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Cours du 01/03/2018 UE 2A BPS du Pr MOREL I.

CV = cellule végétale

LA TRANSGÉNÈSE VÉGÉTALE
Pour quoi faire ?

• Pour comprendre le fonctionnement des plantes, un outil de recherche puissant en biologie


végétale
o Déterminer le rôle des gènes
• Pour améliorer les plantes
Utilisé avant pour l’agriculture traditionnelle dont le but était d’obtenir des espèces nouvelles pour
améliorer productivité et qualité des aliments. Principalement sur maïs, tomates, pdt, soja. Plus
récemment, utilisé pour réduire l’empreinte de l’agriculture sur l’environnement.
 On observe une augm de la productivité du maïs par introduction d’espèce hybride (soit par
croissement inter-espèce, soit par transgenèse).
Maintenant, 10% du génome des tomates provient d’hybridation d’espèce proche. Tout comme le
blé de maintenant qui contient bcp de fragments de chromosomes de seigle.
On a les croisements naturels où il faut 4 croisements pour avoir l’espèce souhaité. Dans la
transgenèse, sélection simplement du gène d’intérêt qui sera ensuite directement introduit au
niveau du végétal.

I. Introduction
Une plante est dite transgénique lorsqu'il y a une introduction artificielle d'un nouveau gène
(non naturel) appelé transgène, qui doit s'exprimer et être transmis à la descendance. Cette
plante sera alors appelée OGM-S ou encore PGM (Plante Génétiquement Modifié).

A - La nomenclature des OGM

OGM
• + une lettre en fonction du lieu de confinement :
◦ OGM-S pour les végétaux car confinés dans des serres.
◦ OGM-A pour les animaux car confinés en Animalerie
◦ OGM-L pour les micro-organismes car confinés en Laboratoire
• + un chiffre de 1 à 4 en fonction du facteur de risque pour l’environnement (repose sur le
vecteur), le plus grand risque correspondant à 4 :
◦ Principalement des plasmides pour les végétaux, ce qui n’entraîne pas de risque de
contamination aux animaux ou aux hommes. C'est pourquoi on dépasse rarement le
2 pour la transgenèse végétale
◦ On peut utiliser des virus pour les animaux, ce qui entraîne plus de risques

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B – Régénérer la plante entière

La cellule végétale est totipotente !  Modification d’une seule cellule donne donc une plante
complète transformé.

C – Évolution des méthodes

Le schéma représente les différentes méthodes qui se sont succédé. Avec la transgenèse, on arrive
sur des manipulations de plus en plus fines et de plus en plus ciblé.

II. Les différentes étapes


- Production d’ADN recombinant contenant le transgène  obtention d’un vecteur
(exemple d’un gène codant pour feuillage sombre qu’il faudra isoler mais aussi
l’amplifier)
- Introduction de l’ADN recombinant dans la cellule végétale et intégration au génome
(cellule transgénique)
- Sélection des cellules transgéniques de celles qui ne le sont pas reposant
principalement sur le caractère de résistance aux herbicides majoritairement (il suffira
de prendre les cellules avec le transgène ainsi que le gène de sélection qui est le
caractère de résistance à l’herbicide  culture des cellules sur milieu de culture avec
herbicide  ceux sans transgène dépérisse).
- Reconstitution de la plante entière (on régénère une plante avec de nouvelles
particularités)
- Vérification de l’expression des gènes introduits (synthèse de nouvelles molécules)

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On peut rechercher à introduire un transgène que l’on va donner à des cellules : soit ces
cellules on le garde en bioréacteur et qui vont produire la nouvelle molécule, soit on
reconstitue la plante qui produire la molécule.

A - Production d’ADN recombinant contenant le transgène

Obtention d'un vecteur pour pouvoir amplifier le gène d’intérêt. On intègre le transgène au
vecteur, souvent un plasmide bactérien (E. Coli par exemple), que l’on va multiplier et ainsi
augmenter le nombre de copie du gène.

B - Introduction de l’ADN recombinant dans la cellule végétale et


intégration au génome (cellule transgénique)

Il existe différentes méthodes :


• Indirectes par l'intermédiaire d'une bactérie (agroB) :
◦ Infection : le plasmide Ti
◦ Le plasmide D-Ti
• Directes (pas d'intermédiaire) :
◦ La biolystique
◦ Les protoplastes

1) Transfert indirect
a. Infection : le plasmide Ti

TI : pour tumor inducing (c’est un plasmide qui va induire des tumeurs chez le végétal  une
des techniques les plus anciennes)
Ce plasmide vient de la bactérie agrobacterium tumefaciens
C'est le modèle naturel : la plante subit une infection bactérienne et la bactérie lui transmet
des gènes plasmidiques.

i. Infection naturelle : Agrobacterium tumefaciens

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Agrobacterium tumefaciens est une grosse bactérie qui induit une « tumeur », c'est à dire une
prolifération cellulaire. Cette tumeur est due à l’acquisition des plasmides.
C'est le cas par exemple dans la gale du collet chez le maïs.
En plus de la prolifération cellulaire, le plasmide Ti (Tumor inducing) de cette bactérie permet
aux cellules de synthétiser des éléments nutritifs pour la bactérie (production massive)
appelées OPINES.

ii. Le plasmide Ti

Une partie de l’ADN est transféré à la cellule végétale et l’autre partie reste dans la bactérie
(agrobacterium).
Deux frontières délimitent la partie d'ADN transférée à la cellule végétale (ADN-T soit ADN
Transféré). Dans cette partie, il y a deux zones notables :
• ONC : zone oncogène (qui induit la prolifération cellulaire et le développement de la
tumeur)
• OPS : pour la synthèse d'OPINES
En dehors de l'ADN-T, il y a différentes zones importantes (non transmises) :
• Ori : origine de réplication du plasmide  multiplication du plasmide
• OCC : élément de régulation dans la synthèse des opines
• Vir : région responsable de la « virulence », intervient dans le mécanisme de transfert
du gène.

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iii. Mécanisme d'infection naturelle

Tout d'abord, on a une blessure au niveau de la plante. Cette blessure va provoquer une
réaction : l’infection par l'Agrobacterium tumefaciens. La plante va libérer des composés
phénoliques ou ponyphénols qui vont activer une partie de la région Vir du plasmide de la
bactérie. La région Vir A activé active l’infection. (La région Vir peut être divisée en plusieurs
régions : Vir A, B, C, D, E, G.) Il va se créer un pore entre les deux cellules.
Les autres zones de la région Vir vont s'activer à la chaîne pour finalement activer une
endonucléase qui va couper et libérer un seul brin d'ADN-T qui sera transféré à l’ADN végétal.
L’autre brin reste intégré pour reconstruire le double brin.
Une autre zone de la région Vir (VirE) va prendre en charge ce brin pour le transmettre à la CV.
Il va ensuite être répliqué et induire la prolifération cellulaire et la production d'OPINE avec
des cellules génétiquement modifiées mais avec un modèle naturel.

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b. Le plasmide D-Ti

A partir du plasmide Ti, l’idée est de construire un plasmide D-Ti (gène désarmé, non nocif
pour la CV).
Les chercheurs ont ensuite voulu remplacer la partie de l’ADN comprenant ONC et OPS et
remplacer par le gène d’intérêt ainsi qu’un gène de sélection pour résistance aux herbicides.

Méthode :
Il est tout d'abord intégré dans un petit plasmide d'E. Coli le gène d’intérêt pour se multiplier
de manière importante et ainsi obtenir un grand nombre de copies.
On modifie le plasmide de l'Agrobacterium tumefaciens pour donner un plasmide désarmé :
on remplace les zones ONC et OPS par le gène d'intérêt, tout en gardant les zones non
transmises nécessaires à la régulation comme la zone Vir (on a supprimé la zone oncogène).

On croise ensuite les deux plasmides (petit plasmide + plasmide désarmé) pour donner un
plasmide recombiné (avec gène d'intérêt + gène de sélection). Ce plasmide est introduit dans
l'Agrobacterium tumefaciens pour infecter une cellule végétale en laboratoire.

