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Fundamento de las plataformas

El proceso de secuenciación está dividido en 3 etapas:

1. Preparación de bibliotecas: El objetivo de la preparación de la biblioteca o


preparación de muestras es obtener fragmentos de las muestras de un tamaño
específico con adaptadores unidos en ambos extremos (Figura 1).

2. Generación de clusters: Durante la generación de clusters las muestras se hibridan a


la superficie de la celda de flujo a través de los adaptadores previamente unidos,
posteriormente se extienden por una amplificación tipo puente y se linearizan. La celda
de flujo contiene los oligonucleótidos (primers) de amplificación complementarios a los
3. adaptadores unidos a las muestras fragmentadas. Los fragmentos se unen a los primers
por complementariedad y estos son extendidos por la polimerasa, generándose una
copia complementaria de la cadena original. La molécula de doble cadena se
desnaturaliza y el templado original se desecha, quedando la nueva hebra de DNA
sintetizado unido covalentemente a la superficie de la celda en uno de sus extremos.
Posteriormente para la amplificación, el extremo de la hebra sencilla que ha quedado
libre hibrida con un oligonucleótido adyacente localizado sobre la superficie de la celda
para formar un puente y el primer es entonces extendido por la polimerasa para
generar un puente de doble cadena. El puente es desnaturalizado, resultando en dos
copias de cadena sencilla del templado, unidas covalentemente a la superficie. Los
ciclos de amplificación se repiten hasta formar múltiples puentes.

Finalmente, los puentes de doble cadena se desnaturalizan, se bloquean los extremos


3’ de las hebras de DNA con dNTPs con el fin de evitar que cualquier DNA o nucleótido
pueda interferir durante la secuenciación y se hibridan los primers de secuenciación
(Figura 2).
4. Secuenciación: La tecnología de secuenciación de Illumina está basada en el
procedimiento de secuenciación por síntesis (SBS) con terminadores reversibles
marcados. Los cuatro nucleótidos identificados con una marca o grupo fluorescente
diferente se adicionan en cada ciclo durante todo el proceso de secuenciación. La
secuenciación se lleva a cabo a través de reacciones de adición de un solo nucleótido
por ciclo, ya que estos contienen en la posición 3’-OH un grupo que bloquea y previene
que la polimerasa incorpore bases adicionales. En cada ciclo se produce una serie de
eventos que ocurren en el siguiente orden: a) Un nucleótido es incorporado por la
polimerasa; b) los nucleótidos no incorporados son lavados y retirados; c) se captura
una imagen de la celda con el fin de identificar la señal de fluorescencia emitida y por lo
tanto el nucleótido incorporado; d) los grupos fluorescentes son liberados; y e) el
nucleótido 3’-OH es químicamente desbloqueado. Para leer el extremo opuesto de cada
fragmento (paired end), las hebras se desnaturalizan, se remueve la hebra recién
sintetizada y se regeneran los clusters a través de la reamplificación por puentes.
Posteriormente se hibridan los extremos con el primer reverso y el proceso de
secuenciación procede como se describió anteriormente (Figura 3).