A t Bi ló i Obt ã

Amostras Biológicas : Obtenção,  
D i l u i ç ã o E Concentração 

Prof. Paulo Miranda
UFPE
CLASSIFICAÇÃO DAS SOLUÇÕES
à Õ
QUANTO AO ESTADO FÍSICO: 
QUANTO AO ESTADO FÍSICO
∙ sólidas 
∙ líquidas 
líquidas
∙ gasosas 
QUANTO À CONDUTIVIDADE ELÉTRICA:
QUANTO À CONDUTIVIDADE ELÉTRICA: 
∙ eletrolíticas ou iônicas 
∙ não‐eletrolíticas ou moleculares 
QUANTO À PROPORÇÃO SOLUTO/SOLVENTE: 
∙ diluída 
∙ concentrada 
∙ não‐saturada 
saturada
∙ saturada 
∙ supersaturada 
 SOLUÇÕES
Soluções = Misturas homogêneas

∙ Soluto = aquele que está sendo dissolvido. 
∙ Solvente = dissolve o soluto.
∙ Massa solução = massa soluto + massa solvente.
∙ Volume solução = volume soluto + volume solvente.
∙ Coeficiente de solubilidade = quantidade máxima de soluto que pode ser 
dissolvida em 100g de solvente, depende da temperatura do sistema.
Ex.: a 25oC o coeficiente de solubilidade da substância X é igual a 35 (35g de X são 
f d l bld d d b â é l ( d
dissolvidos em 100g).

Classificação
∙ Saturada = quantidade de soluto igual ao coeficiente de solubilidade.
∙ Insaturada = quantidade de soluto inferior ao coeficiente.
∙ Supersaturada = quantidade de soluto superior ao coeficiente.
S t d tid d d l t i fi i t

Ex.: solução contendo 35g de X em 100g de solvente a 25oC ‐‐‐‐SATURADA 
Solução contendo 50g de X em 200g de solvente a 25oC ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐INSATURADA.
Solução contendo 25g de soluto em 50g de solvente a 25oC ‐‐‐‐SUPERSATURADA
DILUIÇÃO
Ç
 Definição 1: Diminuição da concentração de uma Solução 
Definição 1: Diminuição da concentração de uma Solução
, adicionando mais Liquido;

 Definição 2: Volume de concentrado no Volume total da 
Solução
Solução ;

 Definição 3:  Quantidade relativa de uma Substância em 
uma Solução.
DILUIÇÃO
Ç
Diluentes Aplicação de uso
Aplicação de  uso

PBS Imuno/Hemat./Bioq
 

Salina Bioq./Imuno/Hemat
q/ /
 

PBS‐Tween Bioquímica‐Imuno.
q
 

Água destilada Uso geral 
 DILUIÇÃO

Fórmula :

Vi x Ci =  Vf x Cf
 Vi = Volume  inicial
 Ci = Concentração inicial
Concentração inicial
 Vf = Volume final
 Cf = Concentração final
= Concentração final
 CONCENTRAÇÃO

 Quantidade relativa de uma Substância em uma 
S l ã
Solução.
 Concentrar é tornar mais densa uma Solução.
ç
 Pode ser medida de três maneiras:
 Unidade de Massa / Unidade de Massa.
/
 Unidade de Massa / Unidade de Volume.
 Unidade de Volume / Unidade de Volume.
CONCENTRAÇÃO
Ç
 Métodos de Concentração  :

 Osmose Reversa

 Filtração

 Centrifugação
g ç

 Evaporação

 Liofilização

 Cromatografia
 TIPOS DE CONCENTRAÇÃO
TIPOS DE CONCENTRAÇÃO
∙ % EM MASSA:      massa de soluto_ x 100 / massa de solução

∙ % EM VOLUME:   volume de soluto_ x 100 / volume de solução 

(só é usada qua do so uto e so e te são a bos qu dos ou
(só é usada quando soluto e solvente são ambos líquidos ou 
ambos gasosos) 