 Mécanisme avec faible rendement car certaines plantes ne sont pas sensibles à agroB

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2) Transfert direct

a. La biolystique
Cette méthode consiste à propulser des micro-billes (en or le plus
souvent) recouvertes d'ADN recombinant sur, soit des cellules
végétales isolées, soit une partie d'un végétal (souvent une partie
reproductrice pour obtenir une hérédité), grâce à un canon à
particules. Les micro-billes pénètrent dans la CV.

On va accélérer les particules qui vont impacter les cellules pour


espérer arriver au noyau. Ces impacts n’entraînent pas de
répercussion trop grave pour la cellule qui va pouvoir résister. La
rapidité permet donc à la cellule de survivre.

Les micro-billes se localisent de façon aléatoire : soit elles restent dans le cytoplasme soit (par
chance) elles atteignent le noyau.
L'ADN-T se détache de sa bille pour s'intégrer au génome. La micro-bille sera éliminée à la prochaine
mitose de la cellule.
Le rendement de cette technique est assez correct.
Si le transfert se fait sur la partie d'un végétal, il y a un espoir de transmission à la descendance
(en bombardant les fleurs), on obtient donc un végétal transgénique alors appelée végétal
MOSAÏQUE (car les plantes sont partiellement transgéniques, certaines parties ne le sont pas.
On doit attendre des croisements pour obtenir une plante totalement transgénique)
Si on utilise le canon sur les cellules reproductrice, ça permet d’avoir une descendance
transgénique aussi.

b. Les protoplastes

Cellule végétale sans paroi pecto-cellulosique (risque d'explosion à cause de la vacuole rempli
d’eau qui exerce une pression de l’intérieur sur la paroi). Le transfert sera donc facilité.

i. Obtention des protoplastes

1- Digestion enzymatique de la paroi (cellulase et pectinase).


2- On ajoute ensuite des éléments stabilisants (mannitol qui est protecteur
osmotique) pour diminuer la turgescence en faisant sortir l’eau  plasmolyse.
 On obtient des cellules rondes et non plus architecturées comme pour le
parenchyme des feuilles, ce sont les protoplastes qui sont sans parois (on est
en suspension).

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Au bout que qql jours en culture, la protoplaste régénère la paroi. C’est donc pdt ces
qql jours qu’il faut faire la manipulation.

ii. Fusion inter-espèce

C'est une méthode plus ancienne (vue au cours dernier) croisement au niveau du noyaux, des
mitochondries…. On met en contact 2 espèces sous forme de protoplaste et on les fait fusionner soit
par intermédiaire d’agents chimique soit par des chocs électrique intense  plusieurs combinaisons
possibles car on recherche des fusions binaire (entre 2 protoplastes et non pas 3 ou plus) de
protoplaste d’espèce différente. On peut avoir différente hybridation :
- Au niveau du noyaux comme par exemple la moitié de chaque génome mais on peut
avoir des cas où la fusion préserve en grande partie celui d’une espèce et faiblement de
l’autre.
- On peut aussi avoir des fusions au niveau des mitochondries donc mélange de leur
ADN. Le gène de stérilité mal est présent au niveau des mitochondries  permet de rendre
espèce stérile (utilisé parfois pour éviter diffusion à l’environnement ainsi que la production
de semence transgénique ce qui oblige l’agriculteur à racheter tous les ans).
- Par contre, on n’aura pas de croisement au niveau des chloroplastes donc la seule
possibilité est qu’une espèce acquière les chloroplastes d’une autre espèce. Intéressant car
les chloroplastes portent souvent les gènes de résistance aux herbicides.

iii. Intégration directe

• Électroporation

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Création de pores dans la membrane plasmique (il n’y a plus de paroi) par choc électrique
(puissants mais brefs). Le pore laisse le passage au gène d'intérêt (l’ADN-T) qui peut alors
pénétrer dans le protoplaste.
Ce n'est pas efficace à 100%, il faudra donc sélectionner les cellules.
Au bout d’un certain temps, on a une régénération de la paroi donc de la cellule puis
génération de la plante entière.
 Plus fin car on sait ce qui l’on donne comme gène

• Lipotransfection

On insère l'ADN-T dans un liposome (membrane


artificielle : c'est une bicouche de phospholipides). La
membrane du liposome et du protoplaste fusionnent
ensuite de manière spontanée.

