo, además Zagury et al.
(2006) encontraron que este substrato lixivia amoníaco, contaminando el efluente y
perdiendo rápidamente el nitrógeno orgánico. El COD, C/N, SFD y lignina son indicadores
de la fracción biodegradable y permiten evaluar la habilidad de los sustratos orgánicos para
promover sulfato-reducción en los tratamientos de DAM (Zhang y Wang, 2014). Bajo esta
premisa, se propone un clasificación de los substratos orgánicos como donadores de
electrones y fuente de carbono y nitrógeno para las BSR: estiércol> compost de
champiñon> ensilaje> gallinaza> aserrín> residuos de papel.
48
es un indicador del contenido de minerales, donde se incluyen los metales (Hsu y Lo, 1999;
Zorpas et al., 2003).
Tabla 6 Contenido de metales (Fe, Zn y Mn) en los substratos orgánicos (El valor
corresponde a la suma de las fracciones)
mg/kgDs
Substrato
Fe Zn Mn
Gallinaza 9.846,7±16,0 258,6±5,0 162,6±7,0
Compost de champiñón 8.240,5±92,5 185,6±4,0 285,5±9,0
Estiércol 1.325,5±15,0 190,0±9,0 385,2±2,8
Ensilaje 759,7±10,0 76,4±7,8 76,9±3,0
Residuos de papel 537,0±10,0 152,8±9,3 111,4±9,0
Aserrín 132,3± 17,0 23,0±1,5 25±0,4
Todos los substratos pueden lixiviar Mn+2 durante la etapa de aclimatación del
reactor o ante un descenso de pH. El Mn+2 fue el metal más abundante en las fracciones
solubles (F1) y de carbonatos (F2), especialmente en estiércol (86%), compost de
champiñón (50%) y residuos de papel (94%) (Figura 12). La capacidad de lixiviar del Mn+2
se debe a que se encuentra en su forma reducida, facilitando su movilidad al medio acuoso
(Tessier et al., 1979). Por otro lado, el Fe+2 puede lixiviar desde la gallinaza porque se
encuentra en un 66% unido a los carbonatos, pero en estudios previos donde la gallinaza ha
49
sido utilizada en reactores pasivos no se ha observado lixiviación de este metal,
posiblemente por su capacidad de co-precipitar con la materia orgánica (Zagury et al.,
2006; Zhang y Wang, 2014). El Zn+2 se encontró en la fracción F3 del estiércol (48%),
ensilaje (42%) y aserrín (40%) donde los metales están unidos a óxidos de Fe-Mn. Además,
su porcentaje fue alto en la F4 del aserrrin (92%) donde se encuentra unido a la materia
orgánica y donde se presentan condiciones reducidas (Okoro et al., 2012). Por último, el
Fe+2 se encontró en la fracción oxidable (F4) y en la residual (F5) de todos los substratos
(Figura 12), esto sugiere que este metal será retenido durante los ensayos en batch y en
continuo, porque se encuentran asociados a sulfuros o sustancias húmicas formando fuertes
enlaces (Zagury et al., 1997).
50
Por otro lado, el análisis de sulfato solubilizado con HCl (37%), mostró que el
compost de champiñón (28,0 ± 0,7 mg/kg), la gallinaza compostada (17,0 ± 1,0 mg/kg), el
estiércol (11,0 ± 0,5 mg/kg), y el ensilaje (6,5 ± 0,3 mg/kg) pueden lixiviar sulfato durante
la etapa inicial de los ensayos batch o en continuo. La lixiviación de sulfatos durante la
puesta en marcha de los reactores pasivos ha sido observada en previos estudios donde se
utiliza compost como parte de la mezcla reactiva (Neculita et al., 2011; Song et al., 2012a).
En general, durante la etapa de aclimatación de los ensayos batch y continuo es posible
observar la lixiviación de Mn+2 y sulfato desde las mezclas reactivas que contengan
compost y estiércol; sin embargo, se recomienda el uso de estos substratos por su capacidad
para donar electrones y ser fuentes de carbono y nitrógeno para las BSR.
51
Tabla 7 Composición de las cinco mezclas reactivas evaluadas durante el ensayo batch
52
4000
Desde el inicio hasta el final del estudio se presentó un descenso del ORP (-25 hasta
-350 mV, respectivamente) favoreciendo el establecimiento de las BSR y por lo tanto la
reducción de sulfato (Figura 13). Se presentó una reducción de sulfato en todos los
53
tratamientos durante los primeros 9 d, la cual ha sido previamente descrita y se le atribuye a
la adsorción de la mezcla reactiva y/o a la precipitación en forma de yeso (CaSO4*2H2O)
(Amos et al., 2003; Gibert et al., 2004). Al terminar la etapa de aclimatación la
concentración de sulfato incremento en todos los tratamientos por lixiviación desde los
substratos como había sido previsto en los ensayos de lixiviación. Este sulfato lixiviado fue
posteriormente removido por la actividad de las BSR que simultáneamente incrementaron
la alcalinidad, considerada como un indicador de la sulfato-reducción en los biorreactores
pasivos (Lindsay et al., 2011).
54
Tiempo (días)
— • — MR1
— V — MR2
------ □ — MR3
MR4
.......A ....... MR5
------ ☆ ------ DAM+Sedimento
55
Los otros tratamientos mostraron sulfato reducción, pero no remoción de Mn+2, incluso
MR1 mostró un incremento de Mn+2 al final del estudio. MR4 y MR5 presentaron el ORP
más alto y la menor remoción de sulfato, posiblemente por la presencia de residuos de
papel que contenía alta concentración de Mn+2, sulfato y Fe+2. Además, en algunos residuos
de papel se ha reportado la presencia de compuestos organoclorados que inhiben la
actividad enzimática (Nakamata y Ohi, 2003).
Con el fin de seleccionar una mezcla reactiva con propiedades hidráulicas que
garanticen el flujo homogeneo del DAM a través del reactor, se determinó la conductividad
hidráulica y la porosidad a MR2 y MR3. Estas mezclas fueron seleccionadas por su
capacidad para remediar el DAM incluyendo la remoción parcial de Mn+2 (> 69%). MR2
presentó una mayor conductividad hidráulica (4,5 ± 2,3 x 10-2 cm/s) con respecto a MR3
(9,5 ± 6,2 x 10-3 cm/s) y las dos medidas presentaron una alta variabilidad debido a la
heterogeneidad de las muestras. La baja permeabilidad de MR3 posiblemente se debe a la
ceniza (68,3 ± 1.0%) presente en la gallinaza que se deposita en los espacios vacios que
deja la gravilla y la materia orgánica causando problemas de compactación. Bolis et al.
(1992), observó que mezclas reactivas que continene substratos compostados con alto
contenido de cenizas presentan baja conductividad hidráulica afectando el tratamiento a los
pocos meses de operación. En cuanto a la conductividad hidráulica de MR2 se encuentra en
el rango recomendado (1x10-2 cm/seg) para biorreactores pasivos con flujo continuo en
laboratorio y en campo (Costello, 2003; URS, 2003).
La porosidad sólo fue calculada para MR2 y se encontró entre 0,49 y 0,53. Este
valor es considerado adecuado para los reactores pasivos en laboratorio por que permite el
paso del DAM a través de la mezcla reactiva evitando compactación y la formación de
caminos preferenciales de flujo a través de la mezcla reactiva (Bolis et al., 1992). La
mezcla reactiva MR2 es una opción promisoria para ser empacada en reactores pasivos de
flujo continuo. Esta mezcla presenta la suficiente permeabilidad para asegurar el flujo
56
continuo del DAM a través de la columna y su porosidad permite prevenir problemas de
taponamiento y compactación durante el tiempo de operación.
Se evaluó el efecto del TRH sobre la eficiencia de los reactores pasivos para
incrementar el pH y la alcalinidad así como de remover el sulfato y los metales del DAM.
Siete biorreactores fueron empacados con la mezcla reactiva MR2 (estiércol 15%, compost
de champiñón 10%, aserrín de Sajo 25%, sedimento 15%, gravilla 20% y carbonato de
calcio 15%), se saturaron de manera ascendente con DAM sintetico y se dejaron en
climatación durante 2 semanas. Posteriormente, se inicio el flujo continuo de DAM
sintético con 2 y 4 d de TRH y en la semana 16 un reactor de 4 d fue conmutado a 1 d de
TRH manteniendo tres TRH (1, 2 y 4 d) hasta el final del estudio en la semana 36.
57
las BSR (Waybrant et al., 2002; Neculita et al., 2008a; Robinson-Lora y Brennan, 2009;
Song et al., 2012).
58
continuo el incremento de la alcalinidad y el pH, así como el reducido ORP contribuyeron
con el rápido desarrollo de la comunidad microbiana formada por bacterias celulolíticas,
fermentativas y sulfato-reductoras (Robinson-Lora y Brennan, 2009).
La concentración del sulfato en el DAM sintético usado para saturar las columnas
fue 2.500 ± 170 mg/L, sin embargo cuando inicio el flujo continuo la concentración de
sulfato en el efluente incremento hasta y 2.800 ± 32 y 3.382 ± 31 mg/L para 2 y 4 d of
TRH, respectivamente (Figura 16). Este incremento fue ocasionado por la lixiviación de
sulfato desde substratos (estiércol y compost de champiñón) presentes en la mezcla
reactiva, como había sido observado durante los ensayos de lixiviación y batch. La
liberación de sulfato desde substratos orgánicos ha sido previamente reportada (Neculita et
al., 2008; Neculita et al., 2011; Song et al., 2012). Sin embargo, después de iniciar el flujo
continuo la concentración de sulfato en los efluentes decreció (1.300 ± 50 y 1.000 ± 32 mg
/L para 2 y 4 d de TRH, respectivamente) y se mantuvo constante hasta la semana 16, sin
diferencias significativas (p > 0,05) entre los TRHs. Posteriormente, un nuevo incremento
de sulfato fue observado en los efluentes (1.700 ± 98 mg/L), producido por el aumento en
la concentración del sulfato en el DAM sintetico ocacionado por un error durante la
preparacion y a la disminución en el conteo de BSR, causado por el aumento de sulfuros
solubles (H2S o HS" y S-2) en los efluentes (1.952 ± 52 y 2.826 ± 185 mg H2S/L para 2 y 4 d
de TRH, respectivamente). Finalmente, entre las semanas 23 hasta la 36 la remoción de
sulfato incremento, siendo más alta en las columnas con 4 d de TRH, mientras que no se
encontró diferencias entre 1 y 2 d de TRH.
59
3500 3000
3000 2500
2500
2000
h 2000
1500
500
1000
500 500
Tiempo (semanas)
Tlempo (semanas)
4x103
800
3x10J 750
700
ü 2x103
O 650
1x103
DAM
Los sulfuros fueron detectados a partir de la semana 4 en todos los reactores, pero
sólo presentaron diferencia significativa en losTRHs a partir de la semana 8 (Figura 16). La
concentración de sulfuros fue más alta en los reactores con 4 d de TRH, debido al bajo flujo
y largo tiempo de residencia que promovió una mayor oxidación del carbono orgánico
60
disponible y mayor reducción de sulfato por parte de las BSR. Después, de la semana 16 la
concentración de sulfuros incremento significativamente en los dos TRHs (1.952 ± 52 y
2.826 ± 185 mg H2S/L para 2 y 4 d de TRH, respectivamente), este repentino incremento
en la concentración de sulfuros fue causado por la actividad de las BSR que removieron el
sulfato previamente lixiviado desde los substratos orgánicos. El excesivo sulfuro creó un
efecto adverso sobre el conteo de BSR (1,34 ± 0,98 *102 celulas/100 mL) que declino
considerablemente en la semana 20 sin diferencias significativas entre los TRHs (Figura
16). En estudios previos realizados por Sáez-Navarrete et al. (2009) se encontró que los
sulfuros solubles (H2S o HS- y S-2; dependiendo del pH) pueden reducir el tamaño celular y
el crecimiento de los microorganismos cuando están presentes en concentraciones > 108
mg H2S/L. En adición, Okabe et al. (2002) encontró que la producción de células se redujo
ligeramente a una concentración de 100 mg H2S/L, mientras que a 180 mg H2S/L el
crecimiento de la biomasa declino rápidamente. A partir de la semana 21 la concentración
de sulfuros decreció en todos los biorreactores (357 ± 12 y 1.822 ± 67 mg H2S/L para 2 d y
4 d de TRH, respectivamente) y continuo decreciendo en la columna con 2 d de TRH hasta
218 ± 37 mg H2S/L al final del estudio. La reducción en la concentración de sulfuros
favorecio el incremento del número de BSR en los efluentes de los reactores de 2 d de TRH
(8,32 ± 1,9 x103 celulas/100 mL), mientras que en la de 4 d de TRH continuo siendo bajo
(7,35 ± 4,9 x102celulas/100 mL).
La concentración de COD en los efluentes al inicio del flujo continuo fue de 740
mg/L, pero luego decreció hasta ~10 mg/L en la semana 8, y se mantuvo constante hasta el
final del estudio sin diferencia entre los TRHs (Figura 16). No obstante la baja
concentración de COD (~10 mg/L), se observó continua remoción de sulfato (~1.000 mg
SO4/L) a lo largo del estudio. Esto puede explicarse por la presencia de los substratos en la
mezcla reactiva que liberan carbono orgánico que no puede ser cuantificado por el análisis
de COD (Neculita et al., 2008a). Además, la presencia de carbono inorgánico en forma de
carbonatos interfiere con la cuantificación del COD (APHA, 2005). Estos resultados son
consistentes con los encontrados por Schmidtova y Baldwin (2011), que observaron que el
COD se pierde de manera significativa al inicio del flujo continuo en los biorreactores
61
pasivos. Una posible fuente de carbono adicional para las BSR son las SFD que
corresponden a la fracción biodegradable conformada por azúcares, aminoácidos, almidón
y hemicelulosa.
62
250
20
200 t - W w▼
▼ V*
▼t
40
20
1 d TRH
2 d TRH
DAM
Tiempo (semanas)
Los metales (Fe+2 y Zn+2) fueron completamente removidos del DAM durante las
36 semanas de operación de las columnas, sin diferencias significativas entre 2 y 4 d de
TRH (Figura 17). Durante el periodo de aclimatación, la remoción de metales ocurrió
principalmente por precipitación en forma de hidróxidos y carbonatos, así como por la
adsorción en los substratos orgánicos frescos. Sin embargo, durante el flujo continuo los
63
metales también fueron removidos como minerales sulfurados. Esto es confirmado por el
modelo VMINTEQ (Figura 18) y ha sido observado en previos estudios (Neculita et al.,
2011; Zhang y Wang, 2014). La remocion de metales en los reactores pasivos, es
dependiente de del ORP, en la columna conmutada de 1 d de TRH la eficiencia en la
remocion de Fe+2 y Zn+2 decrecio (75% y 67%, respectivamente), cuando el ORP
incremento desde-360 a -108 mV en la semana 23. El ORP es dependiente de la presencia
de OD y de especies redox activas como el sulfato y el Fe+3 (Yim et al., 2014). Por otro
lado, las reacciones que remueven los metales en los biorreactores pasivos son sensibles a
las condiciones redox y estas son reversibles (Cheong et al., 2010).
64
El índice de saturación (IS) de los minerales formados en los biorreactores fue
calculado con el modelo VMINTEQ usando las características fisicoquímicas de los
efluentes de diferentes semanas (Figura 18). El mineral amorfos de Zn y Fe, Spharelita
[(Zn,Fe)S] mostro super saturación (IS> 1) a lo largo del estudio, siendo más alto en las
columnas con 1 d de TRH. Este minerale indican que las concentraciones de Zn pueden ser
controladas por la solubilidad del sulfuro de Zinc (Waybrant et al., 2002). El IS de calcita
(CaCO3), muestra que este mineral fue alto a partir del flujo continuo y hasta el final del
estudio. Mackinawita (FeS) y pirita (FeS2) estuvieron presentes en las columnas de 4 y 1 d
de TRH. La presencia de estos minerales sugiere que la sulfato reducción y la precipitación
de sulfuro de hierro fue el principal mecanismo para la remoción de Fe+2. La presencia de
rodochrosita (MnCO3 ) sólo fue estimada en la columna de 1 d de TRH al final del estudio.
La precipitación de Mn como carbonato puede ser uno de los mecanismos para la remoción
de este metal en biorreactores pasivos (Waybrant et al., 2002; Neculita et al., 2007).
, A) B)
T ie m p o (s e m a n a s )
„ C)
S p h a re lita
S id e rita
M a c k in a w ita
C a lc ita
E q u ilib rio
R o d o c ro s ita
T ie m p o (s e m a n a s )
65
El TRH, tiene un fuerte efecto sobre la evolución de la eficiencia de los
biorreactores pasivos, durante el tratamiento del DAM con alto contenido de sulfato.
Largos TRH (4d) tienen baja velocidad en el flujo favoreciendo el crecimiento y la
actividad de BSR. Como resultado, se genera alta alcalinidad y exceso de los sulfuros
solubles que contaminan los efluentes. Por otro lado, el excesivo contenido de sulfuros
producido por el proceso biológico de sulfato-reducción afecta el crecimiento y el
desarrollo de las BSR ocasionando fallas eventuales en los reactores pasivos. En el caso
contrario, cortos TRH (1d) lavan la biomasa e inducen el ingreso del OD en el reactor
incrementando el ORP, afectando las condiciones anaerobias y creando efectos adversos
sobre la actividad, como resultado la remoción de metales fue reducida en un 30%.
Aunque los efluentes de las columnas no cumplen a cabalidad con los valores
máximos permitidos en la legislación colombiana, los biorreactores se consideran eficientes
66
en el tratamiento del DAM por su capacidad de incrementar el pH y remover el sulfato. La
remoción de iones sulfato de los vertimientos industriales es considerada como el mayor
desafío de un sistema de tratamiento debido a su alta solubilidad que incrementa los costos
por el uso de sustancias precipitantes (Cadorin et al., 2007). Por otro lado, aunque los
efluentes de la columna con 1 d de TRH exceden los valores máximos permitidos para los
metales, se considera como una opción viable para posteriores estudios porque tiene menor
concentración de sulfuros que pueden ser oxidados a sulfatos sin reducir el pH y la
alcalinidad.
Tabla 8 Calidad de los efluentes de reactores pasivos comparados con el DAM y con los
valores máximos permitidos en la legislación colombiana.
Efluentes de Biorreactores pasivos
Resolución
Parámetro Unidad DAM (TRH)
0631
1d 2d 4d
pH 6,0-9,0 3,0-4,5 7,1±0,1 7,0±0,3 7,3±0,2
Alcalinidad NE NA 531±50 835±96 1.306±13
Sulfato li 1,500 2,500 1.170±129 1.045±108 760±70
Sulfuros ll 1,0 NA 34±13 211±17 1.150±183
Fe mg/L 2,0 200 31±2 0,9±0,1 0,6±0,1
Mn 1i NE 31 29±0 31±2 31±1
Zn 1 3,0 18 6±1 0,3±0,0 0,6±0,1
Los valores de los efluentes son presentados con el promedio ± SD de los parámetros
fisicoquímicos determinados en la semana 30. NE: no especifica; NA: no aplica; TRH: tiempo de
retención hidráulica.
67
alta eficiencia para la remoción de Fe+2, pero no de Mn+2 cuando está presente materia
orgánica (Ellis et a l 2000). Sin embargo, en este ensayo se observó la remoción de los dos
metales, posiblemente por co-precipitación debido a que los oxi-hidróxidos presentan
cargas positivas bajo condiciones alcalinas, lo cual facilita la adsorción de Mn+2 (Vymaza,
1998). Pero este fenómeno sólo es posible cuando se incrementa el ORP y el pH es superior
a 7,0 con capacidad de neutralizar la acidez que se generan durante la reacción, estas fueron
condiciones observadas en este estudio. No obstante, esta remoción de metales no es
estable a largo tiempo porque los óxidos de hierro y manganeso son sensibles a los cambios
en el ORP y a la concentración de oxígeno.
Figura 19 Remoción de metales (Fe+2 y Mn+2) y sulfuros de los efluentes del biorreactor
con 1 d de TRH por aireación.
Posterior a la remoción de Fe+2 y Mn+2 fue posible remover los sulfuros solubles
(Figura 19). La remoción inicial de sulfuros (15%) en los primeros 90 min posiblemente se
debe a la difusión del H2S (gaseoso) ocasionada por la agitación del efluente durante el
burbujeo, mientras que la remoción del 50% en los 150 min posteriores es producida por la
68
oxidación de HS" hasta sulfato. La aireación es un tratamiento usado para tratamiento de
efluentes contaminados con sulfuros; sin embargo, solamente elimina la parte de los
sulfuros que está presente como HS- debido a que es la forma más reactiva frente al
oxígeno. La calidad de los efluentes de la columna de 1 d de TRH mejoro durante la
aireación y cumple con la normatividad colombiana para efluentes mineros. Este
tratamiento permitio precipitar el Fe+2 (>99) y posiblemente co-precipitar el Mn+2 (50%) así
como oxidar el sulfuro (65%) hasta sulfato manteniendo constante el pH (7,0). La aireación
de los efluentes es una opción viable que debe ser tenida en cuenta en estudios posteriores
en campo.
5.10 Determinación del efecto del TRH sobre la composición de la mezcla reactiva
post-tratamiento.
Para evaluar el efecto del TRH sobre composición de la mezcla reactiva post
tratamiento se sacrificaron 7 reactores y la mezcla reactiva de cada uno fue dividida en tres
capas (alto, medio y bajo). En las semas 8 y 17 se sacrificaron biorreactores con TRH de 2
y 4 d y en la semana 36 se sacrificaron tres biorreactores con TRH de 1, 2 y 4 d. La
composición de la mezcla reactiva post-tratamiento (Figura 20) se diferencia en mayor
medida (76,6%, eje 1) por tres características: contenido de nutrientes (TKN, COT,
celulosa), pH y Zn, mientras que en menor medida (12,6%, eje 2) por SAV y Fe. Sin
embargo la tendencia más fuerte de separación está dada el tiempo de operación del reactor.
El EM realizado de la semana 8 se agrupa a la izquierda del primer eje cerca del contenido
de nutrientes y del pH, parámetros considerados esenciales para el establecimiento de los
microorganismos en el reactor (Neculita et al., 2008), A partir de la semana 17 se observa
una mayor separación entre las partes del reactor para los dos TRH (2 y 4 d). Los sulfuros
(SAV) y el Fe+2 afectan la parte baja de los biorreactores sin diferencias significativas,
mientras que el sulfato afecta la parte media y alta de los reactores con 4 d de TRH. Esto se
debe a la configuración de flujo ascendente del reactor debido a que al ingresar el DAM, en
la parte baja se reduce la mayor cantidad de sulfato a sulfuro y además se produce
precipitación del Fe en forma de oxi-hidróxido en pH neutro. Finalmente, en la semana 36
69
el Zn tiene un efecto significativo sobre la composición de la mezcla reactiva post
tratamiento, este metal presentó mayor remoción en forma de ZnS sin diferencias
significativas en el espacio de los reactores con TRH de 1, 2 y 4 d.
70
La concentración de nitrógeno y carbono orgánico fue significativamente mayor (p
< 0,05) en la parte alta de los biorreactores que operaron con 2 d de TRH, mientras que en
la parte media y baja de los biorreactores con 4 d de TRH se observó una menor
concentración (Tabla 9). Este comportamiento está relacionado con un mayor número de
BSR en la parte media y baja de reactor con 4 d de TRH ocasionando un mayor consumo
de la fuente de carbono y nitrógeno.
71
Esto puede deberse a que no todo el carbono orgánico en la mezcla reactiva es
biodegradable o disponible para los microorganismos por lo que la relación C:N podría ser
mayor a la calculada (Gibert et al., 2004). El carbono orgánico y el nitrógeno presentaron
una fuerte correlación con pH (0,762 y 0,723 a p < 0,01, respectivamente), esto ha sido
observado en otros estudios donde encontraron que la relación C: N (10) es sustentable para
la biodegradación cuando el pH es mayor a 5,0 (Adams et al, 2014; Hakensen et al., 2015).
El contenido de carbono orgánico y nitrógeno están entre los principales factores que
afectan la eficiencia de los biorreactores pasivos durante el tratamiento del DAM y su
rápido consumo puede afectar la eficiencia del reactor a largo plazo (Choudhary et al.,
2011).
72
observación está relacionada con el comportamiento de los metales, donde la concentración
de Fe fue mayor en la parte baja mientras, que la de Zn fue similar a lo largo del reactor
durante el tiempo de operación. Observaciones similares han sido hechas en otros estudios
de la mezcla reactiva y su análisis posterior a la etapa de operación (Zaluski et al., 2003).
La alta concentración de los metales en la mezcla reactiva post-tratamiento indica que los
biorreactores fueron eficientes en su remoción desde el DAM.
La concentración de Mn fue similar en todas las capas del reactor sin diferencias
significativas. Su remoción sólo ocurrió en la etapa inicial del reactor cuando fue adsorbido
por la mezcla reactiva o cuando incremento el pH y precipita como rodocrosita (Jong y
Parry, 2003). Mientras que la concentración de Fe y Zn incrementan a lo largo de las 36
semanas, probablemente por la formación de sulfuros metálicos. La concentración de
sulfato incremento en la mezcla reactiva durante el tratamiento y de manera significativa en
la parte baja de los reactores de 2 y 4 d de TRH, sin embargo es mucho menor en la
73
columna de 1 d de TRH debido a que el incremento repentino de flujo ocasiono el
desprendimiento del sulfato previamente inmovilizado, aumentando la concentración en los
efluentes en la semana 21. Además la concentración del sulfato en la parte baja de los
reactores de 2 y 4 d presenta correlación positiva con los metales (Fe: 0,421; Zn: 0,750 y
Mn: 0,381; p < 0,01) y negativa con el pH (-0,773; p < 0,01) observación que puede ser
explicada por la composición química del DAM y la configuración de flujo ascendente del
reactor.
La interpretación de la relación molar MES/SAV (> 1,0) indica que en todas las
capas de los reactores la precipitación de oxi-hidróxidos y minerales de carbonato fue el
principal mecanismo de remoción de los metales y que la remoción por formación de
sulfuros sólo se estableció al final del estudio (Tabla 11). La relación molar MES/SAV fue
significativamente (p < 0,05) mayor en la semana 8, cuando las BSR no se han establecido
completamente, pero en las siguientes semanas la relación molar decrece debido al inicio de
74
la formación de sulfuros metálicos. La relación molar MES/SAV (> 1,0) también indica la
movilidad de los metales en condiciones ácidas, siendo significativamente altas en la
semanas 8 y 17, sin embargo durante la semana 36 la relación molar decrece especialmente
para el Zn que es el metal que primero forma sulfuros debido a que su producto de
solubilidad (-28,39) mucho más bajo que el de FeS (-22,39) y MnS a (-13,34) (Jong y
Parry, 2003). Una vez que las condiciones de sulfato reducción se han establecido la
precipitación de sulfuros incrementa en todos los biorreactores, pero no llega a ser el
principal mecanismo de remoción de los metales. La precipitación de sulfuros es el
mecanismo deseado para remover metales desde el DAM, por que los sulfuros metálicos
son altamente insolubles y menos biodisponibles comparados con los carbonatos
(Wildeman y Updegraff, 1997; Neculita et al., 2007).
75
5.11 Determinación del efecto del TRH sobre la diversidad de las comunidades
microbianas
Se prepararon 225 librerías de la región V4 del gen 16S rARN que corresponden a:
7 biorreactores, cada uno uno dividido en 3 partes (alto, medio y bajo) y cada parte dividida
en 3 muestras (63 muestras); 3 muestras de mezcla reactiva inicial, 6 muestras de cepas
puras y 3 muestras de la comunidad artificial, todas amplificadas por triplicado. En el gel
de agarosa se observó que las librerías tenían un tamaño aproximado de 400 pb, valor
confirmado mediante BioAnalyzer que reportó un tamaño de 389 pb para los amplicones
(Figura 21). La mezcla preparada por combinación equi-molar de los productos de PCR
presentó una concentración de 59,3 ng/ul y una relación 260/280 igual a 1,93 y de 260/230
igual a 2,11. Estos valores confirmaron la pureza del ADN e indicaron que no había
impurezas (proteínas y/o fenol) que absorbieran a 230 y 280 nm (Figura 21).
76
Figura 21 Tamaño de los amplicones de la región V4 del gen 16S rARN evaluado
mediante BioAnalyzer (A) y gel de agarosa (B).
77
establecido entre 40 a 70% (Gloor et al., 2010; Caporaso et al., 2011; Degnan y Ochman
2012).
Utilizando las secuencias de los controles empleados: dos cepas puras y una
comunidad artificial (12 cepas), se determinó que el número mínimo de secuencias que
debía contener un OTU era 100. Este valor se determinó después de evaluar la
conformación de OTUS con 2, 10 y 50 secuencias; sin embargo, los resultados obtenidos
con estos valores excedían los OTUS esperados en los controles (Figura 22). Con la
inclusión de estos controles de secuenciación se busco determinar los parámetros de calidad
que permitieron la eliminación de los errores producidos durante la amplificación y
secuenciación del ADN (Kunin et al., 2011).
78
Utilizando 100 secuencias para definir un OTU y teniendo en cuenta que el gen 16S
rARN es un gen multicopia y que sobreestima la diversidad mínimo 2,5 veces (Acinas e t a l ,
2004), se esperaba encontrar en 2,5 OTUS para las cepas puras y 30 OTUS para la
comunidad artificial. Los resultados de los controles fueron: P seu d o m o n a s d enitrificans 25
OTUS, A g robacterium sp 12 OTUS y comunidad artificial 38 OTUS (Figura 22). Aunque
los valores encontrados son mayores a los esperados se decidió seleccionar 100 secuencias
para definir un OTU, porque emplear valores demasiado astringentes para obtener los
OTUS teóricos de los controles resulta en una disminución dramática en el número de
filotipos de las muestras ambientales (Kunin e t a l ., 2010).
79
5.11.5 Estimación de la abundancia relativa de taxones
Proteobacteria (33,7%)
Bacteroidetes (24,3%)
Firmicutes (10,5%)
Spirochaetes (9,5%)
Chloroflexi (5,7%)
Fibrobacteres (4,8%)
WWE1 (1,3%)
Actinobacteria (1,2%)
Verrucomicrobia (1,0%)
Synergistetes (0,8%)
Chlorobi (0,7%)
Tenericutes (0,5%)
Samples
80
En el p h y lu m proteobacteria, la familia con mayor abundancia (6,0%) fue
Sphingomonadaceae, pero sólo los géneros Sp h in g o m o n a s (0,12%) y Sph in g o p yxis (0,08%)
pudieron ser clasificados hasta género en todas las muestras (Figura 25). Las familias
asociadas con el proceso de sulfato-reducción como Desulfobacteraceae, Desulfobulbaceae,
Desulfovibrionaceae, Syntrophobacteraceae y Desulfarculaceae presentaron una
abundancia relativa del 10%, pero sólo fue posible la clasificación hasta género de un 6%.
Las familias de menor abundancia que pertenecieron a las clases Epsilonproteobacteria y
Betaproteobacteria.
81
muestras de suelo y en su mayoría acetogénicas (Pruden et al., 2007). La segunda familia
en abundancia fue SB-1, común en lodos activos y aguas domesticas, por lo general
asociada a ambientes ricos en materia orgánica (Hesham et al., 2011).
Figura 26 Abundancia relativa (> 0,1%) de las familias asignadas al phylum Bacteroidetes
y cloroflexi en el total de las muestras.
82
resolución taxonómica cuando las secuencias son cortas como en nuetro caso que se
encontraban entre 180 a 250 pb (Bartram et al., 2011).
83
Figura 27 Distancias de las comunidades microbianas en el espacio y el tiempo de
operación del reactor con tres TRH, calculadas mediante el análisis de Pairwise-Unifrac.
Los ordenamientos de la izquierda fueron elaborados con matrices de abundancia
(Weighted) y las de la derecha con matrices de ausencia/presencia (Unweighted).
84
ambiente explica la variabilidad genética entre muestras (Luzapone et al., 2007). Por otro
lado, el TRH no mostró efecto sobre las distancias de los taxones, pero este parámetro debe
ser evaluado durante cada uno de los eventos de muestreo dado su estrecha relación con la
química de la mezcla reactiva y el espacio en los reactores. Es conocido en los estudios de
ecología que la tasa de equilibrio de las comunidades se ve limitada por el espacio. En
amplios espacios se presenta una mayor diversidad y existe una menor tasa de migración
por parte de los organismos (Diamond, 1975). En biorreactores para tratamientos de
vertimientos domésticos se ha encontrado efecto del TRH sobre la composición de la
comunidad microbiana, pero este efecto se encuentra correlacionado otros parámetros de
diseño como la carga de carbono orgánico, el tamaño y la forma del reactor (Pholchan et al
2010; Li et al., 2015; Shu et al., 2015; Traversi et al., 2015).
5.11.7.1 Inoculo
85
Figura 28 Abundancia relativa de géneros dominantes (> 0,5%) presentes en la mezcla
reactiva utilizada durante el montaje de los biorreactores pasivos.
En la muestra de mezcla reactiva fue posible asignar los OTUS a 115 géneros, de
los cuales un 50% tiene una abundancia relativa mayor al 0,5% (Figura 28). El género más
abundante fue Devosia, reconocida por su capacidad de degradar celulosa y otros
polisacáridos como peptina y almidón, así como de fermentar los productos de la hidrolisis
(Pruden et al., 2007). Otro género de importancia en la ruta de degradación anaerobia de
compuestos orgánicos presente en el inóculo fue Clostridium. Este género ha sido reportado
en ambientes anaerobios ricos en materiales lignocelulósicos por su capacidad para
degradar azúcares y almidón, así como para fermentar los productos de la hidrólisis (Pruden
et al., 2007). El género Clostridium contienen especies capaces de romper compuestos
orgánicos a través de la fermentación dando origen a una mezcla de intermediarios
incluyendo acetato e hidrógeno (Martins et al., 2009). Además, algunas bacterias de este
86
género hidrolizan ensilajes generando butirato y han sido encontradas en el rumen del
ganado vacuno (Baldwin e t a l ., 2015; Mirjafari e t a l ., 2014). Los género C lostridium y
B a ctero id es son eficientes degradadores de celulosa y su presencia en el inoculo asegura la
eficiencia del biorreactor (Pereyra e t a l ., 2008). Además, se encontraron los géneros
Sphingobacterium y S phingom onas que producen P-glucósidasa durante su metabolismo,
indicando que son capaces de degradar polímeros de celulosa (Jiménez e t a l ., 2014). Otro
género presente en el inóculo fue B a ctero id es que está conformado por microorganismos
sacarolíticos capaces de utilizar una amplia variedad de fuentes de carbón y energía. El
mecanismo de degradación de B a ctero id es es altamente eficiente (Dworkin, 2000; Prudent
e t a l ., 2007). Además, en el inóculo se encontraron BSR, consideradas claves en la
inmovilización de los metales en el reactor. Con una abundancia > 0,5% se encontraron
D esulfovibrium y D esulfom icrobium conocidos por oxidar los sustratos de manera
incompleta hasta acetato (Sánchez-Andrea e t a l ., 2014). Estos géneros de BSR por lo
general están asociados con Trep o n em a en muestras de biorreactores pasivos, debido a que
son co-dependientes para obtener carbono y energía (Mirjafari e t a l ., 2014).