∙∙ CONCENTRAÇÃO EM g/L:  massa de soluto em gramas/volume de 
CONCENTRAÇÃO EM g/L: massa de soluto em gramas/volume de
solução em litros

∙ CONCENTRAÇÃO EM mol/L:  
CONCENTRAÇÃO EM mol/L: quantidade de soluto (mol)/volume 
quantidade de soluto (mol)/volume
de solução em litros

∙ CONCENTRAÇÃO EM MOLALIDADE:   
à quantidade de soluto 
d d d l
(mol)/massa do solvente em kg

∙ CONCENTRAÇÃO EM FRAÇÃO MOLAR DE SOLUTO:   quantidade 
de soluto (mol)/quantidade de solução (mol)
TITULAÇÃO
Ç
 Concentração de uma Solução Expressa por  Títulos.

 Menor quantidade de uma Substância que produzirá um 
Produto ou Efeito Biológico.
d f i i ló i

 Inversamente proporcional a Diluição. 
Amostras utilizadas em imunoensaios
Amostras utilizadas em imunoensaios
AMOSTRAS MAIS UTILIZADAS: SANGUE TOTAL 
(fenotipagem), PLASMA, SORO E POR VEZES PBMCs
(Citometria de fluxo) OU TECIDOS (Reações de 
i fl ê i /i it í i )
imunofluorescência/imunocitoquímica).

Fatores como: idade, sexo, gravidez, etnia, uso de

medicamentos, período menstrual, gravidez,
exercícios e janela imunológica podem interferir no
resultado do exame.

JJejum
j recomendado
d d de
d 4‐8
4 8 h:
h quilomicrons,
il i amostras
hiperlipêmicas podem interferir no resultado; não
beber café,
café sucos ou chás (aumenta o cortisol
plasmático); pode beber água.
Composição do sangue
 Obtenção de soro ou plasma
Fatores que interferem com a qualidade da amostra:
amostra:
‐ Tempo
T entre
t coleta
l t e centrifugação
t if ã (no
( caso de
d soro,
esperar a retração do coágulo, 30‐60 min)
‐ Centrífuga: velocidade de rotação, temperatura e
tempo de centrifugação
‐ Separar o soro ou plasma obtido após centrifugação
das células sanguíneas.
* Para obtenção de plasma, utilizar tubos com
anticoagulante (Heparina, EDTA...)
 Armazenamento e transporte

‐As amostras biológicas devem ser

conservadas a ‐20
‐20° C ou – 80
80° C ou 2‐4
2‐4° C por
1 semana.
‐Alíquotas com pequenos volumes
‐ Ao transportar amostras biológicas,
biológicas os tubos
devem ser mantidos fechados (risco de
contaminação) e refrigerados,
refrigerados caso
necessário.
 Outros espécimes biológicos utilizados:

1) Urina (determinações hormonais/drogas/Ags

hormonais/drogas/Ags//Acs
2) LCR (pesquisa de Ags e Acs bacterianos, virais e parasitários
e doenças crônico‐
crônico‐degenerativas do SNC)
3) Líquido amniótico (estudo de infecções congênitas)
4) Líquido sinovial (artrites de etiologia auto‐
auto‐imune
imune))
5) Fezes (pesquisa de Ags através de Acs monoclonais
monoclonais::
rotavirus,, Entamoeba histolytica;
rotavirus histolytica; Ensaios de aglutinação,
DOT‐‐ELISA)
DOT
6) Saliva (pesquisa de hormônios , drogas, Ags e Acs
Acs))
7) Sêmen (suspeita de Acs anti‐
anti‐espermatozóide
espermatozóide))
Biossegurança e descarte
Biossegurança e descarte
 A Biossegurança aborda todos os grupos: paciente,
pessoal do laboratório, meio ambiente, comunidade
externa.
 Descarte
D t final
fi l dos
d materiais
t i i e resíduos
íd f it de
feito d forma
f
correta é essencial para segurança individual e pública.
 No
N Brasil,
B il a partirti de
d 1995,
1995 a CNTBio
CNTBi (Comissão
(C i ã
Nacional Técnica de Biossegurança) estabeleceu regras
de controle e descarte de materiais biológicos
g que
q
devem ser seguidos pelos laboratórios clínicos e de
pesquisa, além de suas próprias regras de
biossegurança.
biossegurança
RDC 306/2004 ‐ Dispõe sobre o Regulamento Técnico
para o gerenciamento de resíduos de serviços de saúde.
saúde
 Cálculo de concentração de amostra biológica
(Unidade/Volume)

Questões:
= 11. Qual
Q l a quantidade
tid d d
de
parasita parasitas em 3 ml?
4ml
22. Dessa suspensão
ã parasitária,
iá i
3ml 2 parasitas devem ser
eletroforese Como
submetidos a eletroforese.
2ml
devo proceder?
1ml 10 parasitas 1ml (1000l)
(1000 l)
2 parasitas X

10 parasitas/ml X = 0,2 ml (200 l)

 Diluição
Dil i ã seriada:
i d utilizada
tili d em titulações
tit l õ
de amostras e reagentes

Ex: diluição seriada, fator 2 (1:2), volume final 200l.

Ex: diluição seriada, fator 2 (1:2), volume final 200l.

200 l       200 l     200 l   200 l     
200 l 200 l 200 l 200 l
200 l      200 l 
Soro
200 µl
200 
l
l
200 
200 
(PBS)
(PBS)
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128
 Obtenção de solução menos concentrada a 
partir de uma solução mais concentrada.

Informações importantes: Volume e concentração desejada.

S l ã A
Solução Exemplo:
Volume = 26 ml (26000 l)
((200 g
g/ml)) Concentração = 3 g/ml
C1 x V1 = C2 x V2
Volume
2 ml 200g x ? = 3g x 26ml
3 x 26 = 0,390 ml ou 390 µl da solução A
(2000l
200
)
Para preparar a solução B a 3µg/ml, com
Tenho 2ml da solução A a 200 µg/ml. vol. final 26 ml.
Quero obter
Q bt 26 mll da
d solução
l ã B, B com 25610 l de PBS + 0,390ml da 
25610 l d PBS 0 390 l d
concentração de 3 g/ml, a partir da A. solução A
 Diluição de amostras

Exemplo: 1:100, volume final 50 µl (poço de ELISA)

1 ----- 100
X ----- 50 µl = 0,5 µl de amostra + 49,5 µl de tampão.
Soluções
ç

8g de Completar para
Completar  para  1 2
BSA 100ml do diluente.
100ml

Solução de BSA      70
a  8% (p/v).                 ml
1 2

Substância em pó.  Ex: BSA a  Substância líquida. Ex: Álcool a 
8% (p/v)
8%. (p/v) 70% (v/v)
70% ( / )
Formas de fazer uma diluição de 1/2
1 1 1 1 1
2 4 8 16 32
1 1 1 1 1
2 10 50 250 1250
1 1 1 1 1
2 20 200 2000 20.000
VÍDEO
Í
 Testes de imunodiagnóstico na 
Testes de imunodiagnóstico na
patologia clínica e seus parâmetros

Prof. Paulo Miranda

 Diagnóstico de certeza de um processo
patológico:

Demonstração do patógeno ou de seus produtos

nos tecidos ou fluidos biológicos.
Nem sempre é possível:
-Ausência do agente
g infeccioso
-Falta de sensibilidade dos métodos utilizados
-Falhas
Falhas técnicas
-Demora do resultado (cultura)

MÉTODOS IMUNOLÓGICOS DIRETOS OU INDIRETOS

têm sido utilizados para suprirem a deficiência dos
métodos parasitológicos ou microbiológicos.
 Vantagens da utilização dos métodos de
imunodiagnóstico:

-Rapidez
-Simplicidade de execução
-Automação
-Baixo custo operacional

Como?
P i de
Pesquisa d Acs,
A AgsA e imunocomplexos.
i l

Interpretação correta dos resultados + investigação

clínica + epidemiologia compatível = Diagnóstico da
patologia.
 Emprego dos testes de
imunodiagnóstico:

) i
1)Pesquisa d
de i
anticorpos no di ó i
diagnóstico
individual

2)Pesquisa de anticorpos em inquéritos

soroepidemiológicos

3)Pesquisa de antígenos
1) Pesquisa de Acs no diagnóstico individual:

- Elucidar processos patológicos com sinais e

sintomas clínicos confundíveis.
confundíveis
Ex.: Toxoplasmose e Mononucleose infecciosa

- Diferenciar a fase da doença.

doença
Ex.: IgM (fase aguda); IgG (fase crônica)

Di ti
- Diagnosticar d
a doença ê it
congênita
Ex.: Presença de IgM no cordão umbilical contra T. pallidum
1) Pesquisa de Acs no diagnóstico individual:

- Selecionar doadores de sangue

Ex.:: Triagem sorológica para sífilis,
Ex sífilis hepatites B e C,
C HIV,
HIV Chagas,
Chagas HTLV
e malária.

- Selecionar doadores e receptores de órgãos

para transplantes.
Ex.: Acs específicos para determinantes estruturais que caracterizam
g do HLA (
Ags (Human Leukocyte
y Antigens)
g )

- Avaliar o prognóstico da doença

Ex.: Presença de Acs anti
anti-HBe
HBe na hepatite B
1) Pesquisa de Acs no diagnóstico individual:

- Avaliar a eficácia da terapêutica.

Ex : queda gradual dos níveis de Acs
Ex.:

- Avaliar a imunidade específica naturalmente

adquirida ou artificialmente induzida
Ex.: Acs produzidos pós vacinação

- Verificar o agravamento da patologia

Ex.: Presença de auto-anticorpos
 2)Pesquisa
2)P i d
de anticorpos
ti em inquéritos
i é it
soroepidemiológicos:

- Estabelecer a prevalência da doença

Ex : Prevalência sorológica
Ex.:

- Verificar a erradicação da doença

Ex.:: Ausência de Acs nos testes sorológicos em indivíduos moradores
Ex
de área endêmica (acompanhamento sorológico)

- Verificar a reintrodução
ç de novos casos em
áreas consolidadas
Ex.: Presença de Acs IgM ou aumento dos níveis de IgG
3) I
Importância
tâ i dos
d testes
t t sorológicos
ló i na
pesquisa de antígenos

- Como critério de cura

Ex : Teste de pesquisa de Ags negativo para determinada patologia
Ex.:

- Na definição da etiologia da doença

Ex : Presença de Ags específicos
Ex.:

- Na seleção de doadores de sangue

E
Ex.: P
Pesquisa
i d Ag
de A circulante
i l t em detrimento
d t i t da
d janela
j l imunológica.
i ló i

- Em inquéritos epidemiológicos

Utilização de Anticorpos Monoclonais

Parâmetros para validação de
um teste sorológico
 Conceitos:

DOENÇA
Presente Ausente

+ VP FP
TE

a b
TEST

- FN c d VN

VP = Verdadeiro Positivo

FP = Falso Positivo

FN = Falso Negativo

VN = Verdadeiro Negativo
 Conceitos:

1) Sensibilidade
S ibilid d

Porcentagem de pacientes com teste + detectados numa

população
p p ç de doentes.

S = A/(A + C)
2) Especificidade

Porcentagem de indivíduos com teste – em uma população

sabidamente não infectada.