• Microinjection
Se fait sous microscope. Le micro-
manipulateur (système de curseur qui
permet d’avancer doucement et de
déplacer le système d’injection)
injecte directement une solution
d'ADN-T dans le protoplaste grâce à
une micro-pipette.
C’est une méthode longue car elle
doit se faire protoplaste par
protoplaste, et il faut que l’ADN-T
atteigne bien le noyau, c’est une
méthode fastidieuse.

III. Principe de précaution

Les questions éthiques qui se pose sont de savoir si


- Danger pour l’homme,
- Dégradation de l’environnement,
- Dépendance des agriculteurs vis-à-vis des multinationales

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A – Réglementation des OGM
Les autorisations d'expérimentation sont régies par l'UE. La France est globalement réticente
au recours aux OGM.

B – Aspect réglementaire

1) Organismes impliqués

Commission du Génie Génétique : la CGG (ministère de la Recherche)


Commission du Génie Biomoléculaire : la CGB (ministère de l’agriculture)
AFSSA : agence française de sécurité sanitaire des aliments.
Biovigilance importante car ce sont des nouveaux gènes donc de nouvelle
protéines  allergies ++

Notre réglementation dépend de la communauté européenne, et en France nous sommes


dans un système de précaution (contrairement à d’autres pays).

2) Conditions de culture
NB : 1973 pour agroB et depuis 2002 : culture à grande échelle.

Il y a des classes de confinements numérotées de L1 à L4. (1 = risque faible et 4 = risque élevé)

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Pour les végétaux on est au max au risque 1 ou 2. Car les risques sont assez restreints (pas de
virus et pas de risque pour le monde animal ou l’homme)
Matériaux de construction : quelconques, normes bâtiment imperméables à l’eau, résistance contrôlée et

résistants aux chocs.

Nature du sol : quelconque ou gravier désherbé désinfectable ou imperméable, collecte et stérilisation des eaux

Aération : filets anti-animaux obligatoires, filtres anti-insectes pollinisateurs < 1mm, hygrométrie contrôlable local

étanche, filtres EU3 à EU7, pression négative et filtres HEPA à la serre

Abords, système de vide paillasse, douche, signalisation des risques, destruction des plantes,
vêtements, accès, effluents...

Il doit y avoir une signalisation autour de la serre et il y a une réglementation aussi au niveau
de la destruction des plantes (incinération par ex), des vêtements...

3) Les gènes autorisés/impliqués

Peu de gènes autorisés en France par rapport à d’autres pays.

• Tolérance à un herbicide (39 %)


◦ Pour l'agriculture : l'agriculteur cultive un OGM résistant à un herbicide, il suffira
donc pour désherber de rajouter l'herbicide qui ne détruira que les mauvaises herbes (les
adventices). Ceci évite à l'agriculteur l'usage massif de pesticides : un seul suffit.
• Résistance aux autres organismes (20%)
• Modification de qualité (8%) ◦ Fruits, couleur des fleurs...
• Tolérance au stress (hydrique) (8 %)
◦ Résistance à la sécheresse : évite d'irriguer de manière trop importante
(particulièrement utile en zones arides)
• Résistance aux virus (4 %)
• Résistance aux insectes (4 %) (pour limiter l’emploi des pesticides)
Goût répulsif par exemple
• Gènes de stérilité mâle (dissémination)
◦ Pour éviter la dissémination (du pollen)
◦ Plantes dont on ne consomme pas les fruits (car pas de pollen donc pas de
fécondation et pas de fruit) ex : pour le coton
• Gènes de résistance aux ATB (utilisé pour le criblage au départ)
◦ Débat pour la consommation : évocation de la possibilité de transmettre cette
résistance aux antibiotiques aux bactéries de notre flore intestinale (mais risque
faible au final puisque notre flore intestinale est déjà résistante à un grand nombre
d'antibiotiques)

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◦ ces nouvelles plantes entrainent-elles des allergies alimentaires ??? (de plus en plus
présentes aujourd’hui)

4) Étiquetage (18 avril 2004)

Avant 2004 il n’y avait rien...