5.11.7.2 Semana 8
87
grupos microbianos específicos se establecieron en los biorreactores (p,e., T78, Treponema,
Clostridium). Sin embargo, durante este periodo no se encontraron diferencias
significativas (Adonis p> 0,05) entre los linajes presentes en las diferentes alturas de los
reactores, ni tampoco entre en los TRHs. Lo anterior se puede visualizar utilizando las
matrices de abundancia y de presencia/ausencia en el análisis de coordenadas principales
(ACoP) donde no se observó separación de los linajes microbianos en las alturas ni entre
los TRHs (Figura 29). Estos resultados estan relacionados con las propiedades
fisicoquímicas de la mezcla reactiva post-tratamiento que tampoco presentó diferencias
significativas entre las alturas durante en la semana 8. En esta semana las comunidades
microbianas, aún se encuentraban en establecimiento y no hubo una clara diferenciación
entre los taxones presentes en el reactor. Estudios previos han reportado que durante la
etapa de establecimiento hay una sucesión ecológica antes de llegar a una relativa
estabilidad y que estos períodos de cambios dinámicos no afectan la eficiencia del reactor
(Bagchi et al., 2015; Shu et al., 2015).
Núcleos
• Bajo
A Medio
■ Alto
TRH (d)
♦ 2
♦4
88
pasivos empacados con material lignocelulósico debido a que contienen bacterias que
metabolizan compuestos orgánicos hasta acetato el cual es utilizado por las BSR (Mirjafari
e t a l ., 2014; Baldwin e t a l ., 2015). Además, los géneros propuestos VadinC A 02 y B F 311 se
encontraron en todas las alturas del reactor y han sido reportados en reactores para
tratamiento de aguas domésticas y en ambientes ricos en materia orgánica (Goodon e t a l .,
1997; Gich e t a l ., 2001; Baldwin e t a l ., 2015).
■ 77 8
3 T reponem a
■ C lostrídium
1 D e vo sia
3 N o a sig n a d o s
c 3 D e su lfo vib rio
B F 311
[T m B a cte roide s
i i T rabulsiella
I I va d in C A 0 2
m m A rco b a cte r
i i C o p ro th e rm o b a cte r
Leadb e tte re lla
L u te im o n a s
A g ro b a cte riu m
] S p h in g o m o n a s
I S p h in g o b a cte h u m
] D e su lfo m icro b iu m
I S ten o tro p h o m o n a s
S p h in g o b a cte riu m
M e th y lib iu m
P a lu d ib a c te r
Pseudom onas
C □ S p h in g o p yxis
l i l i D e su lto b a cte r
Figura 30 Abundancia relativa de géneros dominantes (> 0,5%) presentes en los reactores
pasivos en la semana 8 (2 y 4 d de TRH; A: alto, M: medio y B: bajo).
89
La relación de las variables fisicoquímicas evaluadas con la abundancia de los Fila
fue significativa (p = 0,01). En este modelo se excluyeron las variables fisicoquímicas:
sulfuro ácido volátil (SAV) y celulosa por que su valor de inflación del modelo superaba el
24%. Los demás párametros explican 89,2% % de la varianza de la relación entre las
variables fisicoquímicas y biológicas (Figura 31). Esto indica que aproximadamente 10 %
de la varianza restante esta explicada por otras variables que no fueron medidas. Se
encontró que las SFD y los sulfatos (Monte Carlo, p < 0,05) son las variables ambientales
que pueden estar influenciando en mayor medida sobre la variación de la comunidad
microbiana, mientras que pH tiene menor efecto. Durante las primeras 8 semanas, el
porcentaje de SFD en la mezcla reactiva decreció rápidamente sugiriendo riqueza de los
microorganismos que utilizan fuentes de carbono fácilmente disponibles. Por otro lado, en
esta primera etapa los principales mecanismos de remoción fueron la adsorción en la
materia orgánica y la precipitación de carbonatos, sulfatos y oxi-hidroxidos. En este
tiempo, aún no se habia establecido completamente la remoción biológica de sulfatos lo que
implica su acumulación en la mezcla reactiva y posterior efecto sobre el crecimiento
microbiano, como lo demuestra Saenz-Navarrete e t a l . (2009), cuando utiliza
concentraciones mayores a 2.200 mg SO4/L durante el crecimiento de BSR.
En la gráfica del análisis canónico, se puede observar que algunos de los géneros
estuvieron asociados directamente con las variables fisicoquímicas, como: Treponem a,
C oprotheobacter y P a lu d ib a cter con el nitrógeno, A rco b a cter con pH, D esu lfo vib rio y
D esu lfo b u lb u s con sulfato y Zn, B acteroides, C lostridium , Luteim onas, A grobacterium , y
B revu n d im o n a s al carbono orgánico total, mientras que los géneros candidatos ( T78 ,
VadinC A 02 y B F 3 1 1 ) y T rabulsiella están separados de las variables fisicoquímicas
evaluadas en la mezcla reactiva, indicando que estas variables no explican su presencia en
los reactores. Previas investigaciones reportan que el pH (Kuang e t a l ., 2012), seguido por
el contenido de nitrógeno y carbono orgánico (Jangid e t a l ., 2008) son las varibles
ambientales que más influyen sobre la comunidad. Sin embargo, en la semana 8 donde el
pH es igual en todas las alturas del reactor, esta variable no presenta un efecto significativo
90
(p > 0,05) sobre la diversidad, pero la concentración de nitrógeno y carbono orgánico si
afectan de manera significativa (p > 0,05) la comunidad microbiana, observándose varios
géneros relacionados con ellas.
91
en la acum ulación de sulfatos en la m ezcla reactiva post-tratam iento. E n com paración con
el inóculo se observó una fuerte reducción de diversidad m icrobiana m ientras se increm ento
El segundo evento de m uestreo se realizó en la sem ana 17, cuando los reactores se
encontraban rem oviendo > 99% de los m etales (Fe+2 y Zn+2) y > 65% de sulfatos del D A M .
E n esta etapa los reactores se encontraban estables, sin cam bios significativos en el pH y el
ORP. Sin em bargo, la concentración de Mn+2 en los efluentes era el doble (60 ± 2 m g/L
los sulfuros disueltos habían increm entado significativam ente en los dos T R H (2,526 ± 52 y
significativam ente (p < 0,05) la diversidad (S hannon: 6,3 ± 0,2) y aum entaron la riq u eza de
las com unidades m icrobianas presentes en las alturas de los reactores y entre los T R H (2 y
observó que la com unidad m icrobiana se separó en cuatro grupos definidos (Figura 3 2 ). Las
m ayores distancias filogenéticas se observaron entre los taxoness de la parte baja del
reacto r con 2 d de T R H y los de la parte alta del rea c to r con 4 d de TR H , m ientras que las
m enores distancias fueron entre los taxoness de la parte m edia de los reactores con 2 d y los
de la parte baja del reacto r con 4 d de T R H así com o entre los taxoness de la parte alta de 2
configuración de flujo ascendente de los reactores que facilitó la acum ulación de sulfuros
p o r que esta podía tra ta r m ayor flujo de A M D en m enor tiem po. L os cam bios observados
en las variables fisicoquím icas de la m ezcla reactiva durante la operación de los reactores
92
incremento la abundancia de los taxones funcionales capaces de obtener energía a partir del
proceso redox de los metales.
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93
El cambio en la abundancia relativa de los géneros posiblemente se encuentra
asociado a la reducción de materia orgánica y al incremento de la toxicidad causada por la
alta concentración de sulfuros en los efluentes, entre la semana 8 a la 17. En este mismo
periodo, en la mezcla reactiva post-tratamiento se observó un incremento del porcentaje de
las SFD, mientras que la concentración de celulosa disminuyó. Estos resultados indicaron
que aunque el porcentaje de bacterias degradadoras de celulosa y fermentativas disminuyó,
la cantidad que había en los reactores fue suficiente para degradar fuentes de carbono
complejas como la celulosa, mientras que los géneros que utilizan fuentes de carbono
fácilmente disponibles redujeron su abundancia a < 0,04%. En estudios previos realizados a
15 sistemas de tratamiento de aguas residuales Johnson e t a l . (2014), observaron este
mismos patrón durante los cambios de concentración de carbono y nitrógenos en los
vertimientos. Además, en un sistema ecológico la disponibilidad de nutrientes afecta la
diversidad y la riqueza de las comunidades (Saikaly y Oerther, 2005).
La abundancia total de los géneros de BSR fue del 3,0% y sólo cinco de los diez
géneros encontrados (D esulfovibrio, D esulfom icrobium , D e su lfo b u lb o s , D esu lfo b a cter y
D esu lfo cco cu s ) mostraron una abundancia > 0,5% (Figura 33). Este bajo porcentaje de
BSR fue suficiente para reducir el sulfato en un 60% e incrementar el sulfuro en los
efluentes en >90%, especialmente en los reactores con 4 d de TRH. Estos géneros de BSR
han sido reportados en sistemas donde el ORP es bajo y hay abundantes fuentes de carbono,
también D e su lfo vib rio ha sido clasificado como el sulfato-reductor más abundante en los
sistemas de tratamiento para DAM (Hallberg y Johnson, 2005; Pruden e t a l ., 2007;
Mirjafari e t a l ., 2014). Otro género que incremento su abundancia relativa fue G eobacter ,
su metabolismo se encuentra asociado a la oxidación acetato acoplado a la reducción de
F e 3 en combinación con BSR que consumen el H2(Koschorreck, 2010).
94
Figura 33 Abundancia relativa de géneros dominantes (> 0,5%) presentes en los reactores
pasivos en la semana 17 (2 y 4 d de TRH; A: alto, M: medio y B: bajo).
95
metabolismo de las BSR (Shade e t a l ., 2013; Sánchez-Andrea e t a l ., 2014). Los géneros
D esu lfo b a cter y S edim entibacter fueron más abundantes en la parte media con respecto a la
parte baja de los reactores. Sedim entibacter es un fermentador de aminoácidos a etanol o
ácido acético y ácido butírico, también puede participar en la reducción de Fe+3 en co
cultivo con BSR (Burkhard e t a l ., 2011).
96
Desulfoccocus), Geobacter y el género propuesto WCHB1-05 se agruparon en el segundo
eje donde el Fe y el AVS tienen mayor efecto. Por otro lado, los géneros celulolíticos y
fermentativos como Paludibacter, Luteimonas, Clostridium, Devosia y Agrobacterium se
agrupan sobre el COT que es la variable con mayor influencia, mientras que el género
Sulfuricurvum se encuentra separado de las variables fisicoquímicas, lo que significa que
ellas no explican su presencia en el reactor. En la semana 17 la remoción de los metales
(Fe+2 y Zn+2) por formación de sulfuros metálicos ya se encontraba establecida; sin
embargo, la precipitación de oxi-hidróxidos de hierro continuaba siendo un mecanismo
importante de remoción. Esto favoreció la acumulación de metales en la mezcla reactiva
permitiendo que el hierro fuera una de las variables fisicoquímicas con mayor influencia
sobre la comunidad microbiana durante esta etapa del sistema de tratamiento.
97
La diversidad en la semana 17 se caracterizó por la reducción de la riqueza de los
taxones que utilizan fuentes de carbono fácilmente disponibles y de los taxones funcionales
capaces de utilizar fuentes de carbono complejas. Además, la abundancia de los géneros de
BSR incremento favoreciendo la remoción biológica del sulfato y los metales. Se
observaron diferencias significativas en la diversidad de las alturas del reactor. Los géneros
capaces de reducir sulfato y metales fueron significativamente más abundantes en la parte
baja, mientras que los géneros oxidadores de azufre se ubicaron en la parte alta de los
reactores. El género Treponema continúo siendo el más abundante, sin diferencias
significativas entre las alturas. Por otro lado, el COT, el Fe+2 y el Mn+2 fueron las variables
fisicoquímicas con mayor impacto sobre la comunidad microbiana, esto se encuentra
relacionado con los parámetros de operación del reactor que acumuló Fe en la mezcla
reactiva mientras lixivió Mn en los efluentes.
5.11.7.4 Semana 36
98
5,5 3 ± 1,3) y favorecieron el aumento de la riqueza (Chao 1; 1249,4±60,7), en las muestras
de la mezcla reactiva post-tratamiento, sin diferencias entre los TRHs.
En la semana 36, se presentó efecto significativo (adonis; p < 0,05) del TRH y de
las alturas de los reactores sobre las comunidades microbianas. En el análisis PCoA
utilizando las matrices de presencia/ausencia y abundancia se observó que la comunidad
microbiana se separó en grupos definidos (Figura 36). Las mayores distancias filogenéticas
se observaron entre los taxones de la parte baja del reactor con 1 d de TRH y los de la parte
baja de los reactores con 2 y 4 d de TRHs, mientras que las menores distancias fueron entre
los taxones de la parte alta y media de los tres reactores sin diferencias entre los TRH.
Cuando se utilizaron las matrices de abundancia para el análisis de distancias, se
observaron cinco grupos, cuatro de ellos similares a los del análisis anterior y uno nuevo
conformado por la comunidad de la parte alta de la columna con 4 d de TRH. La diferencia
entre las comunidades de la parte baja de los reactores estuvo asociada a factores
ambientales que afectan la presencia/ausencia de los taxones como el pH y las condiciones
redox, mientras que los microorganismos presentes en la parte alta de las columnas fueron
sensibles a factores que afectan la abundancia como la disponibilidad de nutrientes y la
concentración de metales.
99
El mayor número de OTUS que pudo ser asignado a género en las columnas con 2 y
4 d de TRH fue para Treponem a (8,2%) que redujo su abundancia en la parte baja de los
reactores en comparación con la semana 17 (10,8%), seguido de los OTUS no asignados
(2,0%). En la columna con 1 d de TRH el género más abundante fue A cid ith io b a cillu s
(10,5%) y su presencia estuvo relacionada con el descenso del pH (5,2) de la mezcla
reactiva post-tratamiento en la parte baja del reactor (Figura 37). Las bacterias
pertenecientes a este género son acidófilas, autotróficas que utilizan Fe+2 y S0 como fuente
de energía y son responsables de la disolución y movilización de metales en condiciones
ácidas (Natarajan e t a l ., 2006; Sánchez-Andrea e t a l ., 2014). También, es común
encontrarlas junto con bacterias del género P a lu d ib a cter reconocido como termentador y
presente en ambientes ácidos (Zheng e t a l ., 2014). En la semana 36, también se encontraron
géneros degradadores de celulosa y fermentativos como D evosia, C lostridium , A rtro b a cter
y B a ctero id etes , pero el principal cambio fue el incremento en el porcentaje de abundancia
de los géneros de BSR. Se encontraron ocho géneros de BSR con abundancia relativa >
0,5% pertenecientes al p h y lu m Proteobacteria (Figura 37). El promedio de abundancia
relativa de BSR en las muestras fue de 3,8% y este valor fue consistente con estudios
previos en biorreactores empacados con material ligno-celulósico, donde el porcentaje de
abundancia estuvo entre 2,0 a 5,0% (Hiibel e t a l ., 2011). Sin embargo, el porcentaje de
OTUS asignados a la familia Deltaproteobacteria durante este muestreo fue del 11% y sólo
el 3,8% pudo ser asignado a género, esto indica que tal vez la cantidad de BSR fue mayor y
no fue posible identificarlas por limitación de la técnica illumina. Aunque, en sistemas de
tratamiento de DAM a escala piloto con material lignocelulosico se ha observado que las
BSR representan una baja proporción de la comunidad microbiana (Hallberg y Johnson,
2005).
100
i i Treponema
I I No asignados
WCHB1-05
Desutfovibno
Devosia
Desulfomicrobium
Clostridium
Arthrobacter
Bacteroides
Desulfobulbus
Desulfococcus
Geobacter
Desulfobacca
Desulfomonile
Desulfobacter
Acidithiobacilius
Paludibacter
W22
Luteimonas
i i Agrobacterium
Sphingopyxis
Semana 36
Figura 37 Abundancia relativa de géneros dominantes (> 0,5%) presentes en los reactores
pasivos en la semana 36 (2 y 4 d de TRH; A: alto, M: medio y B: bajo).
101
Figura 38 Comparaciones de la abundancia de los géneros significativamente diferentes
entre los capas alto (A), medio (M) y bajo (B) de los biorreactores con 2 y 4 d de TRH en la
semana 36. La significancia se determinó mediante la prueba t-test Welch's paramétrica
corregida por Benjamin-FDR
102
el pH también afectan la proporción de compuestos producidos en los biorreactores,
Horiuchi e t al. (2002) encontró que en biorreactores anaerobios para tratamientos de lodos
a pH entre 5,0 - 6,0 se generaba acetato y butirato, mientras que a pH > 7,0 se producía
propionato y acetato, beneficiando a las BSR. Con respecto a los SAV, en la semana 36 los
reactores se encuentran formando sulfuros metálicos que depositados sobre la superficie de
los microorganismos previenen el contacto de la célula con el carbono orgánico, inhibiendo
los aceptores de electrones y la actividad enzimática (Utgikar e t al., 2002).
103
encuentra relacionada con los parámetros de operación, la disponibilidad de nutrientes y los
mecanismos de remoción de metales y sulfato.
Desu ¡fomicrobium
COI
Arthrobt
WCHB1-05
Desulfovibrio Desmfobacca
Desulfobacter Otros
Sulfato,
SFD
Eje 1 (25,2)
104
géneros con una abundancia relativa > 0,2% identificados con la técnica de secuenciación
de illumina (Figura 40).
Los biorreactores pasivos fueron empacados con una mezcla de substratos organicos
(estiércol, compos de champiñón y aserrín) que fueron degradados en condiciones
anerobias para producir compuestos de bajo peso molecular La primera etapa fue la
hidrólisis de biopolimeros (p.e., celulosa, hemicelulosa, ácidos nucleicos, grasa, proteinas)
por acción de enzimas celulolíticas, proteolíticas y lipoliticas presentes en microorganismos
105
degradadores e hidroliticos de géneros como: C lostridium , B a ctero id es , P a lu d ib a cter ,
L u teim o n a s A g ro b a cter y Spingobacterium . Durante esta etapa se generaron monómeros
(p.e., celobiosa, glucosa, aminoácidos) que fueron fermentados por bacterias de los géneros
A cetobacter, Treponem a, Syntrophobacter, Syntrophom onas, Syntrophobotulus y
C oproterm obacter para originar ácidos grasos (acetato, propionato, butirato, succinato),
alcoholes (etanol y metanol), H2 y CO2. Inmediatamente todo el H2 producido fue
consumido por las BSR, favoreciendo la presencia de géneros sintrofos (Syntrophobacter,
Syntrophom onas, Syntrophobotulus ) que oxidaron los ácidos grasos hasta acetato e H 2
(Madigan e t a l ., 2002; Muyzer y Stams, 2008).
106
para tratamiento de DAM y en sistemas bioelectroquimicos acoplados a sulfato (Burns et
al., 2012; Zheng et al., 2014).
Puerto de muestreo
6 cm
G ravi a
7 ,4 1 0 ,3
NO
S u lfu ric u rv u m \
Comámonos
S u lfu n c u rv u m
no 2
(C r^ O Jn
H,0
D e su lfo m a cu lu m C ostridium
D e su ífo vib rio Bacteroides
D esu lfo b u ib u s Pa u d tb o c te r
L u te jm o n a s
S p h in g o b a c te riu m
63 c m 7,1 Í 0 , 9
M e z c la
Monomeros
R ea ctiv a
Desulfomonile ’A ceto b a cte r
D esulfococcus
J Syn trob acter
D esulfom icrobium
Treponem o
D esu lfobacter
C oproterm obocter
D esulfobacca
Acetato
FeS
DAM
pH 3,0 - 3,5 P seudom onaj
MnCU
G e o b a c te r
Fe 200 mg/L
Zn 18 mg/L
A c id io th io b a c i us
Mn 31,5 mg/L
OD 6,2 mg/L
Sulfatos 2500 mg/L 7 cm 5,810,9
Gra vi a
Figura 40 Modelo biogeoquímico propuesto en los reactores pasivos en la semana 36, los
géneros con una abundancia relativa >0,2% implicitos en el ciclo del azufre y carbono
107
(azul), hierro (café), se indican junto a las flechas, las reacciones químicas no mediadas por
microorganismos se representan en rojo.
108
6 CONCLUSIONES
El presente estudio logró con éxito los objetivos propuestos. Basándose en los resultados se
obtuvieron las siguientes conclusiones:
Diseñar un biorreactor pasivo teniendo en cuenta las condiciones del DAM y materia
orgánica disponible en el distrito minero de Zipaquirá.
Evaluar el efecto del TRH sobre la eficiencia del biorreactor pasivo para remediar el
DAM del distrito minero de Zipaquirá.
109
Evaluar el efecto del TRH sobre la mezcla reactiva post-tratamiento durante la
biorremediación del DAM.
110
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124
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125
AnexoA C urvas de calibración de los análisis de m etales (Fe, M n y Z n), sulfatos y sulfuros.
Hierro Total Manganeso
Absorbancia (248.3 nm)
Sulfatos Zinc
Absorbancia (420 nm)
Sulfuros solubles
A b s o rb a n c ia (6 6 4 n m )
S u lfu ro (m g /L )
126
Anexo B Physicochemical and microbiological characterization of organic substrates
Objective
• Characterize organic substrates for their potential ability as organic carbon sources
(electron donors) for the sulfate-reducing bacteria community (SRB) during
treatment of acid mine drainage (AMD) in passive bioreactors.
• Characterize the sulfate reduction bacteria during the treatment of acid mine
drainage in passive bioreactor.
For this purpose, cellulosic wastes (Sajo sawdust, Kikuyu silage, paper industry) and
organic wastes (mushroom compost, cow manure, poultry manure) will be thoroughly
analyzed in terms of physicochemical parameters, elemental analysis, biodegradability and
metal operational speciation. All of the analysis will be performed in duplicate.
Sampling of organic substrates
• Collect cellulosic substrates (Sajo sawdust, Kikuyu silage, and paper industry) and
organic substrates (mushroom compost, cow manure and chicken manure) on
available locations (e.g. local farms and/or furniture factory).
Storage of organic substrates
• Cut kikuyu silage and into small pieces (less than1cm), and sieve the other
substrates a No 10 sieve (2 mm).
• Pack the substrates in Ziploc bags.
• Identify the bags with the following data:
o Substrate class
o Project name
o Responsible person
o Collect date
o Storage date
o Type of analysis
• Store the substrates in refrigerator before their analysis.
pH Method 4972 - 01 (ASTM, 1995)
• Caliber the pH meter with buffer solutions (pH 4.0, 7.0 and 10.0).