E = D/ (B + D)

Quanto maior a E, menos FP (reações cruzadas)

Conceitos:

Sensibilidade e especificidade

Doentes Normais
Teste +
Teste +
Teste -
Teste -

Sensibilidade Especificidade
((90%)) ((80%))
Conceitos:

3) Eficiência, acurácia ou precisão

Refere-se à relação entre o nº de resultados corretos (VP + VN) e o total
de indivíduos testados.

Eficiência = A + D/(A + B + C + D)

4) Prevalência
Refere-se ao nº de casos de uma doença (VP + FN) numa determinada
Refere-
população.

P = A + C/(A + B + C + D)
Conceitos: DOENÇA
Presente Ausente

TESTE
E
+ VP FP
a b
- FN c d VN

5) Prevalência
P lê i sorológica
ló i
Refere-se a porcentagem de casos positivos pelo teste (VP + FP) numa
população.

Ps = A + B/(A + B + C + D)

6) Valor Preditivo Positivo

Refere-se à probabilidade de doença quando o resultado do teste é + (VP
+ FP).

VPP = A/(A + B)
Conceitos: DOENÇA
Presente Ausente
VP

TESTE
+ a       b FP

- FN c       d
c d VN

6)
) Valor Preditivo Negativo
g
Refere-se à probabilidade de não ocorrência de doença quando o resultado do
teste é – (VN + FN).

VPN = D/(C + D)

7) Limiar de reatividade ou “cut-off”

Ponto a partir do qual o teste será considerado positivo.

Pode variar de acordo com o objetivo do teste:

- Triagem
g de doadores de sangue
g (alta sensib.)
( )

- Certeza diagnóstica (alta espec.)

C
Conceitos:
it

7) Limiar de reatividade ou “cut-off”

F e r r e ir a & Á v ila , 2 0 0 1 .
L im ia r d e re a tiv id a d e
(c u t o ff)
C o rte e m :
 = m á x im a s e n s ib ilid a d e
 = m á x im a s s e n s ib ilid a d e e
Frequência

Frequência
e s p e c ific id a d e
 = m á x im a e s p e c ific id a d e
  

1 4 /2 7
C
Conceitos:
it

7) Limiar de reatividade ou “cut-off”

CURVA ROC (Receiver Operating Characteristic)
Curva ROC – A probabilidade de
resultados positivos está no
eixo
i y. As
A probabilidades
b bilid d d
de
teste positivo na ausência de
doença estão no x. O ponto
mais acima e à esquerda
corresponde ao melhor ponto
de corte para o teste.
Maior sensibilidade (s) e menos
falso-positivos
f l iti (1-E)
(1 E) = maior
i
acurácia.

AUC = 0,7 – 0,8 = Razoável

= 0,8 – 0,9 = Bom
< 0,9 = Excelente
 Conceitos:
8) Reprodutibilidade
É definida como a obtenção de resultados iguais em testes do mesmo
formato realizados com a mesma amostra biológica por diferentes
técnicos em diferentes locais.

Reprodutibilidade INTRATESTE e INTERTESTE

Fatores que influenciam na concordância:
Q lid d d
‐ Qualidade dos reagentes
‐ Condições técnicas e operacionais
‐ Manutenção dos equipamentos
Manutenção dos equipamentos

Certificação ISO de qualidade; introdução de soros referência
 Conceitos:
9) Índice Kappa (κ)

Mede o grau de concordância entre dois ou mais

observadores sobre o resultado de um
determinado ensaio. A análise de concordância é
baseada no indicador kappa (k).

Kappa Concordância
<0 00
<0,00 Nenhuma
Κ = (PO – PE)/(1-PE) 0,00-0,20 Fraco
PO = concordância observada 0,21-0,40
, , Sofrível
PE = concordância esperada 0,41-0,60 Regular
0,61-0,80 Boa
0 81 0 99
0,81-0,99 Óti
Ótima
1,00 Perfeita
Fim