Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
CROMATOGRAFÍA LIQUIDA
Otras que son difíciles de analizar son las de baja abundancia que dada a su escasez no puedan
apreciarse por la presencia de proteínas mayoritarias que opacan o se sobreponen ante estas,
imposibilitando de este modo su fácil detección. Es por ello, que en los últimos años ha existido la
tendencia a trabajar con los péptidos en vez de las proteínas tratando de solucionar las
limitaciones señaladas.
La cromatografía liquida (liquid chromatography, LC) es una técnica de fraccionamiento que puede
utilizarse para separar proteínas o péptidos según las propiedades físicas o químicas de estos.1
En sus inicios, la MS no era aplicable a las proteinas, debido a la ausencia de tecnicas suaves de
ionizacion que permitieran realizar el paso de grandes biomoleculas a iones en fase gaseosa sin
una fragmentacion excesiva de las mismas, es decir, que no se volatilizaban. A partir de la decada
de 1980 y en mayor escala en la decada de 1990, espectrometria de masa ha desempeñado un
papel cada vez mas importante en las ciencias biologicas, gracias al desarrollarlo de dos tecnicas
de ionizacion que permitieron realizar el analisis de proteinas y peptidos, entre otras biomoleculas
por M.S. La primera de ellas, se denominan MALDI por sus siglas en ingles “Matriz - Assisted Laser
Desorption/Ionizacion” (desorcion/ionizacion laser asistida por matriz) y la segunda de ellas es la
ionizacion por electroespray “electrospray ionizacion” (ESI), desarrollada por Fenn y
colaboradores.1
Los mayores avances para el estudio de las proteinas se han dado en la etapa de preparacion de
las muestras para la MS; un area importante para la viabilidad y la sensibilidad del analisis. A partir
de 1993, se comienzan a publicar varios algoritmos, y programas informaticos, diseñados con el
objetivo de permitir la correlacion de los datos de espectrometria de masas obtenidos para una
proteina y los obtenidos en las bases de datos, cada vez mas amplias.2
La fuente de ionización convierte las moléculas en iones en fase gaseosa para que pasen al
analizador de masa, donde son separadas según su relación masa/carga y hace que
lleguen al detector secuencialmente. Las señales captadas por el detector son integradas
por un sistema informático que genera un gráfico denominado espectro de masas, donde
se representan la abundancia (intensidad) de los iones en el eje de coordenadas y la
masa/carga (m/z) en las abscisas esta permitirá la identificación del compuesto.1
El desarrollo de ESI dio lugar a que John Fenn obtuviera el premio Nobel en Química en
2002 «for the development of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric
analyses of biological macromolecules
(electrospray)».
Permite la obtención del ión molecular, y si se desea obtener una fragmentación, se puede
inducir aumentando el voltaje en la punta del cono del capilar. Este proceso se utiliza con
frecuencia en espectrometría de masas en tándem. La ESI de especies poliméricas,
proporciona espectros que contienen una serie de múltiples iones cargados del siguiente
tipo: [M+ nH]n+ y [M–nH]n–. En muchos casos, se pueden determinar masas moleculares
de macromoléculas con una precisión de ± 0,005%. La ionización por electrospray
constituye la mejor interfaz cuando se acopla la cromatografía de líquidos (LC) o la
electroforesis capilar (CE) con MS.
2.2. MALDI: Ionización por desorción con láser asistida por una matriz
El desarrollo de este sistema de desorción se realizó por dos grupos de investigación siendo
merecedor del Premio Nobel en 2002 Koichi Tanaka, compartido con John Fenn. Ha
significado una revolución para el estudio de biopolímeros, ya que ha permitido el análisis
de proteínas y otras biomoléculas cuyas masas exceden los 200 Kdalton, con una
sensibilidad de varios órdenes de magnitud.
El analizador tiene dos misiones fundamentales: separar los iones en función de su relación
m/z y enfocar los iones separados hacia un determinado punto. El movimiento de las
partículas cargadas permite distinguir unas de otras en función de la energía cinética de
cada ión, de la velocidad o del momento de fuerzas. Los distintos analizadores aprovechan
alguna o varias de estas propiedades para separar los iones de distintas masas.
Es uno de los analizadores más sencillos, pero actualmente tiene una gran presencia en los
laboratorios. El principio de los espectrómetros de tiempo de vuelo (time of flight) se basa
en la relación entre la masa y la velocidad de los iones. Se mide el tiempo que necesitan los
iones acelerados para recorrer una distancia (L), que depende de las características del
instrumento, sin que los iones estén sometidos a un campo eléctrico y/o magnético.
Las prestaciones del TOF son especialmente interesantes, sobre todo en cuánto a la
resolución y la exactitud en la determinación de la masa ya que se consiguen valores
inferiores a partes por millón.
Los equipos MALDI-TOF son muy utilizados para el análisis de biomoléculas, siendo sus
principales ventajas:
Análisis muy rápidos, algunos instrumentos que se encuentranen el mercado pueden
procesar cien muestras en menos de diez minutos.
Permite la determinación de masas en un amplio intervalo, se pueden medir desde
péptidos de pequeña masa hasta proteínas mayores de 100.000 Dalton (Da).
Se obtienen espectros de masas sencillos, debido a que la mayoría de los iones
tienen una carga única, sólo un pequeño porcentaje es de doble carga y rara vez se
observan iones de triple carga.
Posibilidad de obtener una imagen espacial molecular o incluso de un tejido, debido
a que el haz de radiación láser se puede enfocar en un pocillo muy estrecho (5 μm).
También depende de las lentes focalizadoras utilizadas en el equipo MALDI-TOF.
Una sensibilidad muy elevada que puede llegar a detectar cantidades del orden de
atomoles de péptidos de pequeño tamaño.3
Las limitaciones del MALDI-TOF también existen y se pueden resumir en las siguientes: