Cátedra: Microbiología General.

Facultad: Ciencias Alimentación Bioquímica y Farmacia.

TRABAJO PRÁCTICO Nº 10 CALIDAD MICROBIOLÓGICA DEL
AMBIENTE, SUPERFICIES Y PERSONAL

OBJETIVO:
• Comprobar la ubicuidad de los microorganismos, existentes en el ambiente: aire;
superficie de materiales y del cuerpo.
• Conocer técnicas básicas para el cultivo de microorganismos del ambiente.
• Reconocer la importancia y el impacto en la salud de ambientes que requieren
esterilidad en la salud de las personas.

INTRODUCCIÓN
El aire además de partículas en suspensión, es portador de bacterias en forma vegetativa o
esporuladas, esporos de hongos y virus. Por ello puede ser causa tanto de contaminación
como de infecciones en el hombre (patologías respiratorias, etc.).
Los microorganismos se encuentran presentes en todos los ambientes: en el aire, en el agua,
en la superficie de los objetos e incluso sobre nuestra piel.
Para la realización de ciertos trabajos, por ejemplo las manipulaciones asépticas y la
preparación de medicamentos, cosméticos,etc. se debe conocer y controlar la calidad
microbiológica del aire y de las superficies de trabajo, ya que éstos podrían ser fuente de
contaminación para el material con el que estamos trabajando.
La evaluación de la calidad microbiológica del ambiente nos indica la cantidad de
microorganismos que están presentes en un área determinada. Mientras más limpia es un
área, menor será el número de microorganismos presentes en el aire de la misma. Los
microorganismos generalmente no están flotando en el aire sino que se encuentran sobre
partículas inertes, por ejemplo polvo, gotas de agua, etc. que le sirven como medio de
transporte, y pueden encontrarse aislados o agregados. Algunas de estas partículas pueden
depositarse sobre las superficies.
Las personas también son una fuente de contaminación, ya que liberan gran cantidad de
partículas al moverse, toser, estornudar, por exfoliación de la piel, etc. Algunas de estas
partículas llevan microorganismos que podrían contaminar el material con el que estamos
trabajando.
Un alimento puede estar contaminado en su origen o bien puede ser el manipulador quien lo
contamine durante el procesado. La persona que va a manipular un alimento tiene una
abundante carga microbiana en la piel, pero nunca deberán aislarse de ellas bacterias
patógenas. Por lo tanto resulta evidente la necesidad de que el manipulador mantenga una
perfecta condición de higiene durante el procesado de los alimentos.
Cuando se trabaja en Microbiología de los alimentos es importante determinar el grado de
contaminación ambiental, ya que de las condiciones higiénicas del lugar de trabajo (utensilios,
superficies, etc.) y del propio manipulador van a depender en parte el número y tipo de
microorganismos en el alimento.

CONTROL MICROBIOLÓGICO DEL AIRE

Existen distintos métodos para el análisis del aire:
• sedimentación,
• filtración,
• choque en líquidos
• precipitación electrostática, entre otros.
 Durante este trabajo práctico vamos a realizar el primer método (uno de loa más empleados
junto con filtración).
El método de sedimentación en placa de agar, es uno de los más sencillos para la
determinación de microorganismos del aire, que consiste en exponer placas con un medio
nutritivo sólido al ambiente durante un periodo determinado, incubar las placas y hacer el
recuento de las colonias obtenidas.
El tiempo de exposición depende del ambiente a evaluar, mientras mayor sea la contaminación
menor será el tiempo de exposición de las mismas. Normalmente se utilizan placas de 9 cm de
diámetro.
Con este método se detectan los microorganismos que caen sobre la superficie de la placa, lo
cual simula lo que ocurre normalmente cuando estamos trabajando en el laboratorio.
Como las condiciones ambientales influyen en la sedimentación de los microorganismos es
necesario que, cuando se realiza este método, las placas se expongan siempre en el mismo
lugar y bajo las mismas condiciones para poder comparar los resultados obtenidos.
Los resultados obtenidos son orientativos de las cifras de microorganismos presentes en el
aire, ya que estos niveles varían en función de las corrientes de aire y del tamaño de las
partículas en suspensión.

Análisis de esporas de hongos por sedimentación:

1) Destapar las placas con agar Sabureau, en un lugar cuyo nivel de contaminación se
desee examinar, durante diferentes intervalos de tiempo: 0,5, 1 y 1,5 horas.
2) Tapar las placas e incubar durante 5dias horas a 25 ºC.
3) Discutir los resultados en grupo.