• Weight 20.0 g of substrate into a beaker.
• Add 20 mL of deionized water (18.8 MQ cm).
• Mix thoroughly for 5 min and let stand for 1 h.
• Place the pH electrode into the partially settled suspension.
• Record the data when the measurement is stable
Moisture Method D 2216 - 98 (ASTM, 1995)
• Preparation of material
o Select a porcelain evaporating dish and identify it correctly.
127
o Place porcelain evaporating dish in the oven for 15 min at 105±5°C.
o Place porcelain evaporating in the desiccator and allow the cooling for 1h.
• Analysis the substrate
o Weight 20.0 g of substrate and place it on the porcelain evaporating dish.
o Place the porcelain evaporating with substrate in the drying oven.
o Dry the substrate at least 20 h maintains temperature at 105± 5°C.
o Place the porcelain evaporating with dry substrate in the desiccator and allow
the cooling.
o Determine the mass.
o Repeat heating for 1 h and allow the cooling in the desiccator.
o Determine the mass (the change in the weight must be less than 4% or 50 mg,
otherwise it repeat again heating for 1 h.)
o Conserve the residue in order to determine Total Volatile Solids.
Total organic carbón (TOC) Method 5310 B (APHA, 2005)
• Sample preparation
o Crush in a mechanical mill 10.0 g of substrate and sieve it through mesh No
100
o Pack the substrates in Ziploc bags and identify the bags as in section 3.2
o Store the bags in refrigerator before their analysis
• Send to a private laboratory for analysis by high temperature combustion to 680°C.
Total Kjeldal Nitrogen (TKN) Method 4500-Norg (APHA (2005)
• Place 0.2 g of substrate in a Kjeldahl digestion tube (dry)
• Add 50 mL of reactive digestion reagent (134g K2SO4, 7.5 g CuSO4,134 ml H2SO4
and complete with distilled water 1L)
• Mix content (carefully) and place the flask on Kjeldahl rack and add 2mL of H2SO4.
• Set temperature moderate (180°C) for boiling a digestion of the substrate for aprox
1h: 30 minutes (observe the appearance of white smoke).
• Increase heat (less than 338°C) to a rapid boil until complete digestion of the
substrate, approximately 20 min.
• Allow mixture to cool at room temperature.
• Add (carefully) 50 ml deionized water into flask, swirl to dissolve crystals.
• Add 25 mL of solution the NaOH (50%) and Na2S2O3(5%) into flask and swirl.
• Place the flask on distillation rack with stopper securely.
• Add in an Erlenmeyer flasks 20 mL de H 3BO3 with 4% containing Tashiro
indicator.
• Place the Erlenmeyer flasks on Kjeldahl distillation rack.
• Start the distillation with moderate boiling (less than 100°C) until obtaining 50 ml
the distillate (color should be green or dark blue).
• Allow distillate to cool.
• Titrate with 0.1N H2SO4 until solution becomes clear and then turns pink.
• Prepare and treat a blank the same manner except that Kjeldahl digestion flask must
be free of sample.
128
Dissolved organic carbón (DOC) Method 5310 B (APHA, 2005)
• Preparation of material
o Wash an amber bottle glass with cap with 5% soap biodegradable and lots of
water.
o Place the amber bottle glass and the cap submerged in solution 1% HNO3
into plastic container for 24h.
o Rinse the bottle and the cap with lots deionized water.
o Dry the bottle in oven at 400°C for 1 h.
o Wrap the cap with aluminum foil and dry in oven at 100°C for 1 h.
• Preparation in aqueous extract, as per Zagury et al., (2006)
o Weight 20.0 g of substrate into the beaker.
o Add 200 mL of deionized water (18.8 MQ cm).
o Shake the suspension for 2 h at room temperature.
o Centrifuge the suspension (10000g) for 10 min.
o Filter (0.45 pm) the supernatant and place into the amber bottle glass.
o Add to sample 1 mL of H2SO4 for preservation.
o Preserve samples that cannot be analyzed immediately by conserving them
at 4°C.
• Send to a private laboratory for analysis by high temperature combustion to 680°C.
Lignin and Cellulose Method of successive extractions as per Harper y Lynch (1981)
• Sample preparation
o Prepare a gooch crucible as described in the section 3.3.2 (preparation of
material)
o Place into a beaker 1.0 g of substrate and add 80 mL of deionized water.
o Boil the beaker gently (75°C) for 1 h, preventing dry.
o Change the water and boiled again (less than 100°C) for 1 h.
o Transfers all of the content of beaker into the gooch crucible.
o Rinse the substrate once with cold water.
o Dry the gooch crucible in the over for 20 h a 60± 5°C.
o Place the gooch crucible a desiccator allow the cooling.
o Determine the mass.•
• Lignin
o Transfer all of substrate the gooch crucible into the beaker.
o Add 30 mL water, 2 mL 10 % aqueous acetic acid and 0.6 g sodium chlorite.
o Boil the beaker gently (75°C) for 1 h, preventing dry.
o Add again 2 mL 10 % aqueous acetic and 0.6 g sodium chlorite.
o Boils (at less than 100°C) the beaker with the mixture for 1 h.
o Remove the substrate from beaker and transfer it the gooch crucible.
o Rinse with deionized water (five times), acetone (twice) and ether (once).
o Dry in the oven at 105±5°C for 2 h.
o Place the gooch crucible a desiccator allow the cooling.
o Determine the mass.
129
o Preserve the residue in order to determine cellulose.
• Cellulose
o Transfer all of substrate the gooch crucible into the beaker.
o Add 20 mL 24% KOH and leave it at room temperature for 2 h.
o Transfer of substrate into the gooch crucible.
o Rinse with deionized water (five times), 5% aqueous acetic acid (once),
acetone (once) and ether (once).
o Dry in the oven at 105±5°C for 2 h.
o Cool the gooch crucible in a desiccator.
o Determine the mass.
Total volatile solids (TVS) Method 1684 (USEPA, 2001)
• Place a crucible in the muffle furnace at 550± 50°C for 1 h.
• Place the crucible in a desiccator and allow the cooling for 1h.
• Determine the mass.
• Transfer into crucible the dry substrate (obtained in section 3.3.2)
• Determine the mass.
• Place the crucible with dry substrate in the muffle furnace.
• Heat at 550°C±50°C for 2 h.
• Place the gooch crucible a desiccator allows the cooling for 1h.
• Determine the mass.
• Repeat heat 550°C±50°C for 30 min.
• Cool the gooch crucible in a desiccator.
• Determine the mass.
• Repeat steps until the weight change is less than 4% or 50 mg.
Easily available substances (EAS) Method forage fiber analysis as per Zagury e t a l .
(2006) modified from Prasad e t a l . (1999).
• Prepared a gooch crucible as described in the section 3.2.2 (preparation of material)
• Weight 1.0 g of substrate.
• Transfer the substrate into gooch crucible.
• Determine the mass.
• Rinse the substrate with acetone (twice) and water (once).
• Dry in the oven at 105 ±5°C for 12 h.
• Cool in a desiccator.
• Determine the mass.
• Transfer the dry substrate into the beaker.
• Add 30 mL 5% Hydrochloric acid.
• Boiled gently (less than 100°C) for 1 h, preventing dry.
• Transfers all of the content the beaker into the gooch crucible.
• Rinse with cold water (five times).
130
Place the gooch crucible in the oven for 12 h a 60± 5°C.
• Place the gooch crucible a desiccator allow the cooling
• Determine the mass.
• Consider the mass loss as EAS fraction.
Metal operational speciation Method sequential extraction procedure (SEP) as per Zagury
et al. (1997) modified from Tessier et al. (1979).
• Sample preparation
o Prepare the evaporating dish as described in the section 3.2.2 (preparation of
material).
o Weight 1.0 g of substrate and place it on the porcelain evaporating dish.
o Dry the substrate for 2 h maintains temperature at 105± 5°C.
o Place the evaporating dish with dry substrate in the desiccator and allow the
cooling.
o Determine the mass.
• Fraction 1. Soluble and exchangeable metals
o Transfer the dry substrate in centrifuge tubes (50 mL),
o Add 8 mL 1M MgCl2 and adjust the pH 7.0 with HCl.
o Leave the mixture at room temperature (21±2°C) for 1 h.
o Centrifuge the mixture (10,000g) for 30 min.
o Transfer the supernatant in a vial (50 mL) and retain the residue (i).
o Add in centrifuge tubes 8 mL deionized water
o Centrifuge (10,000g) for 30 min.
o Transfer the supernatant into the vial with initial extract.
• Fraction 2. Bound to Carbonates
o Add on residue (i) 8 mL of 1 M NaOAc.
o Adjust the pH 5.0 with HOAc.
o Shake for 5 h at room temperature (21±2°C).
o Centrifuge, wash the residue and retain the supernatant as the fraction 1.
• Fraction 3. Bound to Iron and Manganese Oxides
o Add on residue (ii) 20 mL of 0.04M NH2OH-HCl in 25% (v/v) HOAc.
o Heat at 96±3°C and agitate occasionally for 6 h.
o Centrifuge, wash the residue and retain the supernatant as the fraction 1.
• Fraction 4. Bound to organic matter
o Add on residue (iii) 3 mL of 0.02 M HN03 and 5 mL of 30% (v/v) H2O2.
o Adjust to pH 2.0 with HN03.
o Heat at 85°C±3°C for 2h with occasional agitation.
o Add again 30 mL of 30% (v/v) H2O2.
o Adjust to pH 2.0 with HOAc.
o Heat at 85°C±3°C for 3h with occasional agitation.
o Allow cool to room temperature.
o Add 5 mL 3.2M NH4OAC in 20% (v/v) of HN03 and 20 mL the deionized
water.
o Centrifuge, wash the residue and retain the supernatant as the fraction 1.
131
• Fraction 5. Residual
o Add on residue (iv) 15 mL of HNO3 .
o Heat at 75°C±3°C for 50 min.
o Add 20 mL HCLO4 and 1 mL HF.
o Heat at 75°C±3°C for 2.5 h.
o Allow cooling and dilute the supernatant to 100 mL
• Analysis the fractions
o Filter (0.45 pm) of supernatants the each fraction.
o Adjust pH 2.0 with 1 mL of HN03 .
o Preserve samples that cannot be analyzed immediately by conserving them at
4°C.
o Analyze Fe, Zn, Mn, Ca, and Mg by flame atomic absorption
spectrophotometry.
Soluble Sulfate Use the method of the S extracted in HCl (37%, v/v) as per Sobek et al.
(1978)
• Sample preparation
o Crush 5 g of each substrate and sieve in mesh 60 (0.25 mm)
o Pack the substrates in Ziploc bags and identify the bags as in section 3.2.
o Store in refrigerator before its analysis.
• Analyzing the substrate
o Weight 1.0 g the substrate and place it into an erlenmeyer (100 mL)
o Add 50 mL the HCL 40%.
o Shake during 1 h at room temperature.
o Filter (0.45 mm) with empty, rinsing with 75 mL of deionized water
o Transfer the fíltrate into a ball volumetric (500 mL)
o Adjust the volume up to the mark (the concentration will be 10% HCL).
o Analyze soluble sulfate by indirect atomic absorption spectrophotometry
(Galindo, 1969).
Most probable number (MPN) Method D4412 - 84 for Sulfate-reducing bacteria (SRB)
in water and water formed deposits (ASTM, 2009).