Si la présence d’OGM n’est pas fortuite, toute incorporation volontaire doit être étiquetée :
• Le maïs, soja ou colza présents dans les aliments et contenant plus de 0,9% d’OGM (car en-
dessous on dit que c’est d’origine fortuite)
• Les ingrédients issus du maïs, soja ou colza à partir de plus de 0,9% d’OGM (farine, flocons,
semoules, amidon, protéines, matières grasses)
• Les additifs produits à partir de maïs, soja ou colza s’ils sont produits à partir de plus de
0,9% d’OGM la lécithine de soja (E322), l’huile de soja oxydé (E 479b), …
• Les aliments des animaux contenant plus de 0,9% d’OGM (l’éleveur sait s’il donne des OGM
à manger à ses bêtes)

Ont été inclus en 2004 dans l’obligation d’étiquetage :


• Les produits animaux ou provenant d’animaux nourris aux OGM : (lait, viande, œuf, beurre,
biscuits et plats préparés, aliments BB)

80% de la totalité des OGM entre dans la chaîne alimentaire par le biais de l’alimentation
animale

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IV. Applications

A - Domaines

Agriculture, Production de médicaments recombinants, Production de produits


alimentaires... Pour les applications à la santé, on a une production à faible coût : le Plant
farming. Pour cultiver une plante, il faut juste de l'eau, de la terre et de la lumière. Ce qui fait
augmenter le prix est l'extraction de la molécule.

On en est arrivé à faire du coton coloré naturellement !

Application santé/nutrition

Le riz de contient pas de β-carotène (Vit A) or c’est une des principales céréales. Pour lutter contre
des carences en Vit A (vision, résistance aux infections, …), on a donc créé un riz transgénique avec
surexpression du gène de la β-carotène. On a donc du riz plus jaune  riz dorés. On a donc pu
alimenter la population car 40g de riz suffise.

Molecular pharming

Production de végétaux transgénique exprimant une nouvelle protéine. Ces cellules seront cultivé
en bio-réacteur. Il suffira d’extraire le métabolite secondaire  usine à mdct. On étudie d’abord en
mini bio réacteur pour déterminer l’O2, les nutriments et toute les autres conditions nécessaires.
Cela permettra ensuite une production de masse. L’intérêt de le faire avec des végétaux et que l’on

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va le faire en champs  cout de prod faible (cf tableau ci-dessous). De plus, il faut des
environnements de stockage tout simple. Le cout le plus important sera pour l’extraction de la
molécule d’intérêt.
Bactérie Levure Mammifère Plante

Risque pathogène Oui Non Oui (virus) Non

Production * * ** **
250 mg/L 200 mg/L g/L 600 mg/kg de
matière sèche

Cout de production *** *** ** 100 *


200-3000 $/g $/g 10-50 $/g

Stabilité/ Stockage * * * ***

B – Molécules produites

Essentiellement produites par du tabac car plante bien connue.

Molécule produite Plante d’origine Traitement thérapeutique

Lipase gastrique du chien Colza, Tabac Muco, insuf gastrique

Interféron γ Tabac Antiviraux

Facteur de croissance Tabac Reconstitution de la peau

Serumalbamine humaine Tabac Produits sanguins

Hémoglobine humaine Tabac Transfusion

Gène de l’hirudine de la
sangsue Colza Anticoagulant
(Plutôt à titre expérimental)

Encéphaline humaine Pomme de terre Neuromédiateur, Antidouleur

Glycoprotéine de la rage Tomate Vaccination


On a réussi à faire des bananes transgéniques qui permettaient à la population de se vacciner contre le
choléra en les mangeant.

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