PROCEDIMIENTO
Al exponer la superficie de un medio de cultivo al medio ambiente durante un periodo
determinado, los microorganismos que están presentes en él pueden sedimentar sobre el
medio de cultivo dando origen a colonias que se pueden contar.
Materiales:

• Placas de agar Sabureau para recuento en placa.

1. Marcar con el número de su equipo la tapa de la placa con agar nutritivo, de acuerdo a su
número, exponer la placa en el lugar y durante el tiempo señalado en la siguiente tabla:

Tiempo y lugar de exposición de la placa

10 minutos sobre el mesón de trabajo

20 minutos sobre el mesón de trabajo

30 minutos sobre el mesón de trabajo

10 minutos en el pasillo

20 minutos en el pasillo

30 minutos en el pasillo

10 minutos en el baño

20 minutos en el baño
 30 minutos en el baño

10 minutos en el área aséptica

20 minutos en el área aséptica

30 minutos en el área aséptica

2. Incubar la placa a 35 +/- 2_C en posición invertida durante 48 horas.

3. Contar el número de colonias en la placa.
4. Calcular el número de microorganismos que caen por cm2 durante 1 minuto.

CÁLCULO DEL NÚMERO DE MICROORGANISMOS POR CM2

Para calcular la cantidad de microorganismos que cayeron en la placa por unidad de tiempo:
• Contar el número de colonias en la placa. Este número se expresa como ufc (unidades
formadoras de colonias), ya que varios microorganismos podrían estar juntos y al
multiplicarse sólo se verá una colonia.
• Calcular el área de la placa (A).
A = _r2
Para una placa de 9 cm de diámetro el área es
A = 3,14 x 4,52 cm2 = 63,62 cm2
• Calcular el número de microorganismos que caen en el área por unidad de tiempo.

Se puede expresar en: ufc/ placa/ min,

ufc/ cm2/ min o
ufc/ área total/ min.

Ejemplo

Se expone una placa de 9 cm de diámetro en un área durante 30 minutos. Se incuba 24 horas

a 35 +/- 2o C y se cuentan 25 colonias. Calcular el número de ufc/ placa/ min y ufc/ cm2 / min.
25 ufc ---------30 min
X --------- 1 min X = 0,833 ufc/ placa/ min

Si deseamos expresar los valores en ufc/ cm2/ min

0,833ufc -------- 63,62 cm2
X -------- 1 cm2 X =0,0131 ufc/ cm2/ min

Es importante asegurarse al momento de comparar los resultados, que éstos están

expresados en los mismos parámetros.

RESULTADOS
Área evaluada: ____________________________________________________
Tiempo de exposición de las placas: ___________________
Cálculos:

Número de microorganismos por cm2: ______________________________

CONCLUSIONES
Anotar sus conclusiones
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CONTROL MICROBIOLÓGICO DE SUPERFICIES

El control microbiológico de superficie nos proporciona información sobre la cantidad de
microorganismos presentes sobre una superficie, la cual puede ser un equipo, mesón, ropa,
manos del personal, etc.
Existen distintos métodos para el examen microbiológico: método del hisopo, de la placa de
contacto, de la jeringa de agar, de la legüeta (o película pegajosa).

Esta evaluación generalmente se hace utilizando:

• Placas de contacto (RODAC)

Las placas de contacto o RODAC (Replicate Organism Direct Agar Contact) son placas de 55-
2
60 mm de diámetro con una superficie de 25 cm , llenas con medio de cultivo hasta obtener
una superficie convexa, que sobresale del borde de la placa. Estas placas pueden preparase
en el laboratorio o adquirirse comercialmente.
Generalmente se utilizan para determinar la calidad microbiológica de superficies planas.
se presiona sobre la superficie a ensayar

1) Análisis de superficies planas por placas de contacto (RODAC):

Materiales:

ƒ Placas de contacto RODAC (Replicate Organisms Direct Agar Contac) con

agar para recuento en placa.

1) Emplear placas de Petri especiales de 6 cm de diámetro, que llevan el medio de cultivo

(para microorganismos aerobios mesófilos totales). El medio una vez fundido y a
temperatura cercana a la de solidificar (45 º C), se vierte en las placas de manera que
sobresalga del borde de la misma para facilitar el contacto con la superficie a examinar.
2) Para tomar la muestra abrir la placa y presionar suavemente la placa sobre la superficie
elegida, sin deslizarla.
3) Tapar la placa y se incuba bajo las condiciones adecuadas.
4) Incubar las placas durante 24-48 hs. a 37 ºC.
5) Se cuenta el número de colonias y se calcula el número de ufc/área de la placa, la cual
está entre 24 y 30 cm2, dependiendo del diámetro de la misma. El resultado se expresa en
UFC/25 cm2.

Nota: el principal inconveniente de este método es su ineficacia en superficies muy

contaminadas y la posibilidad de no obtener todos los microorganismos presentes en la
superficie. Sin embargo, en los casos en los que la carga microbiana es baja, da buenos
resultados.
Es necesario desinfectar la superficie evaluada luego de tomar la muestra, ya que podrían
quedar restos del medio de cultivo que favorecen el crecimiento de los microorganismos.
RESULTADOS
Área evaluada: ____________________________________________________
Tiempo de exposición de las placas: ___________________
Cálculos:

Número de microorganismos por cm2: ______________________________

CONCLUSIONES
Anotar sus conclusiones
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B. Análisis de superficies no planas: método del hisopo

Se recomienda para tomar muestras de superficies irregulares donde no se pueden utilizar
placas RODAC. Se debe definir el área donde se va a tomar la muestra, generalmente se usa
2
una plantilla con un área entre 24 y 30 cm .
Este sistema es el más antiguo y el más utilizado en el examen microbiológico de superficies,
ya que sirve para el análisis tanto de superficies planas como de no planas.

Materiales:

ƒ Hisopo estéril.
ƒ Tubo con 10 ml de solución salina estéril.
ƒ Papel de aluminio estéril con una abertura central de 9 cm2

1) Delimitar la superficie que se va a analizar mediante una plantilla de papel aluminio estéril
con una abertura de dimensión conocida (9 cm2).
2) Humedecer el hisopo estéril en una solución con 10 ml de solución salina estéril y frotar
varias veces sobre la superficie delimitada con la plantilla, por lo menos dos direcciones
distintas, rotándolo ligeramente.
3) Introducir de nuevo el hisopo en el tubo con solución salina estéril y dejar durante 15-30
minutos de manera que los microorganismos se liberen del algodón al medio líquido.
4) Sembrar 0,1 ml de dicha solución en una placa con agar nutritivo (para microorganismos
aerobio mesófilos totales).
5) Incubar durante 24-48 hs. a 37 ºC.
6) Se calcula el número de ufc/área El recuento se expresa como UFC/ 9 cm2.

RESULTADOS
Área evaluada: ____________________________________________________
Tiempo de exposición de las placas: ___________________
Cálculos:

Número de microorganismos por cm2: ______________________________

CONCLUSIONES
Anotar sus conclusiones
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CONTROL MICROBIOLÓGICO DEL PERSONAL

El objetivo de un análisis a manipuladores es comprobar que la persona que procesa el
alimento no es una fuente de contaminación. Se puede estudiar: manos, uñas y fosas nasales.
Para evaluar al personal se pueden utilizar placas RODAC, las cuales se presionan sobre su
vestimenta. Cuando queremos detectar la presencia de microorganismos en las manos del
personal se pueden usar placas con medio de cultivo (Touch plates), el personal toca el agar
de dichas placas con la punta de los dedos, luego se incuban por el tiempo y bajo las
condiciones adecuadas. Al final del periodo de incubación se cuentan las colonias.

NOTA: El personal debe lavarse y desinfectarse las manos luego de tocar las placas, ya
podrían quedar restos del medio de cultivo en los dedos y favorecer el crecimiento de los
microorganismos.

C. Análisis de manipuladores
Materiales:

• Hisopo estéril
• Placas de agar para recuento en placa.
• Placas de agar manitol sal
• Placas de agar violeta rojo bilis glucosa (VRBG)

1. Sin lavarse las manos, un integrante del grupo, hará una impresión con el dedo pulgar
sobre la superficie de una placa con agar nutritivo.
2. En otra placa con agar nutritivo colocar un cabello.
3. Rozar por las fosas nasales o boca un hisopo, previamente humedecido en solución salina
estéril y sembrar directamente su contenido en una nueva placa con agar nutritivo.
4. Llevar a incubar las placas en estufa a 37 ºC durante 24-48 hs.
5. Observar el crecimiento de colonias.

RESULTADOS
Área evaluada: ____________________________________________________
Tiempo de exposición de las placas: ___________________
Cálculos:

Número de microorganismos por cm2: ______________________________

CONCLUSIONES
Anotar sus conclusiones
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