• Sterilization of materials at 170 ° C for 2 h
o Pipets (1mL and 5mL)
o Test tubes with screw caps (16 by 150 mm and 20 by 150 mm)
o Lab bottle, screw top blue lid (500 mL and 1000 mL)
o Pipette tips
o Erlenmeyer of 1 L
• Sterilization of materials by UV
o Flow chamber
o Micropipettes (0,25 mL, 0,5mL and 1mL)
o Vortex
• Preparation distilled water anoxic
132
o Place 1.25 L of distilled water into the erlenmeyer
o Cover with a aluminum foil and make two holes with a needle
o Allow water boils until the volume is 1L
o Bubble N2(g) until the water is cold.
o Keep covered the Erlenmeyer with the aluminum foil.
• Preparation of saline solution
o Add 8.5 g of NaCl, 0.5 g of cisteína-HCl in 1.25 L of distilled water
o Repeat the procedure for the anoxic water
• Preparation of the Starkey’s médium
o Adding the following reagents in lab bottle, screw top blue lid
■ 1L of anoxic water
■ Sodium lactate (C3H5NaO3) 3.5 g
■ Ammonium chloride (NH4Cl) 1.0 g
■ Dipotassium, hydrogen orthophosphate (K2HPO4) 0.5 g
■ Magnesium sulfate (MgSO4 7H2O) 2.0 g
■ Sodium sulfate (Na2SO4) 0.5 g
■ Calcium chloride (CaCl2 2H2O) 0.1 g
■ Thioglycollic acid 0.1 g
■ Ammonium ferrous sulfate ((NH4)2SO4 FeSO4 6H2O) 0.001 g
o Sterilize in autoclave at 121°C for 15 min
o Adjust to pH 7.0 with (KOH) 1N
• Preparation of test tubes with screw caps (work within the flow chamber)
o Dispense 9 mL of Starkey’s médium in 5 tubes (A )
o Dispense 9.9 mL of Starkey’s médium in 5 tubes (B )
o Dispense 9.99 mL of Starkey’s médium in 5 tubes (C )
o Dispense 10 mL of Starkey’s medium in 1 tube (blank).
o Correctly mark each series of tubes
o Keep capped tubes
• Preparation of sample
o Reactive mixture sample (work within the anaerobic chamber)
■ Weight 1.0 g of substrate in anaerobic conditions
■ Place the sample into the sterile glass bottles and screw caps (50 mL)
and Bubble N2(g) for 5 min.
■ Add 9 mL of saline solution and Bubble N2(g) for 5 min and cap the
bottle.
■ Shake the suspension for 2 h at room temperature.
o Effluent sample (work within the anaerobic chamber)
■ Filter (1.2 pm) 10 mL of sample.
■ Place into the sterile tube and Bubble N2(g) for 5 min.
• Inoculation (work within the flow chamber)
o Add 1 mL the sample into of the tubes mark with A
133
o Bubble N2(g) into tube for 5 min and cap.
o Add 0.1 mL the sample into of the tubes mark with B .
o Bubble N2(g) into tube for 5 min and cap.
o Add 0.01 mL the sample into of the tubes mark with C .
o Bubble N2(g) into tube for 5 min and cap.
• Incubation
o Place of tubes in incubate at 20°C for 21 days
o Positive reaction is indicated by the deposit of a black precipitate (sulfide).
• verification (When the presence of the precipitate was not obvious)
o Ferric Chloride Solution
■ Weight 13.5 g of ferric chloride
■ Add 250 mL of water and 250 mL of HCl
■ Store in a bottle amber.
o p-Aminodimethylaniline Dihydrochloride Solution
■ Weight 1.0 g of p-aminodimethylaniline dihydrochloride
■ Add 500 mL of 6 N HCl
■ Store in a bottle amber.
o Confirm (tube with dubious results)
■ Add in the bottom of the tube 0.5 mL of solution ferric chloride and
0.5 mL of p-aminodimethylaniline
■ Wait for 10 minutes and see a positive reaction, blue color indicating
that H2S is present.
Summary of methods
134
Anexo C Evaluation of the effectiveness of reactive mixture in batch testing
Objective
Evalúate different organic carbón sources (mushroom compost, cow manure, poultry
manure, Sajo sawdust, Kikuyu silage) for their capacity to promote pH and alkalinity
increasing, sulfate reduction, and metal precipitation in synthetic acid mine drainage
(AMD).
The study is performed with five reactive mixtures in batch bioreactors, made in glass
bottles (2L) and operated under anaerobic conditions for 44 days. Treatment is based on
chemical and biological processes, the late relying on sulfate-reducing bacteria (SRB)
ability to catalyze sulfate reduction (to hydrogen sulfide) in AMD and organic carbon
oxidation (to bicarbonate). Metals removal mechanisms include the precipitation as bio-
sulfides, hydroxides and carbonates, in addition to sorption. All of the analysis will be
performed in triplicate.
Synthetic AMD is prepared as per Zagury et al. (2006), the quality is based on data
collected from different sites located in the mining district of Zipaquirá (Colombia).
135
Batch testing preparation
The reactive mixtures (250 g wet basis) with synthetic AMD (1L) in proportion for a
solid to liquid 1:4 are placed in glass bottles (2L), sealed with a rubber stopper and valve
with two sampling ports and left under a nitrogen atmosphere at room temperature (20-
25°C), in the dark during 44 d. The inoculum with sulfate-reducing bacteria (SRB) is
collected from a local artificial wetland used for AMD treatment in the mining district of
Zipaquirá.
• Start the preparation of artificial AMD two day before the batch bioreactors set-up.
• Prepare glass bottles wrapping with aluminum foil and with rubber stopper and
valve with two sampling ports.
• Clearly label each batch bioreactors with the mixture number, replica and date.
• Weight the components the reactive mixture #1.
• Place the components in the plastic container and mix them trying to homogenize.
• Place the reactive mixture #1into a bottle (2L).
• Add 1L of artificial AMD and close with the rubber stopper.
• Apply N2 (g) for one sampling ports during 15 min leaving the other sampling ports
slightly open.
• Close the sampling ports and shake the bottles for the thorough mixing of
components.
• Repeat the same steps for every reactive mixture.
• Leave the reactors in the dark at room temperature to promote the development of
BSR.
• Review daily the reactors until feel a strong smell of H2S.
• Start sampling and analysis.
Sampling and analysis
Sampling is performed during six weeks in each batch bioreactors under anaerobic
conditions N2 (g).
• Connect the syringe to the one sampling port and the N2(g) in other port.
• Open the nitrogen valve and simultaneously remove the sampling into the syringe
(50mL).
136
• Place 20 mL into the beaker for determínate pH, ORP, and DO.
• Filter 10 mL of sample to determine sulfides for spectrometry UV-VIS.
• Filter (0.45pm) 10 mL and add 200 pL the HNO3 for analysis of metals (Fe+2/+3,
Mn+2, Zn+2, Ca+2, Mg+2) by Atomic absorption spectrometry.
• Filter (0.45pm) 10 mL for analysis of sulfate by spectrometry UV-VIS.
• Place 10 mL into the into the glass tube for the determinate alkalinity.
• Repeat the same steps for every bioreactor.
Summary of methods
137
Anexo D Set-up and operation of column bioreactors for the passive treatment of AMD
Objective
The constituents and their proportion in the composition of the reactive mixtures are based
on batch test results, as well as on additional literature (Neculita et al., 2011, Neculita and
Zagury, 2008).
• Reactive mixture preparation
o Prepare 300.0g the reactive mixtures (table 1) into the plastic container
according to the instructions of the protocol # 2.
o Weight the metallic container.
o Place the reactive mixture into the metallic container.
o Dry the reactive mixture at 105± 5°C for 24 h.
o Place the metallic container with reactive mixture in the desiccators and
allow the cooling for 2h.
o Determine the mass (W¡).
o Blend the reactive mixture with a sufficient quantity of distilled water that
the mixture is wet.
Hydraulic Permeability and conductivity measurement Method for Permeability of
Granular Soils (Constant Head) D2434 (ASTM, 2000).
• Assembly the permeameter
o Measure the inside diameter of upper and lower chambers (five times).
o Calculate the average inside diameter of the permeameter (D).
o Place one porous stone on the inner support ring in the base of the chamber.
o Place a filter paper on top of the porous stone.
o Place the wet reactive mixture into the lower chamber using a scoop to fill it
to a depth of 1.5 cm.
o Compact the gravel layer slightly with a metallic pestle.
138
o Continué placing layers of mixture until cylinder to the mark.
o Use the tamping device to compact always put a new layer.
o Place a filter paper in level the top surface of the mixture and then the upper
porous stone.
o Measure the reactive mixture length into of the permeameter (five times).
o Record this data as the reactive mixture length (H).
o Place the compression spring on the porous stone.
o Secure the cap firmly with the cap nuts.
o Connect the vacuum pump in the inlet tube the permeameter with the outlet
valve closed.
o Turn on and adjust vacuum pump at 500 mm Hg 15 min (remove air trapped
in the reactive mixture).
o Connect the outlet valve with water dispenser.
o Open the outlet valve and turn on back the vacuum pump at 500 mm Hg.
o Keep the connection until the reactive mixture has been saturated and the
permeameter is full of water.
o Close the outlet valve and disconnect the vacuum.
o Fill slightly the piezometer tubes with water from the constant-head tank.
o Connect the piezometer tubes of the permeameter.
o Close the inlet valve and open the outlet valve
o Allow the water in the piezometer tubes to reach their stable water level
under zero head.
Measure the permeability
o Open inlet valve (slightly) until the water load is stable in the piezometer
tubes.
o Check the difference the difference in level the water in the piezometer
tubes and record (h).
o Open the outlet valve and collected the water in the test tube while
measuring the time.
o Determine the flow (Q) and measure water temperature.
o Determine distance between piezometer tubes (L).
o Calculate the hydraulic permeability with of Darcy’s law
Porosity measurement
• Place the reactive mixture leftover in the assembly the permeameter in the oven at
105± 5°C for 24 h.
• Place the metallic container with reactive mixture in the desiccator and allow the
cooling.
• Determine the mass dry (W2)
• Determine the mass the reactive mixture dry used in the assembly the permeameter
(Wi- W2).
• Calculate the volume of the mixture reactive wet used in the assembly the permeameter
with diameter (D) and height (H).
• Determine the void volume considering a specific gravity (Gs) of 0.7, similar to peat.
139
• Determine porosity as the ratio between void volume and total volume of the reactive
mixture wet.
Columns set-up Protocol as per Neculita et al. (2008).
• Previous activities
o Calculate flow of AMD that enters the column according to HRT of 2 d and 4 d
(consider the porosity and volume of reactive mixture).
o Calibrate peristaltic pumps collecting a volume or mass of deionized water per
unit of time.
o Start the preparation of 5L of AMD for each column artificial two day before
the column set-up, according to protocol #2.
o Determine the moisture of organic and cellulosic substrates one day before,
according section 3.3.2 of the protocol #1.
o Prepare 10 kg the reactive mixtures for each column into the plastic container
according to the instructions of the protocol # 2.
o Homogenize the reactive mixture thoroughly.
o Fill with water the columns and check leaks.
o Adapt the place where they will be placed within the next 6 months.
140
o Leave the reactors in the dark at room temperature to promote the development
of sulfate-reducing bacteria (SRB).
o Check the ORP once a week until the value is <-150 mV
• Repeat same manipulations for each column.
Column operation
• Prepare synthetic AMD volume for a week with based in flow calculated in the section
3.2.2 (previous activities).
• Connected the peristaltic pumps with the top valve of the column.
• Connected the AMD reservoir with the peristaltic pump.
• Connected the bottom valve with the plastic container where will collect the treated
AMD.
• Start the column feed through the peristaltic pump.
• After the establishment of reducing conditions, columns will be operated during at least
6 months.
Sampling and analysis
The sampling will be performed through a second bottom valve that allows the collection
50 mL of AMD for instantaneous analysis at room temperature, the frequency is presented
in Table 2.
141
• Remove carefully the first 20 cm of the reactive mixture
• Divide the sample into six parts randomly and place them in Ziploc bags.
• Identify the bags as described in section 3.2 of the protocol #1.
• Store threes bag at -80°C for biomolecular analyses for duplicate (Sequencing-
Ilumina and SRB for q-PCR) according to protocol #4.
• Store threes bag at 4°C for physicochemical analyses for duplicate (TOC, N-TKN,
EAS, cellulose and lignin) according to protocol #1.
• Repeat same manipulations for the middle and bottom layer the reactive mixture.
• Remove the porous plates, the geotextile and the last layer of gravel.
• Dispose residues properly according to laboratory safety norms.
142
Anexo E Microbiological characterization for Illumina® sequencing
OBJETIVOS
Characterize the microbial community during the treatment of acid mine drainage in
passive bioreactor.
The study will be performed in six sulfate reducing bioreactors made in Plexiglas columns,
(length 72 cm, with inner diameter 10 cm, volume 6 L), under two HRT (2 d and 4 d), for at
least 24 weeks. The sulfate reducing bacteria (SRB) will be monitored in the effluent
through the technique of most probable number (MPN) and Real-time quantitative PCR
(qPCR) once a month. Furthermore a column for each THR will be dismantled, at end of
period of establishment, during steady state and stage decline along of 24 weeks in order to
characterize in the reactive mixture SRB by q-PCR and the bacterial community for
technique Illumina® Solexa Sequencing.
Illumina® sequencing
Caporaso et al. (2012) and lecture notes provided from Saenz J. (2103)
The principle is based on a small fragment of DNA are sequentially identified from signals
emitted as each fragment is re-synthesized from a DNA template strand. This advance
enables rapid sequencing of large stretches of DNA base pairs spanning entire genomes,
with the latest instruments capable of producing hundreds of gigabases of data in a single
sequencing run. (www.illumina.com/NGS).
Preparation of sample
• Remove a bags sample stored at -80°C for molecular analyses.
• Allow come to room temperature.
• Weight 10 g de sample for DNA extraction.
DNA extraction
The extraction will be performed using the Max Power Soil DNA Isolation Kit (MO BIO,
Carlsbad, CA), according to the manufacturer’s protocol.
o Storing DNA frozen at-80°C.
Quantification of DNA
The quantification will be performed using the Qubit™ dsDNA BR Assay Kit (introvigen),
according to the manufacturer’s protocol.
143
• Preparation of Qubit™ working solution (for one DNA extract and two standards)
o Add into the Qubit™ assay tubes 597 pL of Qubit™ buffer and 3 pL of
Qubit™ reagent plus.
o Add 199 pL of Qubit™ buffer working solution into each of the tubes used
for two standards.
o Add 1 pL of each Qubit™ standard to the appropriate tube.
o Label the tubes lids.
o Add 197 pL of Qubit™ working solution into tube used for DNA extract.
o Add 3 pL of DNA extract to the appropriate tube.
o Label the tube lid.
o Mix all tubes in vortex during 3 sec (not to create bubbles).
o Allow all tubes to incubate at room temperature for 2 minutes.
• Determine the DNA concentration and standards by the Qubit® 2.0 Fluorometer.
• Storing DNA frozen at-80°C
The V4 region of the 16S rRNA gene will be amplified using 515F and
806Rprimers, developed as per Caporaso y Lauber, (2011). The PCR will be made
in two steps (Table 2) according to the number of thermocycler wells (96) and for
each DNA sample must perform three amplifications.
• Preparation of the Polymerase Chain Reaction (PCR) mixture for 20 sampling with
three amplifications for sample.
o Add into the Eppendorf tube of 2 ml the reagents for sixty amplifications
(Table 3), maintain in ice bath.
o Mix the contents of the tube and ensure it is all in the bottom
o Mark the tubes of PCR (0,2 mL) for 20 samples each with three
amplifications
o Divide mixture (1620 pL) in 60 tubes of PCR in equal amounts (26.1 pL
either one)
o Check that the content of the tube is at the bottom.
144
o Add 3.3 pL of ADN sample (normalized according 2.3.4) to each tube of
the three amplifications, the final concentration of ADN in the mixture is
10 ng.
o Add 0.6 pL of forward primer (mixture of 3' Illumina adapter/ Golay
barcode / reverse primer pad / reverse primer linker/ reverse primer) to
each tube of the three amplifications.
o The final volume for each PCR tube is 30 pL, maintain in ice bath
o Place the tubes in the thermocycler.
• Amplification
o Program the thermocycler with the following information
■ Denature the DNA held at 94°C for 3 min
■ Amplification proceeding for 30 cycles at 94 °C for 45 s, 50 °C
for 60 s, and 72 °C for 90 s
■ Final extension for 10 min at 68 °C.
145
• Loading Samples
o Mix 2 pL of loading buffer dye with 3 pL of samples PCR amplified.
o Place the agarose gel into the gel box (electrophoresis unit with 25
wells).
o Fill gel box with TAE 1X until the gel is covered.
o Carefully load a molecular weight ladder into the first lane of the gel.
o Carefully load your samples into the additional wells of the gel.
• Run the gel at 80-150V until the dye line is approximately 75-80% of the way
down the gel.
• Disconnect the electrodes from the power source.
• Remove the gel from the gel box.
• Using UV light to visualize DNA fragments.
• Check that the three amplicons are the same size (about 350 pb), otherwise it
repeat amplification for this sample.
• Mixing the three tubes of each amplification.
Amplicons cleaning
146
Anexo F C aracterización fisicoquím ica del D A M presente en siete m inas activas del
distrito m inero de Zipaquirá.
147
Anexo G R epresentación gráfica de la calidad de las secuencias.
Illum ina para la evaluación del efecto del T R H sobre la diversidad m icrobiana. El
A. F o r w a r d
B. R e v e r s e
148
Anexo H C om unidad m icrobiana total encontrada los reactores pasivos que operaron
durante 36 sem anas con tres T R H (1, 2 y 4 d).
Acidimicrobiales Microbacteriaceae
Actinobacteria
Actinobacteria Micrococcaceae Arthrobacter
Micromonosporaceae
Mycobacteriaceae Mycobacterium
Nocardiaceae Rhodococcus
Nocardioidaceae
Yaniellaceae Yaniella
Bacteria WCHB1-81 At425 EubF1
Coriobacteriia Coriobacteriales Coriobacteriaceae
BA008
Bacteroidaceae BF311
Bacteroides
Marinilabiaceae
Bacteroidia Bacteroidales
Porphyromonadaceae
Paludibacter
Rikenellaceae Blvii28
Bacteroidetes SB-1
p-2534-18B5
Cyclobacteriaceae
Cytophagia Cytophagales
Cytophagaceae
Leadbetterella
Cryomorphaceae Fluviicola
Flavobacteriia Flavobacteriales
Flavobacteriaceae
Flavobacterium
149
Phylum Class Order Family Genus
Flavobacteriaceae Gelidibacter
Flavobacteriia Flavobacteriales
[Weeksellaceae] Chryseobacterium
Wautersiella
Bacteroidete
Sphingobacteriia Sphingobacteriales Sphingobacteriaceae Pedobacter
Sphingobacterium
[Saprospirae] [Saprospirales] Chitinophagaceae
Ignavibacteriaceae
Chlorobi Ignavibacteria Ignavibacteriales [Melioribacteraceae]
lheB3-7
Anaerolinea
C1_B004
Anaerolineales Anaerolinaceae Longilinea
Anaerolineae SHD-231
Chloroflexi
T78
WCHB1-05
A4b
SBR1031
SHA-31
Bacteria
Dehalococcoidetes Dehalococcoidales Dehalococcoidaceae
Fibrobactere TG3 TG3-1 TSCOR003-O20
Alicyclobacillaceae
Bacillaceae
Bacillus
Bacillales Lysinibacillus
Planococcaceae
Solibacillus
Bacilli Sporolactobacillaceae Sporolactobacillus
[Exiguobacteraceae]
Clostridia Clostridiales
Clostridiaceae Clostridium
Proteiniclasticum
SMB53
150
Phylum Class Order Family Genus
Dehalobacteriaceae Dehalobacterium
Eubacteriaceae Acetobacterium
Anaerofustis
Gracilibacteraceae Gracilibacter
Lachnospiraceae
Coprococcus
Dehalobacter
Syntrophobotulus
Peptococcaceae
Desulfosporosinus
Desulfurispora
Clostridiales Peptostreptococcaceae
Clostridia
Firmicutes Ruminococcaceae
Oscillospira
Veillonellaceae Megasphaera
Pectinatus
Bacteria Phascolarctobacter
ium
[Mogibacteriaceae]
Anaerovorax
[Tissierellaceae] Sedimentibacter
Thermoanaerobacter
Thermodesulfobiaceae Coprothermobacter
ales
Brevundimonas
Alphaproteobacte Caulobacterales Caulobacteraceae
Proteobacteria Mycoplana
ria
Phenylobacterium
Rhizobiales Beijerinckiaceae
151
Phylum Class Order Family Genus
Balneimonas
Bradyrhizobiaceae
Bosea
Devosia
Hyphomicrobiaceae Hyphomicrobium
Rhodoplanes
Methylobacteriaceae Methylobacterium
Methylocystaceae Pleomorphomonas
Rhizobiales
Phyllobacteriaceae Aminobacter
Mesorhizobium
Nitratireductor
Rhizobiaceae Agrobacterium
Kaistia
Hyphomonadaceae
Rhodobacterales
Alphaproteobacteria Rhodobacteraceae
Amaricoccus
Bacteria Proteobacteria Paracoccus
Acidiphilium
Acetobacteraceae
Acidocella
Roseococcus
Rhodospirillales
Rhodospirillaceae
Magnetospirillum
Telmatospirillum
Erythrobacteraceae
Kaistobacter
Sphingomonadales
Sphingomonadaceae Novosphingobium
Sphingobium
Sphingomonas
Sphingopyxis
152
Phylum Class Order Family Genus
Burkholderiaceae Burkholderia
Comamonadaceae Comamonas
Burkholderiales
Limnohabitans
Betaproteobacteria Methylibium
Oxalobacteraceae
Desulfarculales Desulfarculaceae
Desulfarculus
Desulfobacteraceae
Desulfobacter
Desulfobacterales
Desulfococcus
Bacteria Proteobacteria
Desulfobulbaceae
Desulfobulbus
Desulfomicrobiaceae Desulfomicrobium
Desulfovibrionales
Desulfovibrionaceae
Deltaproteobacteria Desulfovibrio
Geobacteraceae Geobacter
Desulfuromonadales
Pelobacteraceae
Haliangiaceae
Myxococcales
Myxococcaceae Anaeromyxobacter
Desulfobacca
Syntrophaceae
Desulfomonile
Syntrophobacterales Syntrophus
Syntrophobacteraceae
Syntrophobacter
Syntrophorhabdaceae
Arcobacter
Campylobacteraceae
Sulfurospirillum
Epsilonproteobacteria Campylobacterales
Helicobacteraceae
Sulfuricurvum
153
Phylum Class Order Family Genus
Acidithiobacillales Acidithiobacillaceae Acidithiobacillus
Aeromonadales Aeromonadaceae
211ds20
Alteromonadaceae
Alteromonadales Cellvibrio
HTCC2188 HTCC
Shewanellaceae Shewanella
Chromatiales Ectothiorhodospiraceae
Sinobacteraceae
Bacteria Steroidobacter
Xanthomonadales
Luteibacter
Xanthomonadaceae
Luteimonas
Lysobacter
Stenotrophomonas
Anaerobaculaceae
Anaerobaculum
Aminobacterium
Dethiosulfovibrionaceae HA73
Synergistetes Synergistia Synergistales
PD-UASB-13
Synergistaceae
vadinCA02
TTA_B6 E6
154
Phylum Class Order Family Genus